于德嘉,張國(guó)斌,陳健鑫,徐曉東,李林倩,董萍萍,郭麗紅,楊紅玉

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,昆明 650214;2.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院,昆明 650224;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,昆明 650201;4.曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院,云南 麒麟 655011)

【研究意義】轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors,TFs)又稱為反式作用因子,在植物調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[1],為探究擬南芥IDD基因家族中AtIDD4基因在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆反應(yīng)應(yīng)答中的作用,本研究構(gòu)建了擬南芥AtIDD4基因過量表達(dá)植物?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鋅指蛋白是重要的轉(zhuǎn)錄因子,C2H2型鋅指蛋白廣泛存在,且是鋅指蛋白中研究最廣和最清楚的一類[2]。INDETERMINATE DOMAIN(IDD)家族屬于 C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子其中一類,是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子,不論在單、雙子葉植物中均高度保守。植物中的IDD基因通過與多種蛋白質(zhì)相互作用,與激素級(jí)聯(lián)重疊,控制或調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆反應(yīng)應(yīng)答[3]。ID-domain基因最初是作為玉米中一個(gè)典型的開花基因INDETERMINATE1(ID1)而被報(bào)道[4]。ID1基因編碼1個(gè)包含4個(gè)鋅指單元的核蛋白,具有 C2H2型鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),由靠近 N 端的一個(gè)假定的核定位信號(hào) NSL和4個(gè)鋅指單元(C2H2、C2H2、C3H和C2HC)構(gòu)成ID-domain[5-6]。在植物中通過ID1基因的ID-domain所定義的基因家族成為了 C2H2型鋅指蛋白的一個(gè)亞族,即 IDD 鋅指蛋白家族[7]。擬南芥中有16個(gè)IDD基因家族成員,為AtIDD1-16,AtIDD4基因是其中之一[8]。通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選發(fā)現(xiàn)能與SCL3(Scarecrow-like 3)基因互作的轉(zhuǎn)錄因子有5個(gè)IDD基因家族成員,AtIDD4基因是其中之一[9]。SCL3通過這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié) DELLA 蛋白和赤霉素 (Gibberellin,GA)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]。AtIDD4等IDDs基因通過調(diào)控不對(duì)稱細(xì)胞分裂和細(xì)胞類型的模式化以確保植物根系的正常發(fā)育[11]。研究發(fā)現(xiàn),AtIDD4在絲氨酸73位點(diǎn)磷酸化[12],這是一個(gè)高度保守的MAPK基序,在IDD/BIRD家族的所有家族成員中都是保守的[13],AtIDD4基因的缺失突變體植株轉(zhuǎn)錄組和全序列ChIP-SEQ分析表明,AtIDD4基因缺失突變體植株在先天免疫與生長(zhǎng)發(fā)育的協(xié)調(diào)中起著重要作用,V?lz 等[14-15]研究表明,擬南芥AtIDD4基因的缺失突變體植株顯著增強(qiáng)了對(duì)半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌丁香假單孢菌(Pseudomonassyringae)等病原物的抗性和對(duì)鹽脅迫的抗性。【本研究切入點(diǎn)】目前有關(guān)擬南芥AtIDD4基因超表達(dá)后對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用同源重組技術(shù),旨在構(gòu)建高表達(dá)載體pCAMBLA1300-35S-IDD4CDS,并通過農(nóng)桿菌侵染法導(dǎo)入野生型擬南芥,提高AtIDD4基因在擬南芥中的表達(dá)水平,為探究AtIDD4基因?qū)χ参锏目剐哉{(diào)控提供供試材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生型擬南芥(WT)(Arabidopsisthaliana)為Columbia生態(tài)型(Col-0),購(gòu)自美國(guó) Lehle seeds 公司[16]。農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101 購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司,大腸桿菌(Escherichiacoli)為DH5α,購(gòu)自TaKaRa公司,限制性內(nèi)切酶為BamHI和PstI,購(gòu)自ThermoFisher SCIENTIFIC公司。試驗(yàn)中所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 擬南芥培養(yǎng)條件

