楊宇珂 劉良裕 崔秀梅 顧 選 王建農 付建華*

三銀芪丹顆粒是由黃芪、丹參、三七、當歸、銀杏葉等中藥經加工制成的顆粒劑，具有益氣活血的功效，適用于中風、恢復期屬氣虛血瘀證患者的康復和輔助治療，癥見半身不遂、舌強語蹇、氣乏力短、自汗等。目前，根據原國家食品藥品監(jiān)督管理局相關標準，采用薄層色譜法（TLC）鑒別，對三銀芪丹顆粒中黃芪、丹參和三七進行質量控制，采用高效液相色譜法（HPLC）對黃芪中黃芪甲苷含量進行控制。但上述質量控制方法存在方法較為簡單，專屬性不強的問題，無法全面反映和控制三銀芪丹顆粒的質量。故本研究針對現行質量標準WS-5066（B-0066）-2014Z 中的鑒別項目進行驗證，同時建立鑒別丹參藥材中丹參素鈉的TLC 及測定丹參素鈉含量的HPLC，為三銀芪丹顆粒質量標準的完善及提升提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 1200、1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；AUW220D 型萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；XZ-6DTD 型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠，規(guī)格為10 cm×10 cm、10 cm×20 cm）。

三銀芪丹顆粒（華頤藥業(yè)有限公司，批號為190101、190102、190103）；丹參素鈉對照品（批號為110855-201614），人參皂苷Re 對照品（批號為110754-200320），人參皂苷Rg1 對照品（批號為110703-200322），人參皂苷Rb1 對照品（批號為110704-200318），均購自中國食品藥品檢定研究院；三七皂苷R1 對照品（批號為P27J9F64476）購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 丹參的TLC 鑒別取本品0.5 g，加水1 ml，鹽酸2 滴，振搖溶解，加乙酸乙酯3 ml，萃取，分層完全后取上層過濾，即得供試品溶液。另取丹參素鈉標準品，加入75%甲醇制得1.0 mg/ml 的丹參素鈉標準品溶液。取丹參陰性樣品0.8 g 干膏粉（相當于顆粒1 g），加水2 ml 和稀鹽酸3～4 滴振搖使溶解，加入乙酸乙酯6 ml，萃取，分層后取上清液，即為丹參陰性樣品溶液。參考TLC（中華人民共和國藥典2015 版四部0502 通則）試驗，在同一硅膠G 板上，分別吸取10 μl 供試品溶液和2 μl 標準品溶液進行點樣。展開劑選擇三氯甲烷-丙酮-甲酸（25∶10∶4）進行展開，展開后取出，并晾干。將薄層板置于氨蒸汽中，氨熏15 min，放置30 min 后，于紫外光（365 nm）下檢視。

1.2.2 三七的TLC 鑒別取本品2 g，研細，加至具塞錐形瓶中，用50 ml 甲醇進行溶解，超聲處理30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加水20 ml 使溶解，轉移至分液漏斗中，用20 ml 乙醚振搖提取，重復2 次，再用20 ml 水飽和正丁醇振搖提取，重復3 次，合并正丁醇提取液，用20 ml 氨試液洗滌，重復2 次，再用20 ml 正丁醇飽和的水洗滌，重復2 次，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 ml 使溶解，即得供試品溶液。另取人參皂苷Rb1 對照品、人參皂苷Re 對照品、人參皂苷Rg1 對照品和三七皂苷R1 對照品，加入甲醇制得各成分濃度均為0.5 mg/ml 的混合對照品溶液。按處方工藝制備缺三七藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法得到陰性對照溶液。參考薄層色譜法（中國藥典2015年版四部0502 通則）試驗，在同一硅膠G 薄層板上，分別吸取5 μl 供試品溶液、混合對照品溶液和陰性對照溶液進行點樣，展開劑選擇三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液，放置于10 ℃以下進行展開，展距15 cm，取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液作為顯色劑，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。

