劉雪紅

(大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連 116037)

孟布酮(4-(4-甲氧基萘-1-基)-4-氧代丁酸)屬于動(dòng)物專用利膽藥[1-2]，具有刺激動(dòng)物胃腸等消化液分泌的作用，適用于豬、羊、牛、馬、犬等的消化不良、食欲減退、便秘腹脹等胃腸機(jī)能障礙，輔助治療腸炎、中毒性肝功能受損及肝營養(yǎng)不良等疾病。長期大量使用易在動(dòng)物體內(nèi)殘留，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第284號(hào)[3]公布了最高殘留限量40 μg/kg(參照日本肯定列表制定)。獸藥主要是預(yù)防、診斷、治療動(dòng)物疾病的物質(zhì)，具有極強(qiáng)的針對(duì)性，能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物的身體機(jī)能。但隨著攝入量的增多，最終導(dǎo)致對(duì)人體慢性中毒[4]。根據(jù)《關(guān)于停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營、使用部分藥物飼料添加劑的公告》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)[5])，允許在商品飼料中使用的獸藥包括兩類：抗球蟲類藥物和中藥類藥物，孟布酮是不允許添加到飼料中的。但由于孟布酮能促進(jìn)胃腸內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)和淀粉等的消化吸收，調(diào)節(jié)胃腸機(jī)能，促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育，提高生產(chǎn)性能，很可能被添加到飼料中[6]。目前，未查到飼料中孟布酮的檢測(cè)方法[7]，本文采用WAX 固相萃取柱凈化[8]，C18色譜柱分離，高效液相色譜法檢測(cè)飼料中孟布酮[9]。分析速度快、回收率高，能滿足育肥豬配合飼料中孟布酮檢測(cè)定性、定量的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 電子天平RD-200，德國 Sartorius公司；超聲波清洗器KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)CF16RN，日立公司；氮吹儀N-EVAP，美國Organomation；數(shù)顯強(qiáng)力渦旋混合器MS3，德

國IKA公司；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀2695，美國Waters公司；色譜柱Sunfire C18(4.6×250 mm，5 μm)，美國Waters公司；固相萃取柱 Oasis WAX 3 mL 60 mg，美國Waters公司。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 孟布酮(C15H14O4，CAS號(hào)：3562-99-0)批號(hào)11462103 76654，含量99.90%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 空白樣品 育肥豬配合飼料，經(jīng)檢測(cè)不含孟布酮。

1.2.2.2 空白添加樣品 分別按照0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、2 mg/kg的比例在空白樣品中添加孟布酮，混勻。

1.2.3 試劑 甲醇、乙腈色譜純，氨水、磷酸分析純，水為符合GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。

1.2.3.1 0.5%磷酸溶液：量取5.0 mL磷酸于1000 mL水中，混勻。

1.2.3.2 0.5%氨水溶液：取氨水0.5 mL，加水至100 mL，混勻即可。

1.2.3.3 9%氨化甲醇溶液：取氨水9 mL，加甲醇至100 mL,混勻即可。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL)：精密稱取孟布酮標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度。保存于-20 ℃，有效期為3個(gè)月。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(100 μg/mL)：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，保存于-20 ℃，有效期為3個(gè)月。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取孟布酮標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇稀釋成濃度為0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.7 微孔濾膜：有機(jī)系，孔徑0.22 μm。

1.3 樣品檢測(cè)

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 提?。簻?zhǔn)確稱取飼料樣品2.00±0.02 g，加乙腈10 mL，超聲10 min，8000 r/min，離心10 min，取上清液。重復(fù)提取1次。合并2次提取的上清液，取上清液10 mL，50 ℃氮?dú)獯蹈?，殘留物中加?. 5 %氨水溶液5 mL，渦旋5 min，得到待凈化液，備用。

1.3.1.2 凈化：將WAX固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL進(jìn)行活化；待凈化液5 mL上樣；用甲醇3 mL淋洗，抽干；9%氨化甲醇溶液3 mL洗脫，抽干。收集洗脫液，50 ℃氮?dú)獯蹈桑尤爰状? mL復(fù)溶，渦旋5 min，濾過，濾液供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.3.2 液相色譜條件 色譜柱Sunfire C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長：236 nm，流速：1.0 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=78664x-552.56，線性相關(guān)系數(shù)r為0.999 8，孟布酮的線性范圍為0.2 μg/mL～10.0 μg/mL。

