馮倩倩，王召陽(yáng)，袁維峰，姜一曈，龐忠寶，朱鴻飛，賈 紅*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510630)

犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬中的一種無囊膜單鏈DNA病毒。病毒的直徑為21～24 nm，基因組大小約為5.2 kb，且含有2個(gè)開放閱讀框(ORF)，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1和NS2)[1]。雖然CPV是一種DNA病毒，但其呈現(xiàn)出非常高的變異速率，可達(dá)到約10-4個(gè)位點(diǎn)/年，與RNA病毒的變異速率相似，從而出現(xiàn)快速和持續(xù)的抗原進(jìn)化和變異[2]。CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c是犬細(xì)小病毒的三種主要的亞型。1980年初，CPV-2a被認(rèn)為是在狗身上發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)小病毒[3-4]。1984年，新亞型CPV-2b首次在美國(guó)出現(xiàn)，然后在世界范圍內(nèi)傳播，可在犬、貓和野生食肉動(dòng)物中引起嚴(yán)重的胃腸炎和心肌炎[5-6]。CPV-2c是該病毒的第三種變種，并于2000年在意大利首次被發(fā)現(xiàn)，并迅速地傳播到歐洲、美洲、亞洲和澳大利亞[7-8]。據(jù)報(bào)道，CPV-2c已成為引發(fā)全球犬類細(xì)小病毒病的主要變種。CPV-2亞型之間的主要抗原差異是VP2表位A中426殘基的關(guān)鍵氨基酸差異；其中，CPV-2a中的殘基為天冬酰胺，CPV-2b中的殘基為天冬氨酸，CPV-2c中的殘基為谷氨酸[9-11]。

CPV的生命力較為頑強(qiáng)，可在4～10 ℃生存半年，37 ℃存活14 d，56 ℃存活24～36 h，60 ℃可以存活1 h，在糞便中可存活數(shù)月乃至數(shù)年，仍可引發(fā)感染[12-13]。此外，CPV的傳染能力強(qiáng)，所有犬科動(dòng)物在各年齡階段均可感染，但1～6月齡的犬只感染率最高[14]。犬細(xì)小病毒病在臨床上主要表現(xiàn)為腸炎型、心肌炎型和混合型[14]。腸炎型多發(fā)生在 2～6月齡小犬，表型癥狀為嗜睡，沒有食欲，精神沉郁，嘔吐和腹瀉，死亡比例非常高。心肌炎型常見于4～6 周齡的幼犬，無明顯病癥，發(fā)病急死亡快，致死率為60%～100%。給易感動(dòng)物接種疫苗，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的抵抗力是預(yù)防該病的主要手段。但目前存在的疫苗也存在一些缺陷，如弱毒疫苗存在毒株變異和毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，可能存在母源抗體的影響導(dǎo)致免疫失敗。因此，仍有很多幼犬感染CPV，抗體治療是治療該病的首選。目前抗體主要為鼠源抗體，存在免疫排斥反應(yīng)等問題[15-16]。納米抗體是一種重組抗體片段，大小約為 15 kD，是駝科中的重鏈抗體的可變區(qū)，又稱重鏈單域抗體(Single variable domain on a heavy chain antibodies，VHH抗體)[17]。其具有體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易表達(dá)、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)和可穿透血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究希望通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建CPV的納米抗體免疫文庫(kù)，并通過重組表達(dá)獲得具有高親和力和特異性的抗CPV納米抗體，有望開發(fā)出可用于CPV的臨床診斷和治療的納米抗體新型制劑，為納米抗體應(yīng)用于獸用生物制品領(lǐng)域提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 CPV-2c(TS02株F12代)為實(shí)驗(yàn)室分離及保存；貓腎細(xì)胞(CRFK、F86代)為實(shí)驗(yàn)室保存；健康羊駝(24月齡、雄性)及pComb3x載體購(gòu)自艾柏森(江蘇)生物科技有限公司；TG1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；DH5α感受態(tài)購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；PrimeScript 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自Takara公司；Avidin-HRP 購(gòu)自Thermo公司；Mouse Monoclonal [B62-FE2] to M13 (HRP)和Goat Anti-Alpaca IgG H & L (HRP)購(gòu)自Abcam公司；T4 DNA Ligase購(gòu)自NEB公司；Ni-親和純化磁珠購(gòu)自江蘇千純生物科技有限公司。

