陳俊其，秦華珍△，尹 優(yōu)，何瑞坤，黃煥迪，戴慶玲，鐘 貴，王 晨，黃燕瓊

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530000

胃潰瘍寒證屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“胃脘痛”范疇［1］。胃潰瘍寒證成因主要為寒邪犯胃，阻滯氣機(jī)，致胃脘部疼痛，胃氣失和，胃部遇冷或受涼之后胃痛加重，遇暖則舒緩。我國(guó)古代醫(yī)書便已有對(duì)胃潰瘍寒證的描述，《景岳全書》載有：“胃疼者食滯、寒滯、氣滯者最多，且食、寒可致氣不順”，《沈氏尊生書·胃痛》中亦有記載：“胃痛，邪干胃脘病也?！北砻魑覈?guó)古代醫(yī)學(xué)家認(rèn)為寒邪犯胃，寒滯于胃，是胃潰瘍寒證形成的主要原因，食生冷苦寒之品，或者因氣溫急劇變化，往往是寒邪客胃，形成胃潰瘍寒證的直接因素。

高良姜、大高良姜、紅豆蔻3味中藥同屬于山姜屬中藥，在我國(guó)擁有悠久的用藥歷史，3味山姜屬中藥都具有溫中散寒、溫胃止痛等功效。本課題前期研究表明，山姜屬中藥對(duì)胃潰瘍寒證具有藥效［2］。文獻(xiàn)研究表明，黃酮類成分為山姜屬中藥活性成分之一［3-4］。本文通過制備3味山姜屬黃酮類成分，以大鼠復(fù)制胃潰瘍寒證模型，測(cè)量大鼠胃液量、胃酸pH值、胃蛋白酶活力及胃組織中胃動(dòng)素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，GAS）、生長(zhǎng)抑制素（somatostatin，SS）及H+-K+-ATP酶活力，探討3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃消化液的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑高良姜、大高良姜、紅豆蔻（安國(guó)市冷背藥材有限公司，批號(hào)：20181018，產(chǎn)地：廣西）；干姜提取物（西安寶益豐生物科技有限公司，批號(hào)：20190912）；95%乙醇，鹽酸，冰乙酸（西隴化工股份有限公司，批號(hào)：20190316、20190507、20190507）；氫氧化鈉（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10492126）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物90只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度：18±4℃，RH 50%±10，潔凈級(jí)別：CV。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物制備

1.3.1.1 造模藥物 冰知母水制備：取知母8 kg，加10倍量的純水浸泡1 h，煮沸后保持微沸1 h，過濾，再加8倍量水煎40 min，過濾，合并2次濾液，加熱濃縮至0.5 g/mL生藥濃度，靜置冷卻，分裝保存于4 ℃冰箱備用。冰乙酸溶液制備：取一定量的99.5%冰乙酸，加純水稀釋成15%冰乙酸溶液。

1.3.1.2 受試藥物制備 取適量高良姜、大高良姜、紅豆蔻中藥飲片分別粉碎成粗粉，依次加入40倍量95%、60%乙醇，每次回流提取4 h，過濾，合并所得的濾液，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味。將粗提物加適量的水混勻，煮沸，加入1 moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10～11，煮沸1 h，過濾，重復(fù)2次，合并濾液，濾液加入1 moL/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1～2，水浴保溫30 min，放置24 h，析出沉淀，離心，棄去上清液，沉淀用蒸餾水抽洗2～3次，40 ℃真空干燥，得到3味山姜屬中藥黃酮提取物，備用，用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成相應(yīng)濃度。

1.3.1.3 陽(yáng)性藥物制備 以0.5%羧甲基纖維素鈉將干姜姜辣素配置成相應(yīng)濃度，備用。

1.3.2 藥效實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 分組與造模 取90只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)抽取10只大鼠為空白組，其余大鼠進(jìn)行胃潰瘍寒證造模，每天早上灌服冰知母水（劑量10.44 g/kg，生藥量0.5 g/mL，給藥量2 mL/100g，溫度4 ℃），下午灌服15%冰乙酸水溶液1 mL，每天1次，連續(xù)4天。末次造模結(jié)束后隨機(jī)分為模型組，干姜姜辣素組，高良姜高、低劑量組，大高良姜高、低劑量組，紅豆蔻高、低劑量組，共9組。

