朱振興,曲匡正,李 丹,王春語,白春明,陸曉春
(遼寧省作物分子改良重點實驗室/遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所,沈陽遼寧 110161)
高粱是全球五大作物之一,在我國也是重要的雜糧作物[1]。高粱具有耐瘠薄、耐旱、耐鹽等特性,一般種植于邊際土地上,對利用瘠薄、干旱、鹽堿的土地有重要影響[2]。另一方面,高粱在我國白酒釀造、國民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)整及扶貧工作中占有重要地位[3]。鉀是植物三大重要元素之一,是植物細(xì)胞中主要的無機離子,在干質(zhì)量中最高能占10%[4]。鉀離子在植物體內(nèi)作用廣泛,對植物的生長、發(fā)育、代謝、抗性等方面都有重要影響。鉀離子參與一些酶的激活、維持蛋白的合成、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的pH值的動態(tài)平衡等過程[5]。還參與韌皮部運輸有機溶液,如參與蔗糖從地上運輸?shù)礁康倪^程中,或是運輸?shù)焦麑嵉纫恍皫臁苯M織的過程中起重要的作用[6]。在調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓、調(diào)控滲透壓的變化、維持細(xì)胞電荷平衡,影響細(xì)胞的生長,影響細(xì)胞對環(huán)境的反應(yīng),如氣孔運動、向光性、向地性和細(xì)胞伸長等[7]。
根系是植物吸收鉀的主要組織器官,從根系表皮和皮層細(xì)胞吸收鉀,然后運輸?shù)街兄?,通過中柱將鉀養(yǎng)分輸送到需要的組織和器官[8]。由于脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜是不可滲透離子,所以鉀必須通過膜上的特異轉(zhuǎn)運蛋白才能進入根中[9]。現(xiàn)在一般認(rèn)為高親和性鉀吸收系統(tǒng)主要是由質(zhì)膜上的鉀轉(zhuǎn)運體參與,如HAK5鉀離子轉(zhuǎn)運體[10],可能也有離子通道參與;而低親和性鉀吸收系統(tǒng)主要是質(zhì)膜上的鉀離子通道,如離子通道蛋白AKT1[11],一般被認(rèn)為是被動運輸過程,不需要消耗ATP。位于膜上的鉀離子通道可能構(gòu)成了低親和性鉀吸收系統(tǒng)[12]。另一方面,鉀吸收系統(tǒng)也受轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。鉀離子的吸收利用分子機制在水稻中和擬南芥中有相對深入的研究,但在高粱中基本不清楚[13]。鉀肥相對價格較貴,當(dāng)季利用率約為50%[14],其余的鉀肥被浪費并排放到環(huán)境中,不經(jīng)濟也不環(huán)保。作物缺鉀時,葉片上一般可見發(fā)黃、褐色斑點,葉尖、葉緣呈現(xiàn)褐色小斑點,然后逐步褐變枯死,而且老葉比新葉癥狀更嚴(yán)重,最終嚴(yán)重影響產(chǎn)量。因此通過鑒定類缺鉀突變體或種質(zhì),發(fā)掘與鉀吸收利用相關(guān)的基因,對培育鉀養(yǎng)分高效高粱有重要作用。
一般鉀吸收利用分子途徑知識來自突變體研究較多,而自然種質(zhì)的報道較少。從國際半干旱作物研究所引進的高粱核心種質(zhì)資源中[15],有1份高粱種質(zhì)編號8-10在拔節(jié)后,葉尖及葉片邊緣逐漸出現(xiàn)紫褐色斑點,然后逐步壞死,類似于缺鉀癥狀。而正常生長的高粱葉片在籽粒成熟之前一般并不會產(chǎn)生紫褐色壞死斑點。從2012—2015年連續(xù)3年的田間正常種植條件下,表型觀察高粱種質(zhì) 8-10 葉片的表現(xiàn)穩(wěn)定、一致,因此確定這是一份特異的類缺鉀癥狀種質(zhì)資源。本研究對高粱類缺鉀癥狀種質(zhì)8-10進行表型和不同位置葉片進行礦質(zhì)含量的分析,組配F2群體,研究該性狀的遺傳特性,并通過BSA-Seq高通量測序?qū)υ撔誀羁刂苹蜻M行粗定位。
高粱微核心種質(zhì)材料8-10,以參考基因組測序品種BTX623作為參照品種。田間種植條件,為一般高粱田間種植條件,正常進行澆水、施肥、病蟲害管理等。種植行距為40 cm,株距為20 cm,行長為 2 m。