1.2 犬細(xì)小病毒納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建及特異性篩選

1.2.2 血清抗體水平的測(cè)定 分別于三免和四免后兩周分別采集免疫羊駝的外周全血，離心分離血清，通過ELISA的方法檢測(cè)CPV抗體效價(jià)。樣品OD450nm值/陰性對(duì)照OD450nm值(P/N)>2.1則為陽(yáng)性，吸光值達(dá)到陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)的最高稀釋倍數(shù)作為血清的抗體效價(jià)。

1.2.3 VHH基因的擴(kuò)增 于四免后第14天采集30 mL免疫羊駝外周血，按照淋巴細(xì)胞分離試劑盒說明書分離淋巴細(xì)胞，采用Trizol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)楊艷麗等[18]方法設(shè)計(jì)兩輪PCR引物，在第二輪引物中引入SfiⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定及回收。

表1 巢式PCR引物Tab 1 Primer sequence for nested PCR

1.2.4 M13噬菌體抗體文庫(kù)的構(gòu)建 用SfiⅠ酶分別對(duì)回收的第二輪PCR產(chǎn)物和pComb3x載體進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定后回收，用T4 DNA連接酶連接酶切后的VHH基因片段與pComb3x載體，連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入TG1感受態(tài)細(xì)胞。將平板上長(zhǎng)出的所有菌落收集至5 mL LB培養(yǎng)基中，再加入5 mL含有40%甘油的LB培養(yǎng)基，即為抗CPV納米抗體的初始抗體庫(kù)，分裝后于-80 ℃保存。

1.2.5 VHH抗體庫(kù)的擴(kuò)增和拯救 取初始庫(kù)菌液100 μL，加入100 mL LB(Amp+)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h，使菌液的OD600nm值達(dá)到0.6～0.8。加入輔助噬菌體M13K07，按照感染復(fù)數(shù)(MOI)= 20 ∶1量添加，37 ℃靜置30 min后，再經(jīng)37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。將上述菌液在室溫條件下5000 r/min離心10 min，棄上清。用200 mL LB(Amp+、Kan+)培養(yǎng)基重懸菌液，并置于30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。將上述培養(yǎng)液經(jīng)4 ℃、8000 r/min離心20 min，收集上清液至干凈無菌的玻璃三角瓶?jī)?nèi)，緩慢向其中加入1/5體積的5×PEG/NaCl溶液，4 ℃靜置5 h。然后在4 ℃、8000 r/min離心30 min，棄上清后，用2 mL PBS重懸沉淀，混勻后，再經(jīng)8000 r/min離心2 min，棄去沉淀，于上清中按照1∶1添加40%甘油，分裝至無菌EP管中，-20 ℃保存，此為CPV特異性重組噬菌體庫(kù)。