1.3.2.2 給藥方法 造模結(jié)束后第2天開始給藥，空白組和模型組灌服0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液，陽(yáng)性組灌服干姜提取物水溶液，受試藥物高、低劑量組分別灌服相應(yīng)樣品，根據(jù)前期研究［5］，以黃酮得率為基礎(chǔ)（高良姜黃酮得率為124.1 g/kg、高良姜黃酮得率為98.1 g/kg、紅豆蔻黃酮得率為118.5 g/kg），給藥劑量為臨床用量的4倍與16倍，給藥體積均為1 mL/100g，每隔12 h給藥1次，共給藥4次。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠胃液量、胃酸pH、胃蛋白酶胃液量測(cè)定：末次給藥后，禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛麻醉大鼠，剖開大鼠腹部，于賁門處用細(xì)線結(jié)扎，剪下全胃，傾出胃溶物于刻度容量管中，記錄刻度值。胃液總酸度測(cè)定：將收集的胃液于離心半徑：80 cm，1500 r/min離心15 min，取上清液1 mL，滴加1%酚酞指示劑3滴，0.1 moL/L的NaOH溶液滴定，至溶液轉(zhuǎn)為紅色并且2 s內(nèi)不變色消失為終點(diǎn)，記錄用去的NaOH溶液量，求出胃液總酸度。胃蛋白酶活力測(cè)定：取離心后上清胃液，采用ELISA試劑盒方法操作測(cè)定胃蛋白酶活力。

1.4.2 大鼠胃組織MTL、GAS、SS含量及H+-K+-ATP酶活力測(cè)定處死大鼠，沿腹腔剪開，剝離胃，沿胃大彎剪開，用生理鹽水清洗去除食物殘?jiān)羧∥笣儾≡罴爸車M織約1 g，加入冰生理鹽水，制備10%組織勻漿，離心半徑：80 cm，3000 r/min離心15 min，分取上清液，備用。參考試劑盒方法測(cè)定大鼠胃組織MTL、GAS、SS含量及H+-K+-ATP酶活力。

1.4.3 大鼠全身機(jī)能指標(biāo)測(cè)定造模及給藥期間，采用電子天平對(duì)大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量進(jìn)行稱量統(tǒng)計(jì)，采用量筒測(cè)量統(tǒng)計(jì)各組大鼠飲水量，采用電子體溫計(jì)測(cè)定大鼠肛溫，記錄。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃液量、胃酸pH、胃蛋白酶與空白組比較，模型組大鼠胃液量、胃蛋白酶活力顯著增加（P＜0.01），胃酸pH值顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，干姜姜辣素組，高良姜、大高良姜高低劑量組，紅豆蔻高劑量組大鼠胃液量顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），pH顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）；干姜姜辣素組，高良姜、大高良姜、紅豆蔻高劑量組大鼠胃蛋白酶活力顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。同劑量組間比較，高良姜與紅豆蔻高劑量組胃酸pH有差異（P＜0.05），其他各組間胃液、胃酸pH值及胃蛋白酶活力均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠胃液量、胃酸pH及胃蛋白酶比較（±s）

表1 各組大鼠胃液量、胃酸pH及胃蛋白酶比較（±s）

注：與空白組比較，??表示P＜0.01；與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01（下同）

2.2 胃組織GAS、MTL、SS含量與空白組比較，模型組大鼠胃組織GAS、MTL含量顯著增加（P＜0.01），SS含量顯著減少（P＜0.01）。與模型組大鼠比較，干姜姜辣素組，高良姜高、低劑量組，大高良姜、紅豆蔻高劑量組大鼠胃胃組織GAS含量，胃組織MTL含量顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），SS含量顯著增加（P＜0.01或P＜0.05）。各給藥同劑量組間比較，高良姜與大高良姜、紅豆蔻高低劑量組間GAS含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各給藥組間MLT含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；紅豆蔻高劑量組與高良姜、大高良姜高劑量組間SS含量有差異（P＜0.01）；高良姜低劑量組與大高良姜、紅豆蔻低劑量組間SS含量有差異（P＜0.01）。見表2。

2.3 胃組織H+-K+-ATP酶活力與空白組大鼠比較，模型組大鼠胃組織H+-K+-ATP酶活力顯著升高（P＜0.01），與模型組大鼠比較，干姜姜辣素組，高良姜高、低劑量組，大高良姜、紅豆蔻高劑量組大鼠胃組織H+-K+-ATP酶活力顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。各給藥同劑量組間比較，高良姜高劑量組與紅豆蔻、大高良姜低劑量組間間H+-K+-ATP酶活力有差異（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠胃組織GAS、MTL、SS含量及胃組織H+-K+-ATP酶活力比較（±s）

