王雨琪 ，張靜波 ，陸悅 ，張敏 ，黃強(qiáng) *

（1.南通市水產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，江蘇 南通 226000；2.南通市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇 南通 226000）

硝基呋喃類抗生素是人工合成的具有5-硝基結(jié)構(gòu)的抗生素。因價(jià)格低廉，廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1-3]。治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引起的腸炎、疥瘡、赤鰭病和潰瘍病等。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物具有毒性，可引起嘔吐和腹瀉，長(zhǎng)時(shí)間大劑量使用可致突變、致畸和致癌[4]，2002 年4 月，原農(nóng)業(yè)部第193 號(hào)公告將硝基呋喃類抗菌劑列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》[5]。因硝基呋喃類藥物的自身代謝特性和代謝物結(jié)構(gòu)特殊性，需對(duì)其進(jìn)行水解衍生化后的衍生物進(jìn)行檢測(cè)定量。目前實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)手段有液液萃取液相色譜法、固相萃取液相色譜法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法以快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特性，廣泛應(yīng)用于硝基呋喃類代謝物的定量測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)方法中，樣品前處理方法復(fù)雜，步驟煩瑣，反應(yīng)條件對(duì)pH 值要求較高，實(shí)際操作中多有不便。且動(dòng)物源性食品種類多、范圍廣，例行抽檢和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)量大，耗時(shí)多?，F(xiàn)通過(guò)對(duì)水解衍生條件和萃取條件pH 值進(jìn)行優(yōu)化，可節(jié)約試驗(yàn)成本，提高前處理效率，縮短大批量樣品的檢測(cè)時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、2-硝基苯甲醛、醋酸銨、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亞砜均為色譜純；磷酸氫二鉀、濃鹽酸（36%～38%）、氫氧化鈉等均為分析純；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：4 種硝基呋喃類代謝物，包括呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、呋喃它酮的代謝物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、呋喃西林的代謝物氨基脲（SEM）及呋喃妥因的代謝物 1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）（純度＞99%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）。使用前根據(jù)檢測(cè)要求，用流動(dòng)相稀釋配制成20 mg/L 的混標(biāo)工作溶液，所使用的內(nèi)標(biāo)分別為4 種硝基呋喃代謝物同位素內(nèi)標(biāo)，使用前用甲醇作溶劑配制成濃度為200 mg/L的混標(biāo)溶液。

1.2 儀器

液相色譜系統(tǒng)（Agilent Technologies 1290）；串聯(lián)質(zhì)譜（Agilent Technologies 6470 Triple Quad LC/MS）；色譜柱（Agilent Eclipse Plus C18 2.1mm×50 mm，1.8 μm），酸度計(jì)，氮吹儀，高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

分別準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.01 g）草魚樣品（可食用部位）15 份，于 50 mL 離心管中，加入 250 μL內(nèi)標(biāo)混合液、5 mL 0.07 mol/L 鹽酸溶液和150 μL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋1 min，置于恒溫振蕩器中，37 ℃避光振蕩16 h。

反應(yīng)完成后，取出離心管并冷卻至室溫，再加入不同體積的磷酸二氫鉀緩沖液和氫氧化鈉溶液,將衍生化后的樣品分為5 個(gè)梯度濃度，每個(gè)濃度范圍平行樣本 3 個(gè)，分別調(diào)節(jié) pH 值至 3～5，6～7，7.5，8～10，11～12，之后再加入 8 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻1 min，5 000 r/min 離心5 min。取上層乙酸乙酯到15 mL 離心管中，在40 ℃水浴條件下氮吹至近干，加入1 mL 5%甲醇水溶液將其復(fù)溶，渦旋振蕩1 min，再加入5 mL 正己烷，渦旋振蕩30 s，5 000 r/min離心5 min。過(guò)0.22 μm 濾膜后上機(jī)測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液也按樣品前處理方法，進(jìn)行同樣的衍生化和提取過(guò)程。

1.3.2 色譜條件設(shè)定

流動(dòng)相A 相為5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）；B 相為甲醇。梯度洗脫程序?yàn)椋涸?～1.0 min內(nèi)，B 相由 10%提升為 20%；在 1.0～5.0 min 內(nèi)，B 相由 20%提升為 100%；在 5.0～6.0 min 內(nèi)，B 相維持在100%；在6.0～6.1 min 內(nèi)，B 相由100%降至10%。整個(gè)梯度洗脫程序中的流量為0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積 10 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件設(shè)定