1.2.6 CPV特異性重組噬菌體的淘選和富集 用純化的CPV作為目標(biāo)抗原包被ELISA板，對(duì)拯救的CPV特異性重組噬菌體庫(kù)進(jìn)行3輪淘選，以篩選出親和力更高的CPV特異性重組噬菌體。第一輪淘選、第二輪淘選和第三輪淘選所用的純化的CPV濃度分別為100 μg/mL、10 μg/mL和1 μg/mL。取拯救出的重組噬菌體庫(kù)1 mL，加入9 mL PBSM進(jìn)行稀釋。加入酶標(biāo)板中，100 μL/孔，37 ℃、80 r/min振蕩反應(yīng)30 min，再37 ℃靜置2 h。棄去孔內(nèi)的液體，用PBST清洗5次。初次侵染：每孔加入100 μL培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TG1菌液，37 ℃孵育20 min，收集菌液。每孔加入200 μL洗脫液(200 mmol/L甘氨酸、pH2.2)，置于微量振蕩器上輕微振蕩10 min。將孔內(nèi)的洗脫液吸出，迅速加入1 mol/L Tris緩沖液(pH9.0)調(diào)節(jié)pH至7.4，以恢復(fù)噬菌體的侵染能力。再次侵染擴(kuò)增：將上述洗脫液中加入到5 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TG1菌液中，再與初次侵染的菌液混合，37 ℃靜置2 h。加入100 mL LB(Amp+)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h，使菌液OD600nm達(dá)到0.6～0.8。加入輔助噬菌體M13K07，進(jìn)行拯救。拯救后的上清液即為第一輪淘選獲得的重組噬菌體庫(kù)擴(kuò)增液，部分保存后其余進(jìn)行下一輪淘選，第二、三輪淘選步驟與第一輪相同。

1.2.7 噬菌體單克隆檢測(cè) 取100 μL第三次淘選時(shí)2次侵染的混合液，倍比稀釋后涂于固體LB(Amp+)培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。平板上隨機(jī)挑選96個(gè)單菌落，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，然后加入輔助噬菌體M13K07，制備噬菌體單克隆。以獲得噬菌體的單克隆作為一抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)。用包被緩沖液將純化的CPV稀釋至1 μg/mL包被酶標(biāo)板。二抗為100 μL 1000倍稀釋的HRP標(biāo)記的鼠抗M13抗體。洗滌后，加入TMB顯色，100 μL/孔，孵育15 min，最后加入50 μL H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD450nm值。

解析：n(CO2)∶n(NaOH)=0.8∶1=4∶5,處在1∶2到1∶1之間,屬于恰好完全反應(yīng)的區(qū)間,生成的產(chǎn)物既有Na2CO3,也有NaHCO3,我們就可以依據(jù)鈉守恒和碳守恒建立兩個(gè)方程:

1.3 犬細(xì)小納米抗體的表達(dá)與鑒定

1.3.1 VHH重組表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)淘選出的4株噬菌體的序列，設(shè)計(jì)合成帶有XmaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的通用引物，同時(shí)在抗體序列N端添加6×His標(biāo)簽序列，引物序列見表2。對(duì)4株噬菌體進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。將4條VHH目的基因及pcDNA3.1載體依次通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化、PCR鑒定及菌液測(cè)序。篩選出序列連接正確且無突變的菌株，提取重組表達(dá)載體質(zhì)粒DNA。