先用無(wú)菌水將擬南芥種子充分漂洗,再用消毒水[v(75%乙醇)∶v(30%H2O2)=4∶1]消毒30 s,無(wú)菌水漂洗3次后分散播種于MS培養(yǎng)基中,置于4 ℃冰箱中春化處理48 h。將處理后的種子放至光照培養(yǎng)箱(光周期為光照和黑暗各12 h/d,光照強(qiáng)度2000～3000 lx,溫度 22 ℃,相對(duì)濕度40%～60%)培養(yǎng)[17]。待長(zhǎng)出2片真葉后將幼苗移栽到溫室調(diào)配的基質(zhì)[v(營(yíng)養(yǎng)土)∶v(珍珠巖)∶v(蛭石)=6∶6∶1]中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 載體構(gòu)建

1.3.1 擬南芥總 RNA 和 DNA 的提取 Trizol 法提取擬南芥總RNA,之后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其結(jié)構(gòu)完整性,并通過Biodrop測(cè)定其濃度和純度;將檢測(cè)合格的 RNA 樣品用液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存[18]。擬南芥總DNA采用CTAB法提取。測(cè)定樣品的濃度和純度,檢測(cè)合格的 DNA 樣品置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 提取擬南芥葉片RNA,以RNA為模板用abm公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。首先在冰上預(yù)冷 200 μL的微量離心管,隨后在管內(nèi)依次加入AccuRT Reaction Mix 2 μL和Total RNA 1 μg,用Nuclease-free H2O補(bǔ)足8 μL并置于PCR 儀內(nèi),42 ℃反應(yīng)2 min,后置于冰上;加入AccuRT Reaction Stopper 2 μL;在預(yù)冷的微量離心管內(nèi)配置反轉(zhuǎn)錄體系10 μL,包括5×All-In-One RT MasterMix 4 μL、Nuclease-free H2O 6 μL,配制完成后加入上述已去除基因組DNA的體系中并混勻;置于PCR儀內(nèi),25 ℃反應(yīng)10 min,42 ℃反應(yīng)15 min,85 ℃反應(yīng)5 min,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3AtIDD4基因CDS的克隆 通過TAIR (https://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)查找出AtIDD4基因的CDS序列,結(jié)合載體構(gòu)建原則運(yùn)用軟件Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物,IDD4-F:5’-CGGGATCCATGTCGTCATCATCATATAACACA-3’、IDD4-R:5’-TGCACTGCAGTCAACCTCTTCCAAATGGATAA-3’;下劃線部分分別為XohI和PstI酶切位點(diǎn)。通過PCR法利用特異性引物以cDNA為模板擴(kuò)增出CDS片段,并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行目的片段檢測(cè),將正確條帶片段切膠回收。

1.3.4 目的片段與載體連接 限制性內(nèi)切酶將載體pCAMLA1300酶切后得到線性化質(zhì)粒,使用天根純化試劑盒進(jìn)行純化后置于-20 ℃?zhèn)溆?將回收純化后的DNA目的片段通過酶切位點(diǎn)連接至帶有35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pCAMBLA1300載體上,4 ℃過夜。之后通過熱激法將載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli) DH5α感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增,在配制LB固體培養(yǎng)基時(shí)加入卡那霉素(Kanamycin),在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,在平板上挑取陽(yáng)性單菌落至LB/Kan+液體培養(yǎng)基中搖床過夜培養(yǎng)(250 r/min 37 ℃)對(duì)檢驗(yàn)正確的單菌落擴(kuò)繁,之后進(jìn)行菌液PCR鑒定,1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè),以及質(zhì)粒提取及測(cè)序,獲得高表達(dá)載體pCAMBLA1300-IDD4CDS,見圖1。將鑒定成功的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒于-20 ℃保存。

圖1 pCAMBLA1300-IDD4CDS 載體圖譜Fig.1 pCAMBLA1300-IDD4CDS vector map

1.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 GV3101從-80 ℃冰箱取出,在冰上解凍完成后加入測(cè)序正確的重組質(zhì)粒3～5 μL,冰上靜置5 min。將離心管液氮速凍1 min,37 ℃水浴5 min,冰浴2 min,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。加入液體 LB 培養(yǎng)基800 μL,28 ℃ 搖床150 r/min 培養(yǎng)3 h,8000 r/min離心1 min,將棄上清液的懸浮液涂于含卡那霉素和利福平(Rifampicin)的LB固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h。PCR鑒定能夠生長(zhǎng)的單菌落,并將成功轉(zhuǎn)入高表達(dá)載體的農(nóng)桿菌于含卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)(250 r/min 28 ℃過夜)進(jìn)行擴(kuò)繁備用。