質(zhì)譜采用電噴霧 ESI（+）的方式，噴霧電壓4 000 V，碰撞氣體為高純氮?dú)?；鞘氣溫度?70 ℃，氣流量12 L/min；霧化氣：0.24 MPa，4 種硝基呋喃類代謝物質(zhì)譜條件詳見表1。

表1 4 種代謝物質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化條件的優(yōu)選及分析

研究表明[6]，硝基呋喃類藥物能迅速代謝水解，半衰期為0.5 h 到1 h 不等。水解后，這些代謝物能在肉源性組織中殘留很長(zhǎng)一段時(shí)間，并與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)合物[7]。在實(shí)驗(yàn)室處理的過(guò)程中，通過(guò)加入鹽酸、三氯乙酸等酸性試劑，使硝基呋喃類代謝物與蛋白的結(jié)合物在酸性條件下，水解成游離態(tài)的代謝物，其相對(duì)分子質(zhì)量為75～244。由于小分子不易產(chǎn)生具有典型特征的離子碎片，ESI 離子模式背景噪聲高，直接檢測(cè)靈敏度較低，因此，對(duì)代謝物進(jìn)行衍生化處理。衍生試劑2-硝基苯甲醛的分子結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)醛基（-CHO），在酸性條件下，-CHO 可與硝基呋喃代謝物的含氮親和基團(tuán)氨基（-NH）發(fā)生醛胺親核加成反應(yīng)，形成較好的特性衍生物，代謝過(guò)程見圖1[8]。經(jīng)衍生后，分子離子質(zhì)荷比均＞200，處于相對(duì)適于檢測(cè)的質(zhì)量區(qū)域。

水產(chǎn)動(dòng)物死亡后，血液循環(huán)停止，溶解氧含量降低，肌肉中的糖原因缺氧發(fā)生糖酵解，生成乳酸，導(dǎo)致肌肉的pH 值從約7.4 下降至6.0 以下[9]。而在儲(chǔ)存過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移，蛋白酶和一些堿性細(xì)菌分解水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)，并產(chǎn)生堿性化合物（氨類化合物和三甲胺等），使水產(chǎn)品肌肉中的pH值逐漸增加[10-12]。鹽酸具有強(qiáng)酸性，能將水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物從蛋白中解離出來(lái)，且價(jià)格低廉，較易獲得，考慮到實(shí)驗(yàn)室批量處理樣本和水產(chǎn)品儲(chǔ)藏的特點(diǎn)，選取鹽酸為衍生化反應(yīng)提供酸性條件，在樣品處理時(shí)加入5 mL 0.07 mol/L 的鹽酸溶液。

2.2 萃取pH 值對(duì)回收率和離子信號(hào)強(qiáng)度的影響

2.2.1 對(duì)回收率的影響

不同pH 值下4 種代謝物的回收率見圖2（a）（b）（c）（d）。硝基呋喃類代謝物在酸性條件下完成衍生化反應(yīng)后，試樣溶液的pH 值對(duì)提取和凈化效率有較大影響。通過(guò)酸度計(jì)測(cè)定，衍生化后的液體pH 值2.0～3.0，通過(guò)加入不同體積的1 mol/L KHSO4和 0.5 mol/L NaOH 溶液，將 pH 值調(diào)至 3.0～5.0，6.0～7.0，7.5，8.0～10.0 和 11.0～12.0，進(jìn)行前處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng) pH 值＜6.0 時(shí)，AMOZ 的回收率偏高，誤差較大；pH 值為 6.0～10.0 時(shí)，4 種代謝物的萃取效率較為穩(wěn)定，萃取情況更符合實(shí)際添加情況；當(dāng)pH 值＞10.0 時(shí)，AHD 無(wú)法從水相萃取至乙酸乙酯層中，影響后續(xù)的測(cè)定。當(dāng) pH 值為 6.0～7.0 時(shí)，AMOZ 和 AOZ 的的萃取效率最高，其中AMOZ 為98.31%，AOZ 為99.14%；當(dāng) pH 值為 7.5 時(shí)，AHD和SEM 的萃取效率最高，其中AHD 為100.73%，SEM 為97.92%。綜合來(lái)看，AMOZ 和AHD 對(duì)pH 值的敏感度相對(duì)較高，AOZ 和 SEM 對(duì) pH 值的敏感度相對(duì)較低，pH 值為6.0～10.0 時(shí)，4 種代謝物的回收率較好。