表2 VHH特異性擴(kuò)增引物Tab 2 VHH Sequence specific amplification primers

1.3.2 VHH在HEK293F中的表達(dá)及純化與鑒定復(fù)蘇HEK293F細(xì)胞，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定且存活率大于98%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)將表達(dá)EGFP質(zhì)粒設(shè)為對(duì)照，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染結(jié)束后收集培養(yǎng)基，取少量樣品用SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。然后，利用Ni-磁珠對(duì)目的蛋白進(jìn)行親和純化，純化后的抗體蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、間接ELISA及間接免疫熒光(IFA)進(jìn)行鑒定。ELISA具體過程如下：使用純化的CPV作為包被原，包被濃度為10 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃包被過夜，PBST洗滌5次，每次3 min；采用1%BSA進(jìn)行封閉，100 μL/孔，37 ℃封閉2 h，PBST洗滌5次，每次3 min。用1% BSA-PBS稀釋純化后的納米抗體 (稀釋倍數(shù)分別為1∶10、 1∶100、 1∶1000和1∶10000)，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌5次，每次3 min。二抗為1∶3000稀釋抗His-HRP抗體，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌5次，每次3 min。結(jié)束后采用KPL SureBlue TMB顯色液進(jìn)行顯色，實(shí)驗(yàn)組OD450nm值與對(duì)照組OD450nm比值(P/N)大于2.1判斷為陽(yáng)性。IFA具體過程如下：將CPV-2c毒種稀釋20倍，接種已長(zhǎng)滿單層CRFK細(xì)胞的48孔板，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后棄去培養(yǎng)液，用無水乙醇固定，100 μL/孔，4 ℃過夜；PBST洗滌3次后每孔加入400 μL PBSTM，37 ℃封閉1 h，再用PBST洗3次。用PBSTM將純化后的納米抗體稀釋10倍，分別加入到細(xì)胞板中，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)立二抗對(duì)照及空白細(xì)胞對(duì)照，37 ℃孵育1 h后用PBST洗5次。加入1000倍稀釋的抗His-FITC抗體作為二抗，100 μL/孔，空白細(xì)胞對(duì)照孔不加二抗，37 ℃避光孵育1 h，洗滌5次后每孔內(nèi)加入200 μL PBST保持濕潤(rùn)，于熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 病毒中和抗體檢測(cè) CPV中和實(shí)驗(yàn)操作如下。(1)納米抗體的稀釋：將純化后的重組表達(dá)納米抗體分別用DMEM稀釋5倍，經(jīng)0.22 μm針式濾器過濾除菌后加入96孔細(xì)胞板的第一排，每孔100 μL，繼續(xù)進(jìn)行2倍(100 μL+100 μL)系列稀釋至1∶640，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)立病毒對(duì)照和未接毒的正常細(xì)胞對(duì)照孔。(2)病毒稀釋：將CPV-2c細(xì)胞毒(F15代，106.5TCID50/mL)用DMEM稀釋30000倍(每100 μL約含100個(gè)TCID50)，加入已稀釋好抗體的細(xì)胞孔中，100 μL/孔。將上述稀釋好的病毒液繼續(xù)進(jìn)行10倍系列稀釋至10-1、10-2、10-3，分別含10 TCID50、1 TCID50和0.1 TCID50，作為病毒回歸實(shí)驗(yàn)加入不含抗體的細(xì)胞孔內(nèi)，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度加5個(gè)孔。(3)中和：將上述細(xì)胞板振蕩混勻10 s后置于37 ℃孵育1 h，每半小時(shí)混勻一次。(4)加細(xì)胞：將消化好的細(xì)胞懸液(含15%FBS)加入中和后的細(xì)胞孔中，每孔60 μL。(5)觀察CPE：將細(xì)胞板置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察細(xì)胞病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA檢測(cè)免疫后抗體水平 本試驗(yàn)用ELISA法分別測(cè)定三免和四免后第14天外周血中的CPV抗體水平。結(jié)果如圖1所示，三免及四免后血清效價(jià)均可以達(dá)到1∶25000，滿足了免疫抗體庫(kù)的制備要求。

圖1 ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)Fig 1 Detection of serum antibody titer by ELISA

2.2 VHH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 四免后外周血淋巴細(xì)胞的RNA提取結(jié)果見圖2，有明顯的28S和18S條帶(圖2A)，表明RNA質(zhì)量良好，可以用于VHH序列的擴(kuò)增。RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后，用第一輪PCR引物擴(kuò)增產(chǎn)物可見600 bp和900 bp處有的兩條帶(圖2B)，以此為模板第二輪擴(kuò)增后產(chǎn)物在400 bp有明顯條帶(圖2C)，符合VHH片段的預(yù)期大小。

A：RNA；B：First round PCR products；C：Second round PCR products圖2 VHH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。Fig 2 PCR amplification results of VHH gene.

