陳 宏 張明浩 陳 群 宋倩男 張佩穎 趙建云 隋博文

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院兒一科，黑龍江省哈爾濱市 150040；2 黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，黑龍江省哈爾濱市 150300；3 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院呼吸科，黑龍江省哈爾濱市 150040)

哮喘是一種呼吸道慢性炎癥疾病，發(fā)作時主要表現(xiàn)為喘鳴、咳嗽、多痰、呼吸急促等癥狀，病理學檢查可見肺部炎癥細胞浸潤、上皮損傷、支氣管平滑肌過度反應(yīng)、呼吸道水腫及黏液增加[1]。哮喘反復發(fā)作可導致呼吸道結(jié)構(gòu)改變，最終出現(xiàn)纖維化及呼吸道重塑等不可逆的病理表現(xiàn)[2-3]。目前，臨床上常用的哮喘藥物(如糖皮質(zhì)激素、支氣管擴張劑、茶堿和白三烯調(diào)節(jié)劑等)可以改善患者機體的炎癥狀態(tài)，但其對呼吸道纖維化及其重塑的影響尚不明確，且長期使用可導致患者的用藥依從性下降，療效欠佳，并有一定的不良反應(yīng)[4-5]。因此，探討哮喘的輔助療法對于提高患者的療效有重要意義。中醫(yī)學認為，哮喘以咳、喘、痰為主癥，屬中醫(yī)“咳嗽”“哮喘”“痰飲”范疇，病位在肺、脾、腎三臟，尤其是肺。中醫(yī)典籍中對哮喘的描述始見于《素問·陰陽別論》，其描述“陰爭于內(nèi)，陽擾于外，魄汗未藏，四逆而起，起則熏肺，使人喘鳴”。麻黃為麻黃科植物草麻黃、中麻黃或木賊麻黃的干燥草質(zhì)莖，又名龍沙、狗骨、卑相、卑鹽，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[6]。中醫(yī)認為麻黃性辛溫，味微苦，歸肺、膀胱經(jīng)，有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫之功效。研究發(fā)現(xiàn)，麻黃提取物具有緩解支氣管平滑肌痙攣的作用[7]。細辛的主要有效成分包括甲基丁香酚、γ-細辛醚、細辛素、芝麻素等，具有抗炎作用，對哮喘具有一定療效，常被用于哮喘患兒的輔助治療[8]。但麻黃和細辛對哮喘患者肺組織學的影響如何，目前尚不清楚。為此，本研究建立哮喘小鼠模型，觀察麻黃-細辛藥對提取物對哮喘小鼠肺組織病理變化、氣道炎性反應(yīng)等指標的影響，以期為麻黃-細辛藥治療哮喘提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級Balb/c小鼠30只，雌雄各半，周齡4～6(4.97±0.46)周，體質(zhì)量18～22(20.05±0.86)g。小鼠由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[許可證號：scxk(魯)20140007]。將小鼠置于12 h光暗周期中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，所有小鼠均分籠喂養(yǎng)，自由飲食及飲水。本研究符合《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：紫外可見分光光度計(OLYMPUS公司，型號：CKX31)，熒光顯微鏡(ZEISS公司，型號：Axio Scope A1)，低溫高速離心機(Eppendorf公司，型號：5810R)，旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-52型)，酶標儀(BIO-RAD公司，型號：450 型)。

1.2.2 試劑：麻黃飲片(產(chǎn)地甘肅，批號：20200315)、細辛飲片(產(chǎn)地黑龍江，批號：20200418)均購自哈藥集團世-堂制藥廠；小鼠白細胞介素(interleukin，IL)-6 ELISA檢測試劑盒(批號：149320012)、小鼠IL-17 ELISA檢測試劑盒(批號：128450025)、兔抗人Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)多克隆抗體(批號：728109)、總RNA提取試劑盒(批號：2019-10-AP)均購自北京盒子生工科技有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)抗體(批號：2018-2-AP)購自Santa Cruz公司；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(批號：12873-1-AP)購自Abcam 公司；95%乙醇、苯酚、濃硫酸(批號：202006、202007、202006)購自上?；瘜W試劑有限公司試劑廠；兔抗小鼠β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體均購自上海榕柏生物技術(shù)有限公司(批號：20201116、20190426)。