圖2 不同pH 值下4 種代謝物的回收率

2.2.2 對(duì)離子信號(hào)強(qiáng)度的影響

不同pH 值下4 種代謝物的離子信號(hào)強(qiáng)度見圖3（a）（b）（c）（d）。由圖 3 可見，AMOZ 在 pH 值為3.0～5.0 時(shí)響應(yīng)值最低，相比較高pH 值條件下的離子強(qiáng)度，信號(hào)為 3×104，這也解釋了 AMOZ 在該 pH 值時(shí)，回收率和真實(shí)添加情況的誤差較大；隨著pH值升高，響應(yīng)程度逐漸升高，pH 值為6.0～12.0 時(shí)，響應(yīng)程度受pH 值影響較小。AHD 隨著pH 值的升高響應(yīng)值逐漸降低，當(dāng)pH 值＞8.0 時(shí)，響應(yīng)信號(hào)在100 左右；當(dāng)pH 值＞10.0 時(shí)，無(wú)法在萃取液中檢測(cè)出AHD。AOZ 和SEM 的響應(yīng)情況受pH 值變化影響較小，但整體在弱堿性的萃取條件下，響應(yīng)值最高。綜合看來(lái)，在 pH 值為 6.0～7.5 時(shí)，4 種代謝物的離子信號(hào)強(qiáng)度較高，數(shù)據(jù)誤差較小。

圖3 不同pH 值下4 種代謝物的離子信號(hào)強(qiáng)度

2.3 精密度、重復(fù)性和回收率

取4 種硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按照1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，12.00，16.00 和 20.00 μg/L的質(zhì)量濃度進(jìn)行稀釋，并按照2.1 節(jié)、2.2 節(jié)條件進(jìn)行前處理，測(cè)定得到4 種代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表2。

選用草魚魚肉基質(zhì)進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)。在空白基質(zhì)中加入5.0 μg/kg 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后靜置，使樣品充分吸收標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按照2.1 節(jié)、2.2 節(jié)條件進(jìn)行前處理，并上機(jī)測(cè)定。平行樣本3 個(gè)，添加水平測(cè)定5 次，計(jì)算加標(biāo)回收率范圍和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。由表2 可見，4 種代謝物的平均回收率為98.147%～100.729%，連續(xù)測(cè)定 RSD 為0.228%～2.482%，平行樣RSD 為1.129%～2.895%，說(shuō)明在該萃取pH 值下，添加回收率、精密度和重復(fù)性良好。

表2 4 種代謝物線性關(guān)系及回收結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

在其他探究硝基呋喃類代謝物衍生化過(guò)程中梯度調(diào)節(jié)pH 值對(duì)提取效率影響的試驗(yàn)中，pH 值調(diào)節(jié)范圍過(guò)大，可能會(huì)影響代謝物的提取和檢測(cè)；pH 值調(diào)節(jié)范圍過(guò)小，批量試驗(yàn)時(shí)時(shí)間成本較高。例如陳明明[13]在豬肉和蝦肉樣品基質(zhì)中，不調(diào)節(jié)酸度，在pH 值為3.0～7.0 時(shí)萃取，AMOZ 的離子信號(hào)強(qiáng)度較弱，平均加標(biāo)回收率為127.20%，超出70%～120%的合理范圍；楊鵬[14]在pH 值為7.0～8.0 時(shí)進(jìn)行梯度試驗(yàn)，選擇合適的萃取 pH 值（7.2±0.2），對(duì) 4 種硝基呋喃類代謝物的離子信號(hào)強(qiáng)度和回收率影響不大，對(duì)大批量樣本進(jìn)行pH 值精準(zhǔn)調(diào)節(jié)的時(shí)間成本較高。

為更加高效地檢測(cè)4 種硝基呋喃類代謝物，確?；厥章屎蛿?shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，本試驗(yàn)通過(guò)調(diào)節(jié)水產(chǎn)品硝基呋喃類代謝物提取過(guò)程中的pH 值，確定衍生化后萃取的最佳值為6.0～7.5，獲得了滿意的萃取效果和檢測(cè)靈敏度。其回收率、精密度、重復(fù)性均滿足殘留分析的要求，且通過(guò)試驗(yàn)，選取較為寬泛的pH 值調(diào)節(jié)范圍，可方便快捷、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定地進(jìn)行大批量樣品試驗(yàn)。