1.5 擬南芥轉(zhuǎn)化及篩選

為促進(jìn)擬南芥?zhèn)戎﹂L(zhǎng)出更多花枝,在移栽后25～30 d時(shí)將初次開花的擬南芥花蕾去除。選取擬南芥花序未成熟的植株,利用5%蔗糖溶液使農(nóng)桿菌重懸并調(diào)整OD值為0.8,加入表面活性劑 silwet-77 至濃度為 0.05%。擬南芥花浸泡于農(nóng)桿菌懸浮液中 20～30 s[19],侵染后的植株套袋橫放培養(yǎng),保持環(huán)境高度濕潤(rùn)的條件下避光培養(yǎng) 18～24 h,之后正常光照培養(yǎng)。待種子自然成熟后收集種子。

通過含有50 mg/L潮霉素(Hygromycin)的1/2 MS培養(yǎng)基篩選浸染后得到的T0代種子,能夠在抗性培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的為成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的種子。培養(yǎng)20 d后轉(zhuǎn)入土壤繼續(xù)培養(yǎng),單株收種。

1.6 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的鑒定

以擬南芥野生型植株為對(duì)照,利用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 測(cè)定擬南芥轉(zhuǎn)基因植株AtIDD4基因的表達(dá)量。分別以擬南芥野生型和擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的cDNA為模板,擴(kuò)增擬南芥內(nèi)參Actin基因和擬南芥AtIDD4基因。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)按照 Blastaq 2×qPCR MasterMix 試劑盒操作步驟要求進(jìn)行,在 ABI 7500型Real-time PCR 儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。擬南芥內(nèi)參Actin基因引物:actin-F:5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’;actin-R:5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.7 表型觀察

將篩選鑒定出的T3代種子和野生型種子在MS培養(yǎng)基上同時(shí)點(diǎn)種,并移入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待長(zhǎng)出2片真葉后(生長(zhǎng)10 d)將幼苗移栽到栽培土中,移入溫室培養(yǎng)14 d后觀察測(cè)量幼苗的生長(zhǎng)狀況[20],以10棵幼苗作為1組稱量鮮重并進(jìn)行5次重復(fù),同時(shí)測(cè)量根系長(zhǎng)度后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。生長(zhǎng)25 d后觀察比較轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtIDD4基因的克隆

以野生型擬南芥(WT)的cDNA為模板,利用特異性引物通過PCR法擴(kuò)增擬南芥AtIDD4基因的CDS片段。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約為1500 bp(圖2),與預(yù)期片段的長(zhǎng)度一致。

2.2 載體構(gòu)建及陽(yáng)性克隆檢測(cè)

大腸桿菌菌液PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果(圖3)顯示,1～2、4～7、9～10及12～14號(hào)單菌落PCR條帶清晰且大小約1000 bp,與預(yù)期相符,說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。挑選條帶清晰的單菌落繼續(xù)擴(kuò)繁、質(zhì)粒提取及測(cè)序,并進(jìn)行序列比對(duì)。如圖4所示,測(cè)序序列與網(wǎng)站序列完全一致,證明pCAMBLA1300-35S-IDD4CDS表達(dá)載體構(gòu)建成功,該基因克隆成功。

2.3 農(nóng)桿菌陽(yáng)性克隆

上述測(cè)試正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中,驗(yàn)證正確的農(nóng)桿菌擴(kuò)繁后取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示與預(yù)期相符,得到成功轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。

2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化植株篩選與鑒定

利用農(nóng)桿菌侵花法,將驗(yàn)證正確的含有目的片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型(WT)植株中,在含有潮霉素(Hygromycin, Hyg)的 MS 培養(yǎng)基上將收取的T0代種子點(diǎn)種進(jìn)行潮霉素抗性篩選,在培養(yǎng)約2周后,挑選能夠在潮霉素板上正常生長(zhǎng)的陽(yáng)性植株。轉(zhuǎn)基因成功的幼苗可以在抗性培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),而非轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制,一般在萌發(fā)10 d后死亡。將陽(yáng)性植株移至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng),成熟后收取T1代種子,將T1代種子再次播種于潮霉素板中,待植株稍長(zhǎng)大后進(jìn)行PCR鑒定,陽(yáng)性植株移栽至營(yíng)養(yǎng)土中單株收取T2代種子(圖5)。

M: DNA標(biāo)記; 1: AtIDD4 CDS。M:DNA Marker; 1:AtIDD4 CDS.