2.3 初始抗體庫(kù)的庫(kù)容與陽(yáng)性率 取初始抗體文庫(kù)菌液10 μL，稀釋1000倍后取200 μL涂布LB(Amp+)平板，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)約為4000個(gè)，計(jì)算得出初始抗體庫(kù)的庫(kù)容約為2.0×106CFU/mL，符合免疫文庫(kù)的庫(kù)容預(yù)期，可以用于特異性噬菌體的淘選。從平板中隨機(jī)挑取48個(gè)單菌落，進(jìn)行菌液PCR鑒定，PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果見圖3，其中陽(yáng)性樣品43個(gè)，陰性樣品5個(gè)，陽(yáng)性率約為89.6%。

M：2K DNA Marker；1～48：PCR products of randomly picked colonies圖3 菌液PCR結(jié)果Fig 3 The PCR results of picked single colony

2.5 初始抗體庫(kù)的多樣性 通過DNAMAN軟件對(duì)20個(gè)陽(yáng)性單克隆的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖4所示，20條VHH基因的同源性為78.9%，CDR3區(qū)的差異較大，表明初始文庫(kù)中重鏈可變區(qū)基因的多樣性較好。通過MEGA軟件繪制序列的遺傳進(jìn)化樹，如圖5所示，各序列之間同源性差異較大，進(jìn)一步說明初始文庫(kù)的多樣性較好，可以用于特異性噬菌體的篩選。

圖4 氨基酸序列的比對(duì)分析Fig 4 Alignment analysis of amino acid sequences

圖5 序列的進(jìn)化樹分析Fig 5 Phylogenetic analysis of sequences

2.6 噬菌體單克隆檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果 ELISA檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，96個(gè)單克隆中有59個(gè)為CPV特異性的陽(yáng)性克隆，占比為61.5%，P/N值最高可以達(dá)到22，結(jié)果表明，經(jīng)過三輪淘選后可以與CPV特異性結(jié)合的高親和力重組噬菌體得到了有效的富集。

圖6 CPV特異性重組噬菌體的ELISA檢測(cè)Fig 6 The ELISA result of detection of CPV specific recombinant phage

2.7 單克隆測(cè)序 將ELISA篩選中P/N值較高的前12株單克隆菌液送基因公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7)，從中挑選出4條差異最大的序列進(jìn)行VHH的表達(dá)及鑒定，分別是CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CPV-VHH-F5和CPV-VHH-E3。

圖7 CPV序列的進(jìn)化樹分析Fig 7 Phylogenetic analysis of sequences

2.8 重組表達(dá)載體的PCR鑒定 將4條VHH目的基因與pcDNA3.1的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化， 每個(gè)平板挑取12個(gè)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，重組載體PCR產(chǎn)物大小約為400 bp(圖8)，與預(yù)期大小相符。對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，挑選序列連接正確且無突變的菌株。

M：2K DNA Marker；1～12：pcDNA3.1-VHH-H1；13～24：pcDNA3.1-VHH-E3；25～36：pcDNA3.1-VHH-D4；37～48：pcDNA3.1-VHH-F5圖8 pcDNA3.1-VHH重組表達(dá)載體的PCR鑒定Fig 8 PCR identification of pcDNA3.1-VHH recombinant expression vectors

2.9 納米抗體的表達(dá)及純化 將提取的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第二天通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組有明顯熒光，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染后第7天收獲細(xì)胞上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，EGFP對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組可見大小約30 kD的對(duì)照EGFP蛋白條帶，CPV-VHH-H1、CPV-VHH-D4、CPV-VHH-F5和CPV-VHH-E3轉(zhuǎn)染細(xì)胞組可見大小約14 kD的目的蛋白條帶(圖9)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，參照Ni-磁珠試劑盒說明書進(jìn)行親和純化，純化后的樣品可見明顯VHH目的條帶(圖10)，大小約14 kD，蛋白純度大于90%，對(duì)照蛋白并沒有被Ni-磁珠富集，結(jié)果符合預(yù)期。

