程春，楊玉

[華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢市婦幼保健院） 婦科一病區(qū)，湖北 武漢 430019]

宮頸癌為我國女性常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別居?jì)D科惡性腫瘤的第一和第二位[1-2]。宮頸癌早期癥狀不明顯，其發(fā)展過程存在著較長的、可逆的癌前病變期，其演變過程經(jīng)過以下幾個(gè)階段：低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、早期浸潤性癌和浸潤性癌。其中，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?yōu)閷m頸癌的癌前病變，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、部分高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變具有一定的可逆性，早期治療可終止癌癥進(jìn)展，故及早診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變，尤其是高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?cè)趯m頸癌的防治中具有重要意義[3-4]。目前亟需尋找對(duì)高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?cè)\斷的理想方法。已有研究證實(shí)[5]，高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus, HPV）感染與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但并非所有的高危型HPV感染都會(huì)發(fā)展為宮頸病變或?qū)m頸癌，同時(shí)高危型HPV檢測(cè)無法有效區(qū)分低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌等不同病理階段。

P16蛋白為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，其高表達(dá)提示細(xì)胞處于細(xì)胞周期的阻滯期。Ki-67蛋白可反映細(xì)胞周期進(jìn)展、增殖活躍。有關(guān)研究表明[6]，P16/Ki-67雙染有助于識(shí)別宮頸病變細(xì)胞。密封蛋白4（claudin 4, CLDN4）為緊密連接蛋白家族的一員，其表達(dá)與鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)，在癌組織中呈高表達(dá)[7]。但目前P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷價(jià)值尚不清楚。鑒于此，本研究回顧性分析不同宮頸病變患者的病理標(biāo)本，探討P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2020年8月—2021年3月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院就診并經(jīng)宮頸切片病理診斷為低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及慢性宮頸炎患者各32例?；颊吣挲g24～51歲，平均（35.13±5.95）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：組織標(biāo)本診斷依據(jù)《腫瘤病理診斷規(guī)范》[8]進(jìn)行分類；年齡 ＞ 20歲；取材前3個(gè)月未進(jìn)行免疫等有關(guān)治療；取材前3 d無陰道沖洗、放藥；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：有子宮切除史者；妊娠或哺乳期女性；合并凝血功能障礙或自身免疫系統(tǒng)疾病；合并其他惡性腫瘤；精神或認(rèn)知功能障礙者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 P16/Ki67雙染 將所收集患者宮頸組織標(biāo)本在中性甲醛（4%）中固定，并經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片，使用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)分析儀（型號(hào)：Benchmark GX，遼寧匯明國際貿(mào)易有限公司）染色，試劑盒購于瑞士Roche公司，操作嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，封片、晾干后置于顯微鏡下觀察；P16定位于細(xì)胞質(zhì)，顯棕色；Ki67定位于細(xì)胞核，顯紅色；當(dāng)細(xì)胞質(zhì)顯棕色且胞核顯紅色，則判定P16/Ki-67雙染陽性，單獨(dú)顯色或不顯色則判定為陰性。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CLDN4蛋白表達(dá) 宮頸病變組織標(biāo)本用甲醛溶液（10%）固定24 h，并經(jīng)石蠟包埋后用切片機(jī)（厚度為4 μm）連續(xù)切片后72℃加熱2 h，依次二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各脫蠟10 min；再依次經(jīng)100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇及80%乙醇水化；3%過氧化氫37℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3 min，重復(fù)3次；5%牛血清37℃封閉1 h后傾去血清；加入一抗后4℃過夜，轉(zhuǎn)至室溫35 min后PBS清洗3 min，重復(fù)3次；加入兔二抗37℃孵育2 h后PBS清洗3 min，重復(fù)3次；加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液后顯微鏡下觀察反應(yīng)進(jìn)度，待合適后自來水終止；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，自來水沖洗，37℃反藍(lán)后干燥過夜，樹脂封片；使用熒光顯微鏡拍照；CLDN4陽性染色呈棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞膜；依據(jù)染色深度進(jìn)行半定量分析：無色為陰性，淡黃色、棕黃色及棕褐色均判定為陽性。

1.2.3 P16/Ki-67雙染、CLDN4檢測(cè) P16/Ki-67雙染或CLDN4檢測(cè)任一診斷為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，即為聯(lián)合診斷為高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kappa檢驗(yàn)評(píng)定診斷方法的一致性，κ＞ 0.75為一致性較好，κ為0.40～0.75為一致性一般，κ＜ 0.40為一致性差；繪制受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16/Ki-67雙染診斷結(jié)果與病理檢查結(jié)果比較

96例P16/Ki67雙染診斷宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變陽性患者27例，與病理檢查診斷結(jié)果一致，52例陰性患者與病理檢查診斷結(jié)果一致，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，兩種診斷方法的一致性一般（κ=0.622，P=0.000）。見表1。

