陸春菊?梁莉芬?傅春青?張耿思?李海艷?周冬梅?高程海?劉永宏?徐新亞

摘要：目的 研究表伊快霉素（5'-epiequisetin）對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）毒力因子和生物被膜的抑制作用。方法 微量肉湯稀釋法測定表伊快霉素對MRSA的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），繪制時間-抑菌曲線評估其持續(xù)抑菌效果；研究亞抑制濃度（sub-minimum inhibitory concentration， sub-MIC）的表伊快霉素對MRSA毒力因子溶血素、菌黃素和脂肪酶的影響。結(jié)晶紫染色法與光學(xué)顯微鏡觀察評價表伊快霉素對MRSA生物被膜的作用；研究亞抑制濃度的表伊快霉素對MRSA運動性、胞外多糖產(chǎn)生的影響，通過掃描電鏡觀察其對MRSA細(xì)菌形態(tài)的影響。結(jié)果 表伊快霉素抑制MRSA的MIC為16 μg/mL。在sub-MIC濃度下，表伊快霉素可抑制MRSA毒力因子溶血酶、菌黃素、脂肪酶的產(chǎn)生；表伊快霉素對MRSA生物被膜形成有抑制作用，并可抑制胞外多糖的產(chǎn)生和MRSA的滑行運動；掃描電鏡觀察顯示表伊快霉素可使MRSA排列疏松，菌體皺縮。結(jié)論 表伊快霉素能夠顯著抑制MRSA毒力因子和生物被膜形成，能夠減少MRSA的致病性和耐藥性，可作為抗MRSA藥物研究的先導(dǎo)化合物。

關(guān)鍵詞：表伊快霉素；MRSA；毒力因子；生物被膜

中圖分類號：R981.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effect of 5'-epiequisetin on virulence and biofilm of methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Lu Chunju， Liang Lifen， Fu Chunqing， Zhang Gengsi， Li Haiyan，

Zhou Dongmei， Gao Chenghai， Liu Yonghong， and Xu Xinya

（Institute of Marine Drugs/Guangxi Key Laboratory of Marine Drugs， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200）

Abstract Objective Investigation of the inhibition effect of 5'-epiequisetin against virulence and biofilm formation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA）. Methods The microbroth dilution method was used to determine the MIC of MRSA. The effects of sub-MIC of 5'-epiequisetin against biofilm formation， and MRSA virulence factors including hemolysin， staphyloxanthin， and lipase production were explored. The exopolysaccharide production and motility of MRSA were also evaluated. The process of biofilm formation was observed by optical microscope and scanning electron microscopy. Results The MIC of 5'-epiequisetin was 16 μg/mL. 5'-epiequisetin suppressed the production of virulence factors hemolysin， staphyloxanthin and lipase. In addition， 5'-epiequisetin inhibited MRSA biofilm formation， exopolysaccharide production and motility. And the SEM exhibited that 5'-epiequisetin made MRSA loosely packed and shrink. Conclusion Sub-inhibitory concentrations of 5'-epiequisetin inhibited MRSA biofilm formation and virulence production. It demonstrates that 5'-epiequisetin is an anti-MRSA lead compound.

Key words 5'-Epiequisetin; MRSA; Virulence factor; Biofilm

金黃色葡萄球菌是臨床常見的革蘭陽性菌，通過分泌多種致病性毒力因子如溶血素、脂肪酶和菌黃素等，引起臨床感染，威脅人類健康[1]。由于抗生素的大規(guī)模和不合理使用，出現(xiàn)了多種金黃色葡萄球菌耐藥菌株，其中以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）危害最大[2]。MRSA 致病性強、耐藥發(fā)展迅速，目前MRSA感染已經(jīng)和乙肝病毒感染、艾滋病感染并列為世界范圍內(nèi)3大難解決感染性疾病[3]。MRSA的致病性和耐藥性與其產(chǎn)生的毒力因子（virulent factor）和生物被膜（biofilm，BF）密切相關(guān)。毒力表示病原體致病能力的強弱，構(gòu)成細(xì)菌毒力的物質(zhì)稱為毒力因子，主要有侵襲力和毒素。細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌黏附于非生物或生物表面，分泌多聚物基質(zhì)并將自身包裹其中形成的一種有組織的細(xì)菌集團(tuán)[4]。在不殺死細(xì)菌的情況下，減少毒力因子的產(chǎn)生，抑制生物被膜的形成，是抑制耐藥致病菌的有效策略。