2.2 檢測(cè)限和定量限 添加適量標(biāo)準(zhǔn)液于空白飼料中，經(jīng)提取后測(cè)定。根據(jù)信躁比S/N>3為檢測(cè)限，信躁比S/N>10為定量限，檢測(cè)到孟布酮的檢測(cè)限為0.06 mg/kg，定量限為0.2 mg/kg?？瞻罪暳现刑砑?.2 mg/kg的孟布酮色譜圖見圖1。

圖1 空白飼料中添加0.2 mg/kg的孟布酮色譜圖Fig 1 Chromatogram of 0.2 mg / kg montebutone added to blank feed

2.3 回收率及重復(fù)性試驗(yàn) 在空白飼料中進(jìn)行3濃度(0.2，0.4，2 mg/kg)回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度6個(gè)平行，連續(xù)測(cè)定3批，其平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。從表看出孟布酮的添加回收率在78.1%～90.6%之間[10]，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1 mg/mL)進(jìn)行了為期3個(gè)月的穩(wěn)定性試驗(yàn)。每次試驗(yàn)時(shí)，臨時(shí)稀釋，每周配置標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(0.2 μg/mL，0.5 μg/mL，2.0 μg/mL，5.0 μg/mL，10.0 μg/mL)，按照上述儀器條件測(cè)定，記錄峰面積，取峰面積與濃度做線性回歸。共進(jìn)行了14次標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，見圖2。3個(gè)月內(nèi)每個(gè)濃度溶液的峰面積無顯著變化。同時(shí)對(duì)儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(100 μg/mL)進(jìn)行同樣試驗(yàn)，結(jié)果一致。因此，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1 mg/mL)和標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(100 μg/mL)的保存條件均為：-20 ℃保存時(shí)間為3個(gè)月

圖2 孟布酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液保存時(shí)間與峰面積比較圖Fig 2 Comparison of storage time and peak area of montebutone standard solution

2.4.2 上機(jī)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(2 μg/mL)和試樣溶液(2 μg/mL)進(jìn)行了24小時(shí)的穩(wěn)定性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，室溫條件下24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及試樣液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 stability test results of standard working solution and sample solution(n=6)

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相中有機(jī)相的確定 考察兩種最常用有機(jī)相：乙腈和甲醇。結(jié)果顯示，二者對(duì)孟布酮的響應(yīng)及分離效果基本一致；但選用甲醇時(shí)，系統(tǒng)壓力較高，同時(shí)噪聲較乙腈大。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為流動(dòng)相。

3.2 流動(dòng)相組成中水相的確定 考察2種水相體系對(duì)結(jié)果的影響：0.2%甲酸，0.5%磷酸，2.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖見圖3和圖4。結(jié)果顯示以0.2%甲酸，0.5%磷酸為水相，分離效果及響應(yīng)值基本一致，但含甲酸時(shí)基線向下漂移，不穩(wěn)定，且有明顯雜質(zhì)峰。因此在上機(jī)過程中，在流動(dòng)相中引入磷酸。

圖3 2.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖(0.2%甲酸為流動(dòng)相)Fig 3 Chromatogram of 2.0 μg/mL standard solution(mobile phase by 0.2%formic acid)

圖4 2.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖(0.5%磷酸為流動(dòng)相)Fig 4 Chromatogram of 2.0 μg/mL standard solution(mobile phase by 0.5% phosphoric acid)

3.3 流動(dòng)相洗脫方式的確定 比較了等度(0.5%磷酸：乙腈=64：36)和梯度(表1)兩種洗脫方式，考察了2.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液在兩種洗脫方式下情況，見圖4和圖5。結(jié)果表明，兩種洗脫方式下孟布酮與雜質(zhì)都能達(dá)到有效分離，峰形好；但等度洗脫孟布酮保留時(shí)間較長為19 min，梯度洗脫保留時(shí)間為7 min?？紤]試驗(yàn)效率，本研究選擇梯度洗脫方式。

圖5 等度2.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖Fig 5 Chromatogram of 2.0 μg/mL standard solution(isocratict elution)

3.4 檢測(cè)波長的選擇 對(duì)孟布酮2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描，見圖6，最大吸收波長為235.8 nm。本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)波長為236 nm。