M: DNA標(biāo)記;1～14: pCAMBLA1300-35S-IDD4CDS。M: DNA Marker;1-14: pCAMBLA1300-35S-IDD4CDS.

pCAMBIA-1300-35S: AtIDD4陽(yáng)性克隆測(cè)序序列; Sbjct: AtIDD4的CDS序列。The sequence of positive clon pCAMBIA-1300-35S: AtIDD4; Sbjct: The sequence of AtIDD4 CDS.

2.5 轉(zhuǎn)基因植株中 AtIDD4 基因的表達(dá)量檢測(cè)

以擬南芥野生型(WT)植株為對(duì)照,用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)T3代轉(zhuǎn)基因植株中擬南芥AtIDD4基因的表達(dá)量,內(nèi)參基因選取擬南芥Actin基因。相較擬南芥野生型植株轉(zhuǎn)基因植株2個(gè)株系A(chǔ)tIDD4基因的表達(dá)量顯著提高,熒光定量RT-PCR顯示轉(zhuǎn)基因植株中AtIDD4基因的表達(dá)量約為擬南芥野生型植株的2倍,與半定量RT-PCR的結(jié)果相符。說明得到了擬南芥AtIDD4高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株,并將這些植株命名為AtIDD4-OE(Over-expression)(圖6)。

箭頭: 平板上長(zhǎng)出的幼苗為轉(zhuǎn)基因成功的植株。Arrow: Seedlings grown on the plate are transgenic plants.

2.6 轉(zhuǎn)基因植株表型觀察

為研究擬南芥AtIDD4基因過表達(dá)植株生長(zhǎng)狀況,觀察統(tǒng)計(jì)了在 MS 培養(yǎng)基中垂直培養(yǎng) 14 d 的擬南芥AtIDD4基因過表達(dá)植株與擬南芥野生型(WT)植株幼苗的生長(zhǎng)情況。發(fā)現(xiàn)兩者平均根系長(zhǎng)度分別為3和5 cm,擬南芥AtIDD4基因過表達(dá)植株根系長(zhǎng)度明顯短于擬南芥野生型(WT)植株。而兩者的平均幼苗鮮重分別為0.15 和0.29 g,擬南芥AtIDD4基因過表達(dá)植株幼苗鮮重顯著低于擬南芥野生型(WT)植株鮮重(圖7)。通過觀察在土壤中生長(zhǎng)14 d的幼苗生長(zhǎng)情況,從圖8可見,擬南芥AtIDD4基因過表達(dá)植株較野生型(WT)植株整體生長(zhǎng)狀態(tài)較弱、幼苗矮小、蓮座葉面積較小。

A:半定量RT-PCR;B:熒光定量RT-PCR;WT: 野生型; IDD4-OE-1、IDD4-OE-2、IDD4-OE-3、IDD4-OE-4代表各株系;*表示 P<0.05。A: Semi-quantitative RT-PCR; B: Fluorescence quantitative RT-PCR;WT: Wild type;IDD4-OE-1,IDD4-OE-2,IDD4-OE-3 and IDD4-OE-4 represent each strain;*means P<0.05.

A:IDD4-OE和WT; B:過表達(dá)植株與野生型植株幼苗根系長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;C:過表達(dá)植株與野生型植株幼苗鮮重的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;****表示 P<0.05;標(biāo)尺: 1 cm。A: IDD4 overexpression and wild type; B: Statistical analysis of root length in seedling of overexpressed and wild-type plants; C: Statistical analysis of fresh weight in seedling of overexpressed and wild-type plants;****means P<0.05; Ruler: 1 cm.