表伊快霉素（5'-epiequisetin）是鐮刀菌屬（Fusarium）真菌產(chǎn)生的類萜生物堿，是一種HIV-1整合酶抑制劑[5]。本課題組在尋找抗MRSA活性先導(dǎo)化合物的過程中，發(fā)現(xiàn)海洋嗜鹽真菌F. incarnatum GXIMD00527中得到的表伊快霉素顯示出較強的抗MRSA活性，與文獻(xiàn)報道相符[6]。但表伊快霉素抑制MRSA的作用機理及對MRSA毒力因子和生物被膜的抑制作用未見報道。在本研究中，測定了表伊快霉素抗MRSA的時間-抑菌曲線，測定了表伊快霉素對MRSA毒力因子溶血素、菌黃素和脂肪酶的抑制活性，并考察了表伊快霉素對MRSA菌體結(jié)構(gòu)、生物被膜結(jié)構(gòu)、菌體運動性的影響，為抗MRSA新型抗生素的研究提供數(shù)據(jù)支持和先導(dǎo)化合物。

1 材料

1.1 藥物來源及鑒定

表伊快霉素（化合物純度≥98%）分離自北海竹林鹽場來源嗜鹽真菌Fusarium incarnatum GXIMD00527。菌株保存于廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院菌種保藏中心。

1.2 指示菌

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC43300）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院張曉勇副教授惠贈，菌株保存于廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院菌種保藏中心。

1.3 培養(yǎng)基配制

使用的培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高溫高壓滅菌30 min 后使用。

大米培養(yǎng)基：大米80 g， 酵母提取粉0.4 g， 葡萄糖0.4 g， 人工海水120 mL。

LB：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，水1000 mL。

LB-g：含0.25%葡萄糖的LB培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 表伊快霉素的提取分離

菌株F. incarnatum GXIMD00527于大米培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵35 d，乙酸乙酯提取得到粗浸膏。粗浸膏經(jīng)正相硅膠柱色譜（200～300目正相硅膠）分離，采用梯度洗脫（二氯甲烷/甲醇，100：0～80：20，V/V），TLC色譜分析后，得到12個流分。Fr.10經(jīng)反相ODS柱色譜（CH3CN/H2O， 20：80～80：20）分離得到17個流分。sFr.16采用半制備高效液相色譜（CH3CN/H2O， 72：28， 3 mL/min）純化得到化合物。

2.2 最小抑菌濃度（MIC）測定

指示菌二次活化后，使用新鮮LB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌懸液濃度為每毫升含有106個菌落形成單位（colony forming units， CFU）。使用微量肉湯稀釋法測定MIC，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，最后一個澄清孔即為藥物MIC。

2.3 時間-生長曲線的測定

指示菌二次活化后，使用新鮮LB培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106 CFU/mL。加入樣品液達(dá)到終濃度為0.25×MIC和0.50×MIC，在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)并每隔4 h測定1次A600。

2.4 表伊快霉素對 MRSA 毒力因子的影響

2.4.1 溶血素溶血活性測定

指示菌在含藥或DMSO LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃、180 r/min）16 h。離心后取上清液100 μL加入900 μL溶血緩沖液（0.145 mol/L NaCl， 0.02 mol/L CaCl2）中，再加入33 μL無菌去纖維兔血，混勻后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，離心后取上清測定A543。

2.4.2 脂肪酶活性測定

指示菌在含藥或DMSO LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃、180 r/min）15 h。將牛津杯放置在含1%三丁酸甘油酯的LBA平板上，加入150 μL微孔濾膜過濾除菌后菌液，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，觀察透明圈大小。

2.4.3 菌黃素活性測定

指示菌在含藥或DMSO LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃、180 r/min）48 h。取5 mL菌液離心，保留菌體，無菌水清洗1次除去殘留培養(yǎng)基。加入500 μL無水甲醇，55 ℃的水浴攪拌加熱30 min。離心后保留上清，

60 ℃烘干，加入250 μL無水甲醇再次溶解，離心后取上清測定A450。

2.5 生物被膜形成抑制活性

指示菌二次活化后，使用新鮮LB-g培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106 CFU/mL。取195 μL稀釋后菌液至96孔板，加入5 μL樣品DMSO液，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸出菌液， 水洗2遍，60 ℃烘干。200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色30 min，洗去染液， 60 ℃烘干。200 μL 30%乙酸靜置溶解30 min，于酶標(biāo)儀振蕩混勻，測定A540。