圖6 孟布酮光譜圖Fig 6 Spectrum of menbutone

3.5 提取溶劑的選擇 乙腈對(duì)大多數(shù)獸藥提取效果較好，提取樣品時(shí)提取液基質(zhì)效應(yīng)較低，而且乙腈能較好地使蛋白質(zhì)凝聚變性從而沉淀蛋白；與純乙腈相比，在提取液中加入酸，使呈酸性，提高提取效率[11]；同時(shí)考慮到甲醇對(duì)孟布酮的溶解性與乙腈類似，且其沸點(diǎn)較乙腈低，更易吹干濃縮?；谝陨侠碛桑容^4種提取溶劑：乙腈、0.2% 甲酸乙腈、0.5% 磷酸乙腈、甲醇?？瞻罪暳现刑砑?.2 mg/kg，4種溶劑的提取效率沒有顯著差異。但甲醇為提取溶劑時(shí)，提取液雜質(zhì)較多、混濁呈淡黃色，過固相萃取柱困難，凈化時(shí)間長，因此本研究選擇乙腈為提取溶劑。

3.6 提取次數(shù)選擇 比較提取液量10 mL，提取1、2、3次。3種添加濃度下孟布酮回收率及重復(fù)性情況(0.2 mg/kg，0.4 mg/kg，2 mg/kg)，每水平添加重復(fù)三次，效果見表4。提取1次，在添加較低濃度(0.2 mg/kg和0.4 mg/kg)時(shí)，回收率及RSD均滿足要求；但較高濃度2.0 mg/kg，回收率小于70%，且重復(fù)性差。當(dāng)提取2次與3次時(shí)，3種添加水平回收率和RSD均滿足要求，選擇提取2次。

表4 不同提取次數(shù)考察結(jié)果表Tab 4 Investigation results of different extraction times

3.7 離心速度與時(shí)間的確定 WAX固相萃取柱較常用的HLB、MCX固相萃取柱，溶液過柱時(shí)間長，離心的效果對(duì)凈化時(shí)間影響很大。如果離心轉(zhuǎn)速低、時(shí)間短，凈化時(shí)間太長，影響試驗(yàn)；因此未選擇低轉(zhuǎn)速、短時(shí)間試驗(yàn)。離心時(shí)間10 min的情況下，比較了4種離心速度：6000 r/min，7000 r/min，8000 r/min，9000 r/min，提取情況見表5?；厥章蕸]有顯著差異。但前兩種轉(zhuǎn)速下凈化時(shí)間大概需要50分鐘，后兩種轉(zhuǎn)速下凈化時(shí)間約30分鐘。因此選擇8000 r/min，離心10 min。

表5 不同離心速度考察結(jié)果表Tab 5 Investigation results of different centrifugal speeds

3.8 氮吹溫度選擇 比較5種氮吹溫度：35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃，對(duì)結(jié)果的影響。不同氮吹溫度之間提取效率沒有顯著差異，回收率均大于70%。不同氮吹溫度所用時(shí)間情況見圖7?？紤]效率和成本，本實(shí)驗(yàn)選擇50 ℃氮吹。

圖7 氮吹溫度與時(shí)間Fig 7 Nitrogen blowing temperature and time

3.9 復(fù)溶液的比較 考察3種溶劑下的復(fù)溶效率：0.5%磷酸-乙腈溶液(64∶36)、乙腈、甲醇。分別考察3種添加濃度下孟布酮回收率情況(0.2 mg/kg，0.4 mg/kg，2 mg/kg)，效果見表6。利用甲醇作為復(fù)溶液，3個(gè)水平添加孟布酮的回收率都大于80%，滿足要求。本研究選擇甲醇作為復(fù)溶液。

表6 不同復(fù)溶液考察結(jié)果Tab 6 Investigation results of different complex solutions

3.10 實(shí)際樣品檢測(cè) 對(duì)2021年市監(jiān)督抽查的16家企業(yè)的22批育肥豬配合飼料進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出孟布酮。

3.11 結(jié)論 該檢測(cè)方法，定量限為0.2 mg/kg，在0.2，0.4，2 mg/kg添加水平下，育肥豬配合飼料中孟布酮平均回收率為78.1%～90.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單、快速、有效，適合大批量日常分析檢測(cè)。