A:WT;B:IDD4-OE。

3 討 論

隨著反向遺傳學(xué)研究的深入,應(yīng)用不同方法使基因超量表達(dá)或?qū)⒒虮磉_(dá)量降低或敲除使基因不表達(dá)來(lái)觀察表型的變化已成為研究基因功能的一種重要手段[20]。過量表達(dá)植株的鑒定主要利用cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,因其程序繁瑣和操作具有一定難度,在大量篩選中不具有快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)[21]。鑒于“三引物”法在T-DNA插入突變體的純合性及插入位點(diǎn)鑒定中的重要作用[22-23],可將其用于過表達(dá)植株的鑒定,基于重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)3個(gè)引物并兩兩配對(duì)過表達(dá)植株進(jìn)行鑒定,第1對(duì)引物為35S啟動(dòng)子左邊界與AtIDD4基因右邊界進(jìn)行配對(duì),第2對(duì)引物為AtIDD4基因左右邊界配對(duì),進(jìn)行快速鑒定。需要注意的是,在利用“三引物法”快速鑒定過表達(dá)植株時(shí),回復(fù)突變和基因修復(fù)往往容易被忽略。

IDD家族是高等植物中高度保守的一類轉(zhuǎn)錄因子,IDD家族中的大多數(shù)成員已被廣泛證實(shí)能調(diào)控GA和IAA等植物激素的合成與轉(zhuǎn)導(dǎo),共同調(diào)控植物的生長(zhǎng)與形態(tài)建成[24]。Cui 等[25]研究了擬南芥AtIDD14、AtIDD15和AtIDD16基因協(xié)同調(diào)控生長(zhǎng)素的生物合成和運(yùn)輸,通過直接靶向作用于YUC5、TAA1和PIN1基因調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的空間積累從而促進(jìn)生長(zhǎng)素的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而控制植物器官形態(tài)發(fā)生和向地力反應(yīng),因此推斷AtIDD4基因過表達(dá)后將通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控植物生長(zhǎng)激素種類和含量進(jìn)而影響植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。本研究構(gòu)建的AtIDD4基因過表達(dá)植株,通過生長(zhǎng)表型觀察,發(fā)現(xiàn)擬南芥AtIDD4基因過量表達(dá)后,擬南芥幼苗根系長(zhǎng)度顯著降低,且生長(zhǎng)勢(shì)顯著低于野生型植株,揭示了AtIDD4基因在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。既往研究證實(shí),IDD4受KAN和REV的轉(zhuǎn)錄抑制[3],本研究中AtIDD4基因過表達(dá)株系在葉片形成和葉片大小方面受到損害,與HD-ZIPIII基因被抑制產(chǎn)生的形態(tài)相似[25],AtIDD4基因可能參與了上述3個(gè)因子的負(fù)反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。近年來(lái),植物激素在植物免疫中的重要作用被大量研究所證實(shí),擬南芥IDD家族成員2、3、4、5、9和10作為轉(zhuǎn)錄支架,使DELLA/RGA反式激活,調(diào)節(jié)GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3]。GA、SA和JA互作網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控和平衡植物的生長(zhǎng)與免疫進(jìn)程,AtIDD4基因是否參與植物信號(hào)激素轉(zhuǎn)導(dǎo)是今后研究的重要切入點(diǎn)。因此,本研究構(gòu)建的AtIDD4基因過表達(dá)植株為后續(xù)探究AtIDD4基因協(xié)調(diào)植物防御等其他生物學(xué)功能提供了重要的材料。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了擬南芥AtIDD4基因過量表達(dá)植物AtIDD4-OE,植株中AtIDD4基因的表達(dá)量顯著提高。表型觀察結(jié)果表明,AtIDD4-OE幼苗根長(zhǎng)和幼苗鮮重等指標(biāo)顯著低于擬南芥野生型(WT)植株;土壤中生長(zhǎng)14 d的擬南芥AtIDD4基因過表達(dá)植株與擬南芥野生型(WT)植株比較,植株矮小,蓮座葉面積較小,表明擬南芥AtIDD4基因過量表達(dá)會(huì)抑制擬南芥的生長(zhǎng),其在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育過程中以負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用。