1.2.3 丹參素鈉含量測定

1.2.3 .1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%醋酸水溶液（3∶97）；流速：1 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μl。理論板數按丹參素鈉峰計算應不低于3 000。

1.2.3 .2 溶液制備精密稱定丹參素鈉對照品粉末，加50%甲醇制成40 μg/ml 的丹參素鈉溶液，即得對照品溶液。取裝量差異項下的本品，混勻，研細，取約3 g，精密稱定后，置具塞錐形瓶中，精密加入25 ml 的50%甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷后，再次精密稱定，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。取方中去除丹參的各藥味，按處方比例及制備工藝制得陰性樣品，取該陰性樣品，制備方法同供試品溶液一致，制得陰性對照品溶液。

1.2.3 .3 方法學考察1）專屬性考察：分別進樣測定丹參素鈉對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，并記錄色譜圖。2）線性關系考察：精密吸取已配制好的丹參素鈉對照品貯備液0.5、1、2、3、4、8 ml 于5 ml 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，按“1.2.3.1”項下色譜條件進行進樣和測定，以對照品溶液濃度（μg/ml）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）計算線性回歸方程。3）精密度試驗：精密吸取供試品溶液（批號190102），按“1.2.3.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次，分別記錄丹參素鈉色譜峰面積。4）重復性試驗：取同一批號（190102）的三銀芪丹顆粒6 份，按“1.2.3.2”項下供試品溶液制備方法，新制的6 份供試品溶液，按“1.2.3.1”項下色譜條件分別進樣測定，計算6 份供試品溶液中丹參素鈉的含量，并計算平均值及相應的相對標準偏差（RSD）值。5）重現性試驗：不同實驗室、不同儀器、不同分析人員下，按“1.2.3.1”項下色譜條件，精密吸取已配制好的供試品溶液（批號190102），連續(xù)進樣6 次，分別記錄丹參素鈉的色譜峰面積。6）穩(wěn)定性試驗：將已配制好的供試品溶液（批號為190102），于室溫放置，在制備后0、2、4、6、8、10 和12 h 時，按“1.2.3.1”項下色譜條件，精密吸取5 μl，注入高效液相色譜儀，記錄丹參素鈉的色譜峰面積。7）加樣回收試驗：精密稱取同一批已知含量的三銀芪丹顆粒（批號為190102，丹參素鈉含量1.09 mg/g）1 g，6 份，各組再加入丹參素鈉對照品溶液（前期配制時標準品儲備液濃度為0.2 mg/ml）5 ml，依法制得供試品溶液。再按外標一點法測定，計算丹參素鈉的加樣回收率。

1.2.3 .4 含量測定采用HPLC 測定公司生產的3 批（190101、190102、190103）三銀芪丹顆粒的丹參素鈉含量。

2 結果

2.1 丹參的TLC 鑒別

供試品在和對照品相應位置的薄層色譜上，顯示相同顏色斑點，陰性對照無相應顏色斑點。見圖1A。

2.2 三七的TLC 鑒別

供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯示相同顏色斑點，陰性對照無相應顏色斑點。見圖1B。

圖1 薄層色譜

2.3 丹參素鈉含量測定

2.3.1 方法學考察1）專屬性考察：供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間內出現丹參素鈉色譜峰，而丹參陰性對照品溶液色譜圖在丹參素鈉的位置無吸收峰，表明方法專屬性良好。見圖2。

圖2 高效液相色譜

2）線性關系考察：回歸方程Y= 6.648 2X+5.341 1（R2=0.999 9）。表明在20～200 μg/ml 的濃度范圍內丹參素鈉線性關系良好。3）精密度試驗：結果顯示丹參素鈉RSD 值為2.14%（n=6），表明儀器精密度良好。4）重復性試驗：結果表明，丹參素鈉平均含量為1.09 mg/g，RSD 值為1.66%（n=6），說明方法重復性良好。5）重現性試驗：計算RSD 值為3.15%（n=6），表明該方法重現性良好。6）穩(wěn)定性試驗：計算RSD 值為2.75%（n=6），表明本實驗條件下12 h內測定，樣品穩(wěn)定性良好。7）加樣回收試驗：計算平均回收率為103.28%，RSD 值為1.59%（n=6），表明該方法回收率良好。見表1。