1.3 麻黃-細辛藥對提取物的制備 取麻黃飲片3.0 kg和細辛飲片1.5 kg，先加入600 mL無水乙醇充分浸潤，再加入4.8 L無水乙醇加熱煮沸后回流提取2 h。趁熱使用3層紗布過濾，取濾渣，再用4.8 L三蒸水加熱回流提取2 h。趁熱過濾，合并2次濾液，于真空減壓濃縮罐進行減壓濃縮,干燥箱烘干成浸膏，最后冷凍干燥制成干粉，計算得到1 g干粉相當于6.34 g生藥。

1.4 分組、哮喘小鼠模型的建立及干預方法 根據(jù)隨機數(shù)字表法將30只Balb/c小鼠分為對照組、模型組、麻黃-細辛組，各10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始造模。除對照組外，其他2組均按以下方法建立哮喘小鼠模型[9]：分別于實驗的第1天、第7天、第14天對小鼠進行致敏干預，即于第1天、第7天皮下注射卵清蛋白(北京索萊寶科技有限公司，批號：B20210812)10 mg和氫氧化鋁凝膠(Sigma-Aldrich Lab & Production Materials公司，批號：20483-21-2)200 mg；第14天開始，將小鼠置于30 cm×15 cm×10 cm的不完全封閉式透明容器內(nèi)，將5 mL含2%卵清蛋白的水溶液放入超聲霧化器，給予小鼠霧化30 min，連續(xù)激發(fā)7 d；第21天開始給予3組小鼠連續(xù)吸入霧化激發(fā)液4 d，1次/d，30 min/次，霧化激發(fā)液為5 mL含3%卵清蛋白的水溶液。建模成功標準為：小鼠打噴嚏、抓耳撓鼻，喘息，毛發(fā)無光，活動量減少。建模期間給予對照組等量的0.9%氯化鈉霧化吸入。建模后的第18天起，每天給予各組小鼠相應(yīng)藥物霧化干預，麻黃-細辛組藥物為0.08 g/kg麻黃和0.16 g/kg細辛藥對提取物+4 mL生理鹽水，對照組和模型組霧化藥物為等體積生理鹽水，均于激發(fā)試驗前1 h進行霧化干預，連續(xù)7 d，1次/d。

1.5 標本采集及觀察指標的檢測方法

1.5.1 氣道反應(yīng)性：于末次治療結(jié)束待小鼠呼吸穩(wěn)定后，分別給予0 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL倍增濃度的乙酰甲膽堿霧化吸入，且使用肺功能檢測系統(tǒng)測定相應(yīng)乙酰甲膽堿濃度下的增強呼氣間歇值(enhance pause，Penh)。Penh=[(呼氣時間/松弛時間)-1]×(最大呼吸流量/最大吸氣量)。Penh越高說明氣道反應(yīng)性越高。

1.5.2 采集標本：氣道反應(yīng)性測定完成后，使用5%的水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉各組小鼠，結(jié)扎左側(cè)主支氣管，經(jīng)氣管插管，以4 ℃預冷的無菌平衡鹽溶液行支氣管肺泡灌洗6 次，0.5 mL/次，收集支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。隨后對小鼠進行開胸手術(shù)，分別取左右肺組織，將未灌洗過的右上葉肺組織置于4%中性甲醛固定液，將右下肺組織保存于液氮。通過眼眶后靜脈叢采血獲取血液樣本。

1.5.3 肺組織形態(tài)學：取未灌洗過的右上葉肺組織置于4%中性甲醛固定液48 h，然后進行沖洗、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，將切片烤干后進行脫蠟處理，之后置入不同濃度的酒精中脫水3 min，使用蘇木精染色5 min后流水清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后使用0.5%伊紅液染色1～3 min，使用酒精脫水后進行脫蠟處理，使用中性樹膠封固。顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 BALF的白細胞計數(shù)和分類：使用Diff-Quik染色液染色BALF細胞涂片后，光學顯微鏡下對BALF的白細胞進行分類和計數(shù)，包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞的比例。

1.5.5 BALF和血清的IL-6及IL-17水平：取1.5.2獲取的BALF，將其過200目細胞篩后離心，輕輕傾倒出BALF上清液備用。取1.5.2的眼眶血標本，于4 ℃下以300 r/min離心15 min，收集血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作檢測BALF和血清的IL-6及IL-17水平，于酶標儀450 nm波長處讀取各孔的吸光度值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.5.6 肺組織中YAP的表達水平：采用免疫組化染色法，取保存于液氮中的右下肺組織，加 BSA封閉液室溫反應(yīng)10 min以封閉抗體；棄去多余液體，滴加兔抗人YAP多克隆抗體，利用Image-pro Plus 6.0軟件測定陽性部位吸光度值。