2.6 運動性測定

0.3%瓊脂的LBA滅菌冷卻后加入樣品，等量DMSO為陰性對照。取過夜培養(yǎng)菌液5 ?L，含藥LBA平板中間，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察并記錄菌落生長情況。

2.7 胞外多糖（exopolysaccharide）形成抑制

指示菌二次活化后，使用新鮮LB-g培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌懸液濃度為106 CFU/mL。取999 μL稀釋后菌液至24孔板，加入1 μL樣品DMSO液，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸出菌液，PBS洗滌2遍， 60 ℃烘干。向24孔板加入0.25 mL 5%苯酚和1.25 mL濃硫酸， 室溫下黑暗培養(yǎng)1 h， 測定A490。

2.8 光學(xué)顯微鏡觀察MRSA生物被膜形成抑制效果

操作方法與“2.4”所述加入乙酸前所述一致，具體操作為：結(jié)晶紫染色干燥后，96孔板倒置于光學(xué)顯微鏡放大 400 倍下觀察并獲取圖像。

2.9 掃描電鏡觀察MRSA生物被膜形成抑制效果

于24孔板中加入無菌爬片后，操作方法與“2.6”所述烘干前所述一致，具體操作為：取出爬片，PBS洗滌2次，使用25%戊二醛于4 ℃冰箱固定過夜。使用PBS洗滌一次，后用乙醇低濃度至高濃度（ 50%、60%、70%、80%、90%和100%）脫水各1次，15 min /次；100%叔丁醇置換1次，15 min/次。真空冷凍干燥后，噴金，掃描電鏡觀察并獲取圖像。

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用GraphPad Prism 7作圖，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 表伊快霉素的結(jié)構(gòu)鑒定

淺黃色粉末。1H NMR （500 MHz， DMSO-d6）， δH： 5.43～5.34 （2H， m）， 5.24～5.10 （2H， m）， 3.80 （1H， d， J = 11.6 Hz）， 3.75 （1H， overlapped）， 3.69 （1H， d， J = 11.6 Hz）， 2.94 （3H， s）， 1.91 （1H， m）， 1.85-1.65 （4H， m）， 1.49（3H， d， J = 4.8 Hz）， 1.36 （3H， br s）， 1.24 （2H， m）， 1.02 （2H， m）， 0.89 （3H， d， J = 6.5 Hz）， 0.81 （1H， m）. 13C NMR （126 MHz， DMSO-d6）， δC： 201.4， 190.7， 176.4， 131.0， 130.9， 126.5， 126.4， 100.9， 67.6， 58.1， 48.1， 44.3， 41.8， 40.0， 38.2 35.4， 32.9， 29.1， 27.7， 26.8， 22.4， 17.8， 13.8. HRESIMS m/z 374.2329 [M+H]+， C22H32NO4+計算值374.2326；以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報道的基本一致，鑒定為表伊快霉素。

3.2 表伊快霉素對MRSA的體外抑制作用

表伊快霉素對MRSA的MIC值為16 μg/mL。時間生長曲線如圖2所示，與對照組相比，培養(yǎng)時間0～20 h時，4 μg/mL對MRSA具有生長抑制作用；8 μg/mL表伊快霉素則進(jìn)一步抑制MRSA生長，24 h持續(xù)有效。

3.3 表伊快霉素對MRSA毒力的影響

溶血酶活性實驗結(jié)果如圖3A所示，表伊快霉素具有降低MRSA溶血活性作用，并呈劑量依賴關(guān)系；其中8 μg/mL表伊快霉素可顯著抑制MRSA溶血活性，抑制率達(dá)72.02%。菌黃素活性實驗結(jié)果如圖 3B所示，8 μg/mL表伊快霉素可抑制MRSA菌黃素的產(chǎn)生，平均抑制率分別為9.28%。脂肪酶活性實驗結(jié)果如圖3C所示，對照組產(chǎn)生的透明圈直徑為1.39 ±0.01（x±s， n=3）mm，含藥組產(chǎn)生的透明圈直徑為1.08 ±0.08（x±s， n=3）mm，表明8 μg/mL 表伊快霉素可抑制MRSA脂肪酶的產(chǎn)生（P＜0.05）。