M：Protein Marker；H1～F5：Supernatant of CPV-VHH-H1～F5；EGFP：Supernatant of Control plasmid圖9 細(xì)胞培養(yǎng)上清SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig 9 The SDS-PAGE results of cell culture supernatant

M：Protein Marker；F5～H1：Purified protein of CPV-VHH-F5～H1；EGFP：Purified protein of control plasmid圖10 純化后VHH的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig 10 The SDS-PAGE result of purified VHH

2.10 CPV納米抗體結(jié)合力鑒定 利用間接ELISA方法鑒定表達(dá)并純化的4株重組納米抗體，結(jié)果顯示H1 VHH抗體效價(jià)為1∶1 000，E3 VHH、D4 VHH 和F5 VHH抗體效價(jià)為1∶10 000，表明4株納米抗體均可與CPV結(jié)合(圖11)。

圖11 ELISA鑒定納米抗體結(jié)合力Fig 11 Identification nanobody binding by ELISA

2.11 IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證4株納米抗體與CPV的特異性，結(jié)果顯示4株重組的納米抗體均可與CPV特異性結(jié)合，IFA結(jié)果見圖12。

2.12 病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過對(duì)CPV的病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組納米抗體的中和活性，結(jié)果顯示4條納米抗體對(duì)CPV的中和效價(jià)均小于1∶10，初步判斷該4條VHH不具備CPV中和活性，中和抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Experimental data of VN test

3 討 論

自中國(guó)確診犬細(xì)小病毒病以來，該病呈地方性流行趨勢(shì)，發(fā)病率和死亡率各不相同。20世紀(jì)70年代，CPV-2的發(fā)病率在30%～40%，死亡率超過10%[19]。在20世紀(jì)80年代，CPV-2發(fā)病率在41.61%～100%，死亡率在3.1%～60%[20-21]。20世紀(jì)80年代CPV-2抗體陽(yáng)性率為48.92%～100%[22]。20世紀(jì)90年代至今，CPV-2臨床發(fā)病率在3.90%～95.8%之間，死亡率在20.17%～73.47%[23-25]。CPV-2抗體陽(yáng)性率40.9%～100%[26]。雖然我國(guó)寵物犬的總體發(fā)病率有所下降，死亡率卻明顯上升，表明該病毒的毒力明顯更強(qiáng)[27]。疫苗是預(yù)防該病的主要手段，但現(xiàn)有疫苗也存在一些缺陷，如弱毒疫苗存在毒株變異和毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，可能存在母源抗體的影響導(dǎo)致免疫失敗，因此，臨床仍有很多幼犬感染CPV，因此制備抗CPV的抗體一直是防治該病的研究熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)抗體通常是通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)多克隆抗體，制備工藝較為復(fù)雜，批間差異較大，而且傳統(tǒng)抗體具有分子量大、免疫原性高、穩(wěn)定性差等特點(diǎn)，應(yīng)用及發(fā)展均受限制。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和對(duì)抗體結(jié)構(gòu)的深入了解，新型的基因工程抗體不斷出現(xiàn)并被應(yīng)用在診斷及治療的各個(gè)領(lǐng)域?？贵w制備技術(shù)的發(fā)展也由傳統(tǒng)的多克隆抗體轉(zhuǎn)向單克隆抗體和基因工程抗體。越來越多的單克隆抗體被用于疾病的治療及診斷，雖然相較于多抗而言單抗具有很多優(yōu)勢(shì)，但仍然存在分子量大、具有免疫原性、組織穿透力不足和生產(chǎn)工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，因此基因工程抗體的開發(fā)工作顯得尤為重要。

A：CPV-VHH -H1；B：CPV-VHH -E3；C：CPV-VHH -D4；D：CPV-VHH -F5；E：Control of secondary antibody；F：Cell controls without virus圖12 IFA實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 12 Results of IFA