1.5.7 肺組織YAP mRNA的表達水平：取保存于液氮中的右下肺組織，參照TRIzol試劑(上海索寶生物科技有限公司，批號：15732-048)說明書提取肺組織總RNA，使用紫外可見分光光度法檢測RNA純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成設(shè)計。YAP上游引物為5′-CCATAAGAACAAGACCACATAAT-3′，下游引物為5′-CCTCTCCTTCTCCATCTGTAGC-3′；內(nèi)參β-actin上游引物為5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物為5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。反應(yīng)體系為包括cDNA模板1 μL、SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、QN ROX Reference Dye 2 μL、上下游引物各1 μL、RNase-Free水5 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。每份樣品設(shè)5個復孔。采用2-ΔΔCt法計算肺組織中YAP mRNA 相對表達水平。

1.5.8 肺組織TGF-β1蛋白及α-SMA的表達：稱取各組保存于液氮的小鼠右下肺組織，根據(jù)說明書配制蛋白裂解液，裂解肺組織后離心提取總蛋白，利用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度。取95 ℃高溫變性后的150 μg蛋白，進行SDS-PAGE以分離等量蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶于4 ℃封閉PVDF膜1 h，用TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入TGF-β1抗體、α-SMA抗體、兔抗小鼠β-actin抗體(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5 μL辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(1 ∶1 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5次，5 min/次。以β-actin為內(nèi)參蛋白，顯影曝光后，利用Image-pro Plus圖像分析軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠肺組織形態(tài)學的比較 對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，支氣管管腔內(nèi)無炎癥細胞浸潤；模型組小鼠肺組織支氣管腔狹窄，管腔內(nèi)出現(xiàn)以嗜酸性粒細胞與中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，平滑肌增厚；與模型組比較，麻黃-細辛組小鼠肺組織支氣管腔內(nèi)有炎癥細胞浸潤，但浸潤程度較輕，支氣管管壁輕度增厚。見圖1。

圖1 3組小鼠的肺組織形態(tài)學(HE染色，×400)

2.2 3組小鼠Penh的比較 各組小鼠吸入相應(yīng)濃度乙酰甲膽堿后，其他兩組小鼠Penh均高于對照組，麻黃-細辛組小鼠Penh均低于模型組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠Penh的比較(x±s，%)

2.3 3組小鼠BALF中各類白細胞比例、IL-6及IL-17水平和血清IL-6及IL-17水平的比較 與對照組相比，其他兩組小鼠BALF中的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞比例，以及BALF和血清的IL-6及IL-17水平均升高(均P<0.05)。與模型組比較，麻黃-細辛組BALF中的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞比例，以及BALF和血清的IL-6及IL-17水平均降低(均P<0.05)。見表2、表3。

表2 3組小鼠BALF中各類白細胞比例的比較(x±s，%)

表3 3組小鼠BALF和血清IL-6及IL-17水平的比較(x±s，pg/mL)

2.4 3組小鼠肺組織YAP及其mRNA表達水平的比較 與對照組相比，模型組小鼠肺組織YAP及其mRNA表達水平均升高(均P<0.05)；與模型組相比，麻黃-細辛組小鼠肺組織YAP及其mRNA表達水平均降低(均P<0.05)。見表4。

表4 3組小鼠肺組織中YAP及其mRNA相對表達水平的比較(x±s)

2.5 3組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA表達水平的比較 與對照組相比，其他兩組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA表達水平均升高(均P<0.05)；與模型組比較，麻黃-細辛組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA表達水平均降低(均P<0.05)。見表5，圖2。

表5 3組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA相對表達水平的比較(x±s)