表2 各組大鼠胃組織GAS、MTL、SS含量及胃組織H+-K+-ATP酶活力比較（±s）

2.4 大鼠一般情況與空白組大鼠比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著減輕，日均進(jìn)食量、飲水量顯著減少（P＜0.01）。與模型組大鼠比較，干姜姜辣素組，高良姜、大高良姜高劑量組大鼠體質(zhì)量、飲水量顯著增加顯著增加（P＜0.05）；干姜姜辣素組、大高良姜高劑量組、紅豆蔻高低劑量組進(jìn)食量顯著增加（P＜0.01或P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠體質(zhì)量變化、進(jìn)食量、飲水量及肛溫的影響（±s）

表3 各組大鼠體質(zhì)量變化、進(jìn)食量、飲水量及肛溫的影響（±s）

3 討論

胃液的分泌是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用下，多種神經(jīng)、體液與壁細(xì)胞參與的復(fù)雜過程。在胃潰瘍形成的過程中，由于胃組織受損，對(duì)食物的消化能力降低，食物長(zhǎng)時(shí)間潴留胃腔，對(duì)胃組織的刺激作用加強(qiáng)，胃液大量分泌，胃內(nèi)離子濃度失衡，其負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用無法正常進(jìn)行，導(dǎo)致胃液不斷分泌，造成胃部疼痛、食欲降低、胃部脹氣等多種臨床表現(xiàn)［6］。胃酸與胃蛋白酶是胃液的主要構(gòu)成之一。胃酸具有調(diào)節(jié)胃腔酸堿度的功能。胃蛋白酶是由胃黏膜主細(xì)胞分泌的對(duì)食物進(jìn)行消化的主要消化性蛋白酶，胃酸為胃蛋白酶活性提供了良好的酸性環(huán)境。研究表明，胃酸和胃蛋白酶在發(fā)揮消化食物作用的同時(shí)，也是胃潰瘍的主要攻擊因子之一。胃蛋白酶具有降解蛋白質(zhì)分子的作用，能對(duì)胃黏膜上蛋白質(zhì)分子進(jìn)行降解，使胃黏膜受損。胃酸的大量分泌超過胃黏膜屏障的耐受程度，胃黏膜屏障被破壞，胃酸直接灼燒胃壁細(xì)胞，造成組織損傷，形成瘡面，有學(xué)者認(rèn)為胃酸-胃蛋白酶的自身消化作用是胃潰瘍形成的最終因素。

本研究結(jié)果表明，在給藥治療后，3味山姜屬中藥高劑量組及高良姜、大高良姜低劑量組胃液量顯著減少，胃酸pH顯著升高。表明3味山姜屬中藥能夠抑制胃酸分泌，提高胃酸堿度，改善胃內(nèi)酸環(huán)境，同時(shí)降低胃蛋白酶的釋放，減少胃蛋白酶活力，降低胃酸與胃蛋白酶的自消化作用，減少胃酸與胃蛋白酶對(duì)胃黏膜的攻擊作用，促進(jìn)胃黏膜愈合，減少食物對(duì)胃潰瘍寒證大鼠機(jī)體的刺激性，減少胃液釋放，改善大鼠消化功能。

胃腸激素是一類具有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)消化液分泌的功能性多肽，主要與消化腺的分泌及消化道的運(yùn)動(dòng)有關(guān)。GAS又被稱為促胃液素，其功能主要為促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞增殖，使胃及十二指腸黏膜肥厚，刺激胃壁細(xì)胞產(chǎn)生胃酸，并促進(jìn)胃蛋白酶釋放。GAS的異常分泌是造成胃潰瘍的重要因素之一［7］。MTL是由Mo細(xì)胞分泌的一種22個(gè)氨基酸的直鏈多肽，主要分布于胃竇、十二指腸及小腸下段。MTL的分泌作用于胃腸平滑肌受體，增強(qiáng)胃腸平滑肌收縮，加速胃排空，刺激胃體小胃運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)胃蛋白酶分泌。研究表明，MTL釋放對(duì)胃腸疾病有雙向調(diào)節(jié)作用，適量的MTL釋放能夠促進(jìn)胃腸道排空，加速食道消化，減少食物潴留，對(duì)治療消化性疾病具有積極意義，而過量的MTL釋放則使胃腸平滑肌收縮增強(qiáng)，胃蛋白酶分泌過量，產(chǎn)生胃黏膜血管緊張性收縮，胃血流量減少，胃黏膜細(xì)胞供血不足死亡，胃蛋白酶侵蝕胃黏膜細(xì)胞，形成潰瘍性疾病。SS是一類由116個(gè)氨基酸大分子裂解形成的多肽，由胃竇、胃底及小腸黏膜內(nèi)的D細(xì)胞所釋放，SS在消化道中以胃竇和胃體中含量最高，具有抑制各種胃腸激素的分泌，抑制胃酸、胃蛋白酶等消化液、消化酶的分泌，降低胃腸運(yùn)動(dòng)等作用。