在開花時期,取BTX623以及8-10不同位置的新鮮葉片,每個位置葉片取2株長勢基本一致植株同位置的葉片混在一起,計為1個樣品,3個生物學(xué)重復(fù),即將6株苗的葉片進行烘干至恒質(zhì)量。烘干過程如下,新鮮葉片首先120 ℃殺青30 min,然后80 ℃烘至恒質(zhì)量,一般4 d即可。在進行礦質(zhì)含量分析時需要注意的是,要用陶瓷剪刀將樣品進行剪碎(避免鐵元素或其他金屬元素污染)。取碎的混勻干樣葉片約0.1 g,加入6 mL濃硝酸和2 mL濃H2O2(濃度一般為30%),過夜預(yù)硝化,然后用微波硝煮儀(美國CEM公司MARS6)按照說明書進行消化至澄清液體,冷卻后開蓋,其后對消化管進行趕酸至體積約0.5 mL,最終定容至25 mL,采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)(美國珀金埃爾默公司Optima 8000)進行礦質(zhì)元素含量的測定。
首先進行定位群體的構(gòu)建,將葉片顏色正常品種BTX623與8-10類缺鉀癥狀種質(zhì)進行雜交獲得F1,然后套袋自交得到F2。將F2群體植株種植于田間,正常施肥管理。在田間F2群體開花后大概2周,采集葉片顏色正常的表型植株50株,典型類缺鉀癥狀葉植株50株,以及父母本2個材料進行基因組DNA提取。由于高通量測序?qū)蚪MDNA條帶質(zhì)量要求高,DNA提取采用試劑盒法(天根生物科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒DP320),所用新鮮葉片大概100 mg,按照說明書進行提取,然后用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳,要求條帶清晰、無拖尾;用核苷酸紫外分光光度計Nanodrop測定DNA的濃度(美國賽默飛世爾科技公司)以及D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm,確保比值在1.8~2.0之間。BSA-Seq測序時2個DNA混池要求均勻混合每個樣品,每個樣品濃度要求大于50 ng/μL,總量為100 ng,然后將檢驗合格的DNA樣品送樣至北京百邁克生物科技有限公司進行高通量測序分析。
本研究利用北京百邁客生物科技有限公司自主研發(fā)的特異性位點擴增片段測序(specific locus amplified fragment sequencing,SLAF-seq)技術(shù)[16]對高粱類缺鉀癥狀F2遺傳分離群體(2個親本和50+50的混池)進行關(guān)聯(lián)分析,最終獲得與類缺鉀性狀緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記和候選區(qū)域。SLAF高通量測序分析流程簡述如下:首先通過高粱基因組進行方案預(yù)測,選擇HaeⅢ+RsaⅠ 酶進行酶切,SLAF標(biāo)簽長度選擇在364~414 bp 之間,預(yù)測到113 111個SLAF標(biāo)簽,SLAF標(biāo)簽在基因組上基本分布均勻,位于重復(fù)序列區(qū)的SLAF標(biāo)簽比例為8.77%。酶切完后進行建庫,基因組DNA片段經(jīng)過加接頭、PCR擴增等,然后進行上機測序,其后進行生物信息學(xué)分析。對獲得的原始數(shù)據(jù)進行接頭序列等序列的過濾,然后得到clean data,利用BWA軟件進行比對到參考基因BTX623上,然后進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的檢測,依據(jù)檢測出的SNP位點,計算SNP-index差值,主要是尋找混池之間基因型頻率的顯著差異,用Δ(SNP-index)統(tǒng)計。標(biāo)記與性狀關(guān)聯(lián)度越強,Δ(SNP-index)越接近于1。最終挑出顯著差異的區(qū)域,定位候選區(qū)域。