3.4 表伊快霉素對MRSA生物被膜形成的影響

實驗結(jié)果如圖4所示，表伊快霉素對MRSA生物被膜形成具有抑制作用，并呈劑量依賴性。8 μg/mL和4 μg/mL的表伊快霉素對MRSA生物被膜形成的抑制率分別為36.26%和15.13%。由光學(xué)顯微鏡觀察可見，與對照組相比，經(jīng)表伊快霉素處理的MRSA生物被膜發(fā)育較差，生物被膜厚度減少。

3.5 表伊快霉素對MRSA運動性的影響

運動性實驗結(jié)果如圖5所示，表伊快霉素具有抑制MRSA運動活性，經(jīng)8 μg/mL表伊快霉素處理后，MRSA運動距離明顯縮短。

3.6 表伊快霉素對MRSA胞外多糖exopolysaccharide產(chǎn)生的影響

實驗結(jié)果如圖6所示，表伊快霉素以劑量依賴的方式抑制MRSA胞外多糖exopolysaccharide的產(chǎn)生；8和4 μg/mL的表伊快霉素對MRSA exopolysaccharide產(chǎn)生的抑制率分別為53.18%和14.45%。

3.7掃描電鏡觀察表伊快霉素對MRSA生物被膜結(jié)構(gòu)的影響

掃描電子顯微鏡觀察如圖7所示，對照組細(xì)菌大部聚集成團(tuán)，形成厚而致密的細(xì)胞膜，菌體形態(tài)飽滿，表面光滑，個體正常；經(jīng)4 μg/mL表伊快霉素處理后，生物被膜的產(chǎn)生受到抑制，少量菌體聚集，排列較疏松，菌體出現(xiàn)輕微皺縮；經(jīng)8 μg/mL 表伊快霉素處理后，生物被膜的產(chǎn)生受到進(jìn)一步抑制，形成的細(xì)胞膜可忽略不計，細(xì)菌呈單層分散于爬片表面，菌體塌陷，表面皺縮。

4 討論

MRSA是醫(yī)院感染的主要原因之一，可導(dǎo)致較高的感染發(fā)病率和死亡率，MRSA具有的耐藥性限制了抗生素的使用。MRSA的致病性、免疫逃逸能力和耐藥性都依賴胞外產(chǎn)生毒力因子和形成生物被膜。抑制毒力因子和生物被膜是治療MRSA感染與解決耐藥性問題的新策略。溶血素是金黃色葡萄球菌分泌的最重要的毒力因子之一，可導(dǎo)致多種人體細(xì)胞的溶解，包括紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，還可誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞的促炎性變化，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的敗血癥[7]。溶血素也是金黃色葡萄球菌形成生物被膜的必需物質(zhì)，溶血素缺乏的菌株在細(xì)胞間相互作用方面存在明顯缺陷，在靜態(tài)和流動條件下都不能形成生物被膜[8]。菌黃素是金黃色葡萄球菌體內(nèi)重要的毒力因子，可通過其抗氧化特性保護(hù)細(xì)菌免受吞噬殺死，抑制菌黃素的產(chǎn)生，可有效地使病原體更容易被正常的宿主先天免疫所清除[9-10]。微生物表達(dá)脂肪酶，可將宿主來源的脂質(zhì)分解為游離脂肪酸以獲取營養(yǎng)，并通過滅活殺菌脂質(zhì)和可能干擾粒細(xì)胞的吞噬作用和趨化性來規(guī)避先天免疫，進(jìn)而導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的感染和傳播[11]。細(xì)菌性病原體利用運動（motility）進(jìn)行宿主定殖，并在生物被膜形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，金黃色葡萄球菌的運動被定義為菌落擴散（colony spreading）[12]。EPS是生物被膜基質(zhì)的重要組成部分，是生物被膜對抗生素耐受的主要來源，對EPS產(chǎn)生的任何干擾都可以抑制生物被膜的產(chǎn)生，并使細(xì)菌的附著力降低[13-14]。

本研究的結(jié)果顯示，表伊快霉素對MRSA產(chǎn)生3種毒力因子均具有明顯抑制作用，同時可以通過抑制細(xì)菌運動性與EPS的產(chǎn)生抑制細(xì)菌生物被膜的形成。因此，表伊快霉素可作為抗MRSA藥物研究的先導(dǎo)化合物。

參 考 文 獻(xiàn)

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