圖2 3組小鼠肺組織TGF-β1蛋白和α-SMA電泳條帶圖

3 討 論

哮喘的主要病理表現(xiàn)為肺部組織炎癥細胞浸潤、氣道上皮損傷、呼吸道水腫及黏液增加[10]。肺部的慢性炎癥可引起平滑肌細胞肥大和增生、杯狀細胞化生、上皮細胞脫落等變化。這些改變會導致氣管壁變厚、氣道狹窄、血管增生，引發(fā)氣道過度反應(yīng)而導致呼吸困難，其中氣道狹窄是一種不可逆的病理變化[11]。目前臨床上常用的藥物，如糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗藥等，能迅速控制氣道炎癥，效果良好，但是仍然存在一些弊端，如停藥后易復發(fā)，長期用藥導致全身或局部的不良反應(yīng)等。哮喘，中醫(yī)稱為哮病，是以喉中哮鳴有聲、呼吸困難甚至喘息不能平臥為主癥的反復發(fā)作性肺系疾病，常因氣候突變、飲食不當、情志失調(diào)、勞累等因素引動伏痰而發(fā)，發(fā)作前多有鼻癢、噴嚏、咳嗽、胸悶等癥狀[12]。

麻黃具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫之功，主治風寒感冒、胸悶喘咳、風水浮腫、哮喘。中醫(yī)認為麻黃的作用以發(fā)散與宣肺為主，如蜜麻黃可潤肺止咳，多用于表證已解的氣喘咳嗽。中藥細辛始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為呼吸系統(tǒng)常用中藥，常與其他藥物配伍用于治療哮喘[13]。細辛能去風濕、泄肺破痰，主治咳逆上氣，并有抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)咳、平喘、解痙等功效，臨床上將其用于治療頭痛、風濕痛、哮喘。細辛的活性成分芝麻素具有抗氧化、抗炎、抗過敏及神經(jīng)保護的功效，是一種極具開發(fā)潛力的藥物[14]?！侗静菥V目》記載，細辛能去風濕、泄肺破痰，主治咳逆上氣?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》與《名醫(yī)別錄》亦指出，細辛溫中下氣，能破痰利水、行氣寬中、并治喉痹，可治鼻塞、療咳嗽。本研究通過建立哮喘小鼠模型，觀察麻黃-細辛藥對提取物對哮喘小鼠癥狀的改善作用。建模后，模型組小鼠出現(xiàn)打噴嚏、抓耳撓鼻，喘息等癥狀，且病理組織學結(jié)果顯示小鼠肺組織支氣管管腔狹窄、平滑肌增厚，管腔內(nèi)出現(xiàn)以嗜酸性粒細胞與中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤，提示哮喘小鼠模型建模成功。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠的Penh 及BALF中的嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞比例均高于對照組，而麻黃-細辛組上述指標均低于模型組(均P<0.05)，提示麻黃-細辛藥對提取物可降低哮喘模型小鼠的氣道反應(yīng)性和炎癥反應(yīng)，改善其癥狀。

研究顯示，IL-17可誘導促纖維化細胞因子和促炎癥介質(zhì)的分泌，如IL-6、IL-11、IL-8等，并可通過誘導自噬導致線粒體功能障礙和支氣管纖維化，在哮喘的氣道重塑中發(fā)揮重要作用[15]。TGF-β1與α-SMA均是與纖維化密切相關(guān)的因子。研究顯示，抑制TGF-β1、α-SMA的表達對氣道重塑具有一定的調(diào)控作用[16]。YAP是一種多功能的細胞內(nèi)連接蛋白和轉(zhuǎn)錄共激活因子，可通過抑制Hippo信號通路，減輕氣道炎性反應(yīng)、抑制氣道重塑[17]。YAP在哮喘支氣管平滑肌中表達上調(diào)，其活性與人氣道平滑肌細胞增殖密切相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，麻黃-細辛組小鼠支氣管腔內(nèi)的炎癥細胞浸潤及支氣管管壁增厚程度均較模型組減輕，提示麻黃-細辛藥對提取物有助于改善哮喘模型小鼠的氣道重塑。同時，模型組小鼠BALF和血清的IL-6、IL-17水平，以及肺組織中YAP及其mRNA表達水平、TGF-β1蛋白和α-SMA表達水平均高于對照組，而麻黃-細辛組上述指標水平均低于模型組(均P<0.05)。這提示麻黃-細辛藥對提取物可能通過下調(diào)IL-17、IL-6、TGF-β1、α-SMA、YAP等因子的表達，從而抑制哮喘模型小鼠的氣道重塑。

綜上所述，麻黃-細辛藥對提取物能夠減輕哮喘模型小鼠的氣道反應(yīng)性和炎癥反應(yīng)，并可能通過下調(diào)IL-17、IL-6、TGF-β1、α-SMA、YAP等因子的表達而抑制哮喘模型小鼠的氣道重塑。這或可為中醫(yī)藥治療哮喘提供新的思路。