由于該種質(zhì)來源于國際半干旱作物研究所引進的高粱核心種質(zhì)資源,在對照方面,選取BTX623參考基因組測序品種作為比較對象。高粱8-10種質(zhì)在苗期拔節(jié)前,葉片上幾乎無紫褐色壞死斑點,與其他品種如BTX623并無顯著差異。之后葉尖、葉片邊緣逐步出現(xiàn)紫褐色壞死斑點,到了開花后葉片中就出現(xiàn)了大量紫褐色壞死斑點;在老葉中越來越多,而且是從葉尖到邊緣逐漸壞死。如圖1所示,旗葉到第7葉,紫褐色壞死斑點呈現(xiàn)增多的趨勢,特別是新葉中少,老葉中多。而一般的高粱種質(zhì)葉片如參照品種BTX623品種在此時期葉片不論是旗葉還是其他位置葉片葉尖、葉緣都沒出現(xiàn)紫褐色壞死斑點。
由于高粱8-10種質(zhì)葉片葉尖、葉緣出現(xiàn)紫褐色壞死斑點,類似于缺鉀的癥狀,而且符合老葉癥狀嚴(yán)重,新葉輕的特性。為驗證該紫褐壞死斑點的產(chǎn)生是否與礦質(zhì)元素含量的影響有關(guān),特別是那些可移動的礦質(zhì)元素,如鎂、鉀、鈣、磷、鈉、鐵、錳、銅等。將8-10與BTX623最上面的3片葉片中礦質(zhì)元素含量(旗葉為L1,往下依次為L2、L3)進行比較可知,鉀、鎂以及鈣元素在3個葉片之間的變化趨勢與BTX623有較大的不同,鉀含量在8-10倒3葉中較倒2葉降低了25.3%;而鎂、鈣離子的積累模式與BTX623葉也不同,特別是在倒3葉中較倒2葉中分別增加了72.1%以及57.8%;其他元素如磷、鈉、鐵等元素在不同葉片中的分布模式與BTX623差異并不明顯(圖2)。
將高粱類缺鉀種質(zhì)8-10與BTX623進行雜交獲得F1,F(xiàn)1植株葉片表現(xiàn)正常,無褐紫色壞死斑點,表明該性狀控制基因?qū)儆陔[性控制基因。F1自交得到F2群體,播種于田間并進行表型的觀察。在植株開花后約10 d,進行褐紫色壞死斑點的統(tǒng)計。將葉片上的褐紫色壞死斑點的數(shù)量分為4個等級:1級,葉片無或幾乎無褐紫色壞死斑點;2級,葉片中少量褐紫色壞死斑點;3級,中等量褐紫色壞死斑點;4級,褐紫色壞死斑點數(shù)量與8-10種質(zhì)相似。在F2中進行褐紫色壞死斑點性狀等級調(diào)查,結(jié)果表明,葉片表現(xiàn)為無或幾乎無褐紫色壞死斑點的植株有349株(W型),而攜帶褐紫色壞死斑點的植株3個類型合計為312株(B+、B++以及B+++)。葉片W型植株與葉片攜帶B型的植株數(shù)量進行9∶7分離比例的Pearson卡方測試,結(jié)果表明P值大于0.05,符合9∶7分離比例(表1)。該分離比例表明,褐紫色壞死斑點控制基因受2對隱性基因控制。但在有褐紫色壞死斑點斑點的植株中,并不符合2個沒有相互作用的隱性基因的遺傳規(guī)律,表明這2個基因之間很可能是存在互作關(guān)系的。
表1 F2群體葉片斑點的遺傳分析結(jié)果
在高粱類缺鉀種質(zhì)8-10與BTX623進行雜交獲得的F2群體中,挑選極端表型個體各50株,即50株F2植株中葉片表型與8-10一致,50株F2植株葉片表型與BTX623一樣,完全無褐紫色壞死斑點以及2個親本。然后提取基因組DNA,構(gòu)建DNA混池,建庫、測序以及生物信息學(xué)分析。對得到的17 847個候選多態(tài)性SLAF標(biāo)簽,通過SNP-index方法進行關(guān)聯(lián)分析,擬合后的關(guān)聯(lián)閾值為 0.495 766,共獲得868個與性狀顯著相關(guān)的SLAF標(biāo)記,將該基因關(guān)聯(lián)到第4條染色體上7.61 Mb的區(qū)間上(物理位置為 51 504 457~59 110 341 bp),關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的SLAF標(biāo)記為179個,該區(qū)間內(nèi)預(yù)測有885個基因(圖3)。
由于上述分析得到的關(guān)聯(lián)區(qū)域較大,因為該褐紫色壞死斑點葉片控制基因為隱性基因,可將根據(jù)具有隱性性狀表型的混池對得到的關(guān)聯(lián)侯選區(qū)域進一步分析,將關(guān)聯(lián)區(qū)域細(xì)化,進一步縮小目標(biāo)基因范圍。選擇SNP-index(aa)>0.9的性狀關(guān)聯(lián)標(biāo)記,進一步細(xì)化了關(guān)聯(lián)侯選區(qū)域共定位到14個熱點區(qū)域,熱點區(qū)域大小約為2.88 Mb,關(guān)聯(lián)到76個分子標(biāo)記,該區(qū)間內(nèi)預(yù)測有317個基因(表2)。