表1 三銀芪丹顆粒加樣回收率試驗結果

2.3.2 含量測定結果表明，3 批樣品中丹參素鈉含量均高于1.0 mg/g，樣品檢驗結果符合規(guī)定。見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討論

中藥制劑由于藥材成分復雜，有效成分不明確，制備工藝繁瑣且劑型豐富，使其在質量控制上受到較多限制[1]。本品原質量標準中選擇原兒茶醛作為丹參的薄層鑒別指標成分，然而前期實驗發(fā)現在儲存期間，原兒茶醛含量不穩(wěn)定，采用TLC 難以檢測到斑點且專屬性較差，且受展開劑組成影響易導致假陰性現象，故考慮選擇丹參中活血化瘀有效成分丹參酮ⅡA、丹酚酸B、丹參素鈉作為薄層檢測指標成分[2-3]。通過前期文獻調研和條件摸索，同時參考三銀芪丹顆粒的水提醇沉提取工藝發(fā)現，由于丹參酮ⅡA 為脂溶性成分，丹酚酸B 雖為水溶性成分但熱不穩(wěn)定，故兩者在薄層鑒別中均未發(fā)現目標成分，最終選擇丹參素鈉為對照品進行薄層鑒別和含量測定[4-6]。此外，在前期的預實驗中，銀杏葉的TLC 鑒別參照2015 版《中華人民共和國藥典》[7]中方法，標品斑點清晰，但樣品斑點未能與標品完全對應，改變取樣量及供試品制備方法均無法改善實驗現象，故未列入正文。

在考察丹參TLC 鑒別方法時，分別對點樣量、薄層板品牌、展開劑比例、氨氣熏蒸時間是否影響樣品斑點進行實驗，結果顯示本研究所建立方法具有特征斑點清晰，分離度好，耐用性強，成熟可靠的特點。

丹參素鈉是丹參發(fā)揮活血化瘀、理氣止痛藥效的主要成分之一[8]。在流動相選擇時，文獻多采用乙腈（甲醇）-磷酸（醋酸）-水系統(tǒng)[9-10]。經前期實驗對比考察，最終選出分離效果好、保留時間適中的甲醇-1%醋酸水溶液系統(tǒng)作為流動相。對提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇）和提取時間（10、20、30 min）進行篩選時，發(fā)現提取溶劑對丹參素鈉的測定無顯著影響，而提取時間在較短時刻樣品溶解不充分，故最終選擇提取條件為50%甲醇作為提取溶劑，提取時間為30 min。同時還考察不同流動相比例（2∶98、3∶97、4∶96）、不同色譜柱（資生堂SPOLAR 柱、資生堂CAPCELL PAK C18色譜柱、資生堂SUPERRIOREX ODS 柱）、不同柱溫（30、35、40 ℃）、不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）、不同檢測波長（275、280、285 nm）對于丹參素鈉含量測定的影響，結果各色譜條件下，柱溫、流速及波長的變化對測量結果無干擾，而流動相比例則應控制為甲醇-1%醋酸水（3∶97），色譜柱則應選擇CAPCELL PAK C18柱，表明該方法耐用性較好。

在吸收波長的選擇上，在波長210～400 nm 范圍內掃描，結果顯示丹參素鈉在280 nm 處出峰完全，有最大吸收，故選擇280 nm 作為檢測波長。

綜上所述，在三銀芪丹顆粒現行質量標準基礎上，對丹參的TLC 鑒別項進行了修訂和完善，并建立了有效成分指標丹參素鈉的含量測定。本研究建立的方法專屬性強，重復性、精密度、穩(wěn)定性均較好，且簡單易行，質量可控，為完善和提升三銀芪丹顆粒質量標準提供了依據。