表1 P16/Ki-67雙染診斷結(jié)果與病理檢查診斷結(jié)果比較

2.2 CLDN4診斷結(jié)果與病理檢查診斷結(jié)果比較

CLDN4檢測(cè)用于診斷宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，96例患者中，25例陽性患者與病理檢查診斷結(jié)果一致，51例陰性患者與病理檢查診斷結(jié)果一致，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，兩種診斷方法的一致性一般（κ=0.552，P=0.000）。見表2。

表2 CLDN4檢測(cè)診斷結(jié)果與病理檢查診斷結(jié)果比較

2.3 P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)診斷結(jié)果與病理檢查診斷結(jié)果比較

96例患者中，P16/Ki-67雙染、CLDN4檢測(cè)聯(lián)合診斷30例宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，與病理檢查診斷結(jié)果一致，62例陰性患者與病理檢查診斷結(jié)果一致，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，兩種診斷方法的一致性較好（κ=0.906，P=0.000）。見表3。

表3 P16/Ki-67雙染、CLDN4檢測(cè)聯(lián)合診斷結(jié)果與病理檢查診斷結(jié)果比較

2.4 P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷效能分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，P16/Ki-67雙染、CLDN4檢測(cè)及兩者聯(lián)合對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?cè)\斷的敏感性分別為84.38%（95% CI：0.665，0.941）、78.13%（95% CI：0.596，0.901）、93.75%（95% CI：0.778，0.989），特異性分別為81.25%（95% CI：0.692，0.895）、79.69%（95% CI：0.674，0.883）、96.88%（95% CI：0.882，0.995），AUC分別為0.828（95% CI：0.738，0.897）、0.789（95% CI：0.694，0.866）、0.953（95% CI：0.890，0.986）。見表4和圖1。

表4 P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷效能分析

圖1 P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?cè)\斷的ROC曲線

3 討論

宮頸癌為女性生殖道常見惡性腫瘤，主要是由高危型HPV持續(xù)感染導(dǎo)致。近年來宮頸癌的發(fā)病率有所提高，且有年輕化趨勢(shì)，故及早對(duì)宮頸病變，尤其是高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，有助于改善患者預(yù)后[9-12]。液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）是目前臨床中篩查宮頸病變的主要手段，但TCT診斷高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的準(zhǔn)確性容易受采樣等因素的影響，同時(shí)TCT檢測(cè)主要基于細(xì)胞形態(tài)特征，缺乏組織學(xué)特征評(píng)估，易受主觀因素的影響，故正確率較低[13]。探討P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷效能，對(duì)臨床宮頸癌的防治具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，P16/Ki67雙染、CLDN4檢測(cè)單獨(dú)用于診斷宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與病理檢查診斷結(jié)果一致性一般；而P16/Ki-67雙染、CLDN4檢測(cè)聯(lián)合診斷宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與病理檢查診斷結(jié)果一致性較好。分析可能是由于單一方法對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?cè)\斷的效能相對(duì)較低，P16/Ki-67雙染、CLDN4檢測(cè)兩種方法聯(lián)合診斷可充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)不足，故而與病理診斷結(jié)果一致性較好。ROC曲線分析結(jié)果顯示，P16/Ki-67雙染、CLDN4兩者聯(lián)合診斷宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的AUC大于P16/Ki-67雙染、CLDN4檢測(cè)單獨(dú)診斷的AUC，提示P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷效能較高。其原因可能為，機(jī)體正常生理狀態(tài)下，P16和Ki-67表達(dá)互相制約，處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會(huì)出現(xiàn)在同一細(xì)胞中，兩者同時(shí)表達(dá)表明細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)。其中，P16能夠阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，是一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，并可通過抑制多種生長調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化過程抑制細(xì)胞增殖，P16表達(dá)異常為腫瘤發(fā)生的早期事件；Ki-67表達(dá)與細(xì)胞增殖活性有關(guān)，其參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移等過程[14-17]。此外，P16/Ki-67雙染操作簡單，無內(nèi)源生物素干擾，易于觀察，有利于對(duì)病變組織細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。楊旎等[18]研究報(bào)道，P16/Ki-67雙染可提高2級(jí)以上宮頸上皮內(nèi)瘤變的診斷效能，有助于降低誤診率，避免過度治療，在輔助宮頸病變中的診斷效能較高。CLDN4為上皮細(xì)胞之間的一種重要連接復(fù)合體，主要由膜周蛋白家族、跨膜蛋白家族等構(gòu)成，具有維持細(xì)胞極性和細(xì)胞旁通透屏障等作用[19]；相關(guān)研究表明[20-21]，CLDN4在前列腺癌、食管癌組織中高表達(dá)，推測(cè)CLDN4高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)宮頸病變的發(fā)生。狄晨紅等[22]研究也表明，CLDN4與宮頸鱗癌及癌前病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可用于指導(dǎo)宮頸鱗癌、宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷。故而P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷效能較高。

綜上所述，P16/Ki-67雙染聯(lián)合CLDN4檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷效能較高，值得在臨床中進(jìn)行推廣應(yīng)用。本研究的不足之處為所納入樣本數(shù)量較少，在后續(xù)的研究中還需擴(kuò)充樣本數(shù)量，進(jìn)一步深入研究。