目前，人們已經(jīng)開發(fā)出了Fab抗體、Fv抗體、ScFv抗體和單域抗體等基于常規(guī)抗體結(jié)構(gòu)的基因工程抗體，并且可以在多種宿主細(xì)胞中表達(dá)和制備，但由于這些抗體VL和VH之間FR2區(qū)域的疏水性特點(diǎn)導(dǎo)致其表達(dá)時(shí)存在可溶性低、穩(wěn)定性差、易聚集等問題，影響表達(dá)產(chǎn)量，制造成本較高，不利于動(dòng)物疫病防治的開發(fā)應(yīng)用。而納米抗體的單域結(jié)構(gòu)以及親水性特點(diǎn)使其可以在多種微生物系統(tǒng)中大量表達(dá)，例如大腸桿菌、畢赤酵母和釀酒酵母等，生產(chǎn)成本較低，更適用于動(dòng)物疫病的防控[28-29]。

噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)被證明是開發(fā)和生產(chǎn)治療性抗體的最有效的技術(shù)平臺(tái)。噬菌體展示常用的噬菌體有兩種：M13絲狀噬菌體和T7裂解噬菌體，其中M13絲狀噬菌體的應(yīng)用最為廣泛。本研究選擇M13絲狀噬菌體，其感染不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的裂解，不需要經(jīng)過分泌，即可展示融合蛋白，有利于淘選過程中噬菌體的純化，從而縮短試驗(yàn)周期。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以為重組蛋白提供其他系統(tǒng)所沒有的翻譯后修飾功能，被認(rèn)為是表達(dá)重組蛋白最理想的系統(tǒng)。人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)細(xì)胞易于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，適合重組蛋白的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)，瞬轉(zhuǎn)表達(dá)量高于CHO細(xì)胞，可以更快獲得目的蛋白。本研究將4條從噬菌體文庫(kù)中篩選出的CPV特異性納米抗體序列分別插入真核系統(tǒng)表達(dá)載體pcDNA3.1中，采用PEI轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，成功表達(dá)出4條重組的納米抗體蛋白，通過Ni-磁珠親和純化方法有效純化出帶有6×His標(biāo)簽的重組納米抗體，純度>90%。

通過SDS-PAGE、ELISA、IFA以及對(duì)CPV的中和效價(jià)測(cè)定等實(shí)驗(yàn)對(duì)4條重組納米抗體進(jìn)行了生物學(xué)特性的鑒定，結(jié)果顯示通過HEK293F細(xì)胞表達(dá)的4條納米抗體均能特異性結(jié)合CPV，但不具備對(duì)CPV-2c毒株的中和活性。分析可能原因有：(1)本實(shí)驗(yàn)采用全病毒篩選出的VHH并不是識(shí)別病毒感染細(xì)胞的關(guān)鍵位點(diǎn)的抗體。VP2蛋白是CPV的免疫原性蛋白，其中包含中和抗原位點(diǎn)，可以嘗試以CPV VP2蛋白為目標(biāo)抗原，對(duì)噬菌體文庫(kù)進(jìn)行更有針對(duì)性的特異性篩選，或可獲得具有中和活性的納米抗體[30]。(2)因?yàn)榧{米抗體的分子量過小，雖然有利于結(jié)合抗原位點(diǎn)，但不足以形成有效的空間位阻效應(yīng)以阻斷病毒感染細(xì)胞的能力?？梢酝ㄟ^一些基因工程的手段對(duì)納米抗體進(jìn)行修飾，例如通過柔性連接肽段串聯(lián)納米抗體構(gòu)建多聚體或雙特異性抗體等，以提高納米抗體的功能。

本研究首次構(gòu)建了針對(duì)CPV的納米抗體免疫文庫(kù)，并在HEK293F細(xì)胞中成功表達(dá)了特異性的納米抗體，為進(jìn)一步研究其在臨床診斷和治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并為將納米抗體應(yīng)用于獸用生物制品領(lǐng)域提供了一定的理論知識(shí)。