在胃潰瘍形成的過程中，SS分泌降低，對(duì)胃腸激素GAS與MTL的抑制作用降低；GAS大量釋放，促使胃壁細(xì)胞分泌胃酸；胃黏膜細(xì)胞產(chǎn)生胃蛋白酶；MTL大量釋放，刺激胃腸運(yùn)動(dòng)加劇，胃腸平滑肌收縮增強(qiáng)，胃黏膜供血不足，導(dǎo)致胃黏膜屏障損傷，引發(fā)潰瘍或減緩胃潰瘍的愈合。

本研究結(jié)果表明，胃潰瘍寒證模型組大鼠胃組織GAS、MTL含量顯著增加，SS含量顯著降低。表明在胃潰瘍形成過程中，SS分泌受到抑制，對(duì)GAS和MTL的抑制作用降低，GAS和MTL的激動(dòng)作用促使胃酸、胃蛋白酶分泌增多，胃組織活動(dòng)增加，胃黏膜受到胃酸及胃蛋白酶的攻擊，形成潰瘍或加劇潰瘍產(chǎn)生。在給藥治療后，3味山姜屬中藥黃酮類成分高劑量組及高良姜黃酮類成分低劑量組胃組織GAS含量顯著減少，3味山姜屬黃酮類成分高劑量組及高良姜黃酮類成分低劑量組大鼠胃組織MTL活力顯著降低，表明3味山姜屬中藥黃酮類成分具有提高SS分泌，抑制GAS、MTL分泌的作用，它們通過平衡胃腸激素的含量，降低胃酸、胃蛋白酶的分泌，減少胃腸道活動(dòng)，減少胃酸、胃蛋白酶對(duì)胃黏膜組織的攻擊作用，促進(jìn)潰瘍面愈合。

H+-K+-ATP酶是一種鑲嵌于膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⑽葛つぜ?xì)胞內(nèi)合成的H+逆濃度差轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，維持胃腔環(huán)境保持酸化，保持胃黏膜細(xì)胞內(nèi)離子平衡。H+-K+-ATP酶與胃酸的形成直接相關(guān)，是壁細(xì)胞分泌胃酸的最后一個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵酶，H+由H+-K+-ATP酶主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入小管腔，與Cl-形成鹽酸，再由胃壁細(xì)胞分泌至胃腔內(nèi)，使胃腔形成酸環(huán)境，促進(jìn)胃蛋白酶分泌并激活胃蛋白酶對(duì)食物對(duì)進(jìn)行消化［8］。質(zhì)子泵抑制劑是能夠特異性干擾胃壁細(xì)胞的H+-K+-ATP酶活力的藥物，能夠通過血液運(yùn)輸，在胃壁細(xì)胞內(nèi)與H+-K+-ATP酶共價(jià)結(jié)合，形成不可逆的分子性失活，是目前發(fā)現(xiàn)的抑制胃酸分泌作用最強(qiáng)并且最持久的一類藥物。臨床上常見的質(zhì)子泵抑制劑有奧美拉唑、蘭索拉唑等，這些藥物對(duì)胃潰瘍、胃壁泌酸等具有抑制作用［9］。多名學(xué)者臨床觀察表明通過中藥聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑的治療方法，能夠起到促進(jìn)胃潰瘍愈合，同時(shí)降低西藥質(zhì)子泵抑制劑所產(chǎn)生的副作用，減少潰瘍復(fù)發(fā)的作用［10］。

本研究結(jié)果表明，胃潰瘍寒證模型組大鼠胃組織H+-K+-ATP酶活力顯著增加，表明胃潰瘍寒證大鼠胃壁細(xì)胞增殖、活動(dòng)性增強(qiáng)，大量H+離子分泌進(jìn)入胃腔內(nèi)部，與Cl-形成胃酸并使胃內(nèi)酸環(huán)境增強(qiáng)，胃黏膜屏障被破壞，產(chǎn)生胃潰瘍。給藥治療后，3味山姜屬中藥黃酮類成分高劑量組及高良姜黃酮類成分低劑量組大鼠胃組織H+-K+-ATP酶活力顯著提升，表明3味山姜屬中藥黃酮類成分具有H+-K+-ATP酶活力抑制作用，降低H+向胃內(nèi)腔排放，減少胃酸分泌，降低胃酸對(duì)胃黏膜屏障的攻擊作用，促使?jié)兠嬗稀?/p>