表2 基因關(guān)聯(lián)熱點區(qū)域匯總
鉀元素是作物生長所必需的三大元素之一,在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。作物在缺鉀時,會影響葉綠素合成,嚴(yán)重時最終影響產(chǎn)量[17-18]。鉀肥價格相對較高,田間當(dāng)季利用率不高,培育鉀高效作物,提高作物對鉀肥的吸收、利用效率,是非常重要的途徑[19],挖掘與鉀吸收利用相關(guān)的基因有重要的意義。本研究利用高粱核心種質(zhì)資源中的1份類缺鉀癥狀種質(zhì),其葉尖和邊緣有較多褐紫色壞死斑點,而且呈現(xiàn)老葉癥狀重、新葉輕的特點。對不同位置的葉片進行了礦質(zhì)元素含量的分析,發(fā)現(xiàn)2個元素在老葉與新葉中的積累模式與BTX623不同。對該種質(zhì)葉片類缺鉀表型進行了遺傳分析和定位,將該基因定位在第4條染色體上7.61 Mb的區(qū)間內(nèi)。
現(xiàn)在鉀養(yǎng)分相關(guān)分子途徑研究結(jié)果,一般來自人工誘變突變體或是來自正向遺傳學(xué)研究,鮮有來源于自然種質(zhì)研究[20]。本研究中的類缺鉀癥狀種質(zhì)8-10,從不同位置葉片離子含量測定的結(jié)果來看,8-10中倒3葉中鉀離子含量最低,較倒2葉降低了25.3%(圖2);而且鉀離子在不同位置葉片中的分布與BTX623也不同,在BTX623中這個時期鉀離子在前3個葉片中的含量幾乎無差異,而在8-10中,前2片葉子鉀離子含量也無差異,而倒3葉鉀含量明顯下降;鈣離子和鎂元素的含量在8-10中倒3葉中明顯增加,而前2片葉子中含量幾乎不變。8-10中倒3葉已出現(xiàn)可見的褐紫色壞死斑點,而倒1和倒2葉沒有明顯的斑點(圖1-B)。植物在缺鉀條件下,一般會促進其他陽離子的吸收,如鈣、鎂,從而緩解缺鉀的影響[21-22]。本研究中在8-10倒3葉中鉀元素含量較倒2葉明顯下降,與之對應(yīng)的是鈣和鎂含量的大幅度增加。同樣為可移動元素的大量元素磷元素在此時期8-10種質(zhì)中的前3片葉片中幾乎無變化,表明植株在這個時期老葉中的可移動元素并未向新葉中轉(zhuǎn)移,葉片中缺鉀很可能是8-10種質(zhì)顯示類缺鉀癥狀的直接原因。
從遺傳分析上看,該類缺鉀表型符合2對隱性基因控制的分離比例,但是并不符合2對無互作的基因分離比例,因而該類缺鉀癥狀控制的2對基因間很可能是存在互作關(guān)系的,至于互作的方式需要進一步深入精細(xì)定位、克隆基因才能闡述清楚。值得注意的是,我們利用BSA-Seq將該基因定位在第4條染色體上7.61 Mb的區(qū)間內(nèi),到底控制類缺鉀癥狀的2個基因都在這一區(qū)間內(nèi),還是一個在第4條染色體上,另一個基因分布在其他染色上暫時無法確定。因為畢竟BSA-Seq高通量測序定位所使用的極端個體,挑選的都是與8-10個葉片表型高度一致的個體,那些表型相對弱的個體暫時并未使用到定位分析中。因此下一步需要精細(xì)定位使用不同表型個體將該基因克隆出來。另一方面,由于8-10是來源于自然種質(zhì)的材料,BTX623只能作為一般參照品種,并不能直接準(zhǔn)確進行該類缺鉀癥狀控制基因?qū)ζ渌r(nóng)藝性狀影響的評估,將來需要構(gòu)建近等基因系材料,從而進行該基因?qū)ζ渌r(nóng)藝性狀影響的精確分析。
本研究從國際高粱核心種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)了1份葉尖褐變逐漸壞死的類缺鉀癥狀種質(zhì)。表型性狀分析發(fā)現(xiàn),該類缺鉀癥狀種質(zhì)在苗期葉片較其他品種如BTX623并無顯著差異;后期葉尖、葉片邊緣逐漸出現(xiàn)褐紫色壞死斑點,而且老葉癥狀重于新葉;不同位置葉片礦質(zhì)元素含量分析結(jié)果表明,鉀、鎂和鈣這3個礦質(zhì)元素在新老葉片中的積累模式與BTX623有明顯差異。遺傳分析結(jié)果表明,該性狀受2個隱性基因控制。BSA-Seq高通量測序定位,最終將該性狀控制基因定位于第4條染色體上7.61 Mb區(qū)間內(nèi)。該特異種質(zhì)高粱的研究,為高粱鉀相關(guān)分子機制研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。