陳 崎，姜曉紅，譚 瑤，爽 爽，劉慧杰，代 蕊，特木爾布和，張志強

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原昆蟲研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020)

苜蓿屬(Medicago)植物因其適應(yīng)性強、產(chǎn)量高及品質(zhì)好等優(yōu)點，已成為我國乃至全世界畜牧業(yè)和乳業(yè)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，苜蓿生產(chǎn)中會受到各種生物或非生物脅迫，嚴重影響苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)，進而影響苜蓿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。對苜蓿害蟲的研究報道顯示，苜蓿害蟲共計297種[1]，其中薊馬已經(jīng)成為苜蓿生產(chǎn)的主要害蟲之一[2]。薊馬通過取食綠色植物的葉、莖、果實和(或)花粉并注入破壞性病毒，導(dǎo)致植物生長受阻、產(chǎn)量下降，并嚴重影響植物產(chǎn)量[3]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在我國苜?？偖a(chǎn)區(qū)，大部分苜蓿薊馬蟲害發(fā)生率在70%以上，最高可達100%[4]，薊馬每年造成約10%～30%的產(chǎn)量損失[5]。然而，由于薊馬高度雜食性及其復(fù)雜的生活方式，其防治成為農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中的難題。

在植物與草食性昆蟲的長期“斗爭”中，植物形成了一套有效的動態(tài)防御策略，包括組成型防御策略和誘導(dǎo)型防御策略[6]。與組成型防御相比，誘導(dǎo)型防御在植物體內(nèi)更常見，在昆蟲沒有取食植物時，誘導(dǎo)抗性能量利用效率更高，對植物造成的代謝負擔(dān)更小，是更為經(jīng)濟有效的防御機制[7]。植物被昆蟲取食后產(chǎn)生的誘導(dǎo)型防御又包括直接防御和間接防御[8]。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲取食會導(dǎo)致寄主某些初生代謝物和次生代謝物的積累。初生代謝物主要包括氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)和糖類等[9]。次生代謝物主要包括黃酮類、單寧類、酚類、萜類和生物堿等[10]。王小珊研究發(fā)現(xiàn)，在薊馬不同蟲口壓力下，抗感苜蓿中總酚、總皂苷、木質(zhì)素和總黃酮的含量均發(fā)生顯著變化[11]。Cao 等探究不同抗性苜蓿品種對薊馬危害的生理生化響應(yīng)，得出薊馬危害后顯著提高了3個品種的可溶性糖(SS)、游離脯氨酸(Pro)、黃酮、單寧和H2O2含量，顯著降低了多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性(P<0.05)[2]。Tu等通過轉(zhuǎn)錄測序發(fā)現(xiàn)，薊馬侵染能夠誘導(dǎo)類黃酮物質(zhì)生物合成基因、β-丙氨酸代謝及水楊酸代謝途徑相關(guān)基因的表達，進而產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性[12]。然而，誘導(dǎo)性化學(xué)物質(zhì)的變化隨昆蟲及寄主的不同而變化[13-14]。筆者所在課題組前期以草原2號、草原4號苜蓿開展抗薊馬機制研究，從形態(tài)結(jié)構(gòu)、物理防御等角度探究草原4號的組成型防御機制[15]，而對于薊馬取食苜蓿后，苜蓿自身產(chǎn)生的誘導(dǎo)性防御機制的研究尚未深入開展，國內(nèi)外也無相關(guān)報道。

草原2號(M.variaMartin.Caoyuan No.2)感薊馬品種(蟲情指數(shù)為0.901)、草原4號(M.sativaL.Caoyuan No.4)抗薊馬品種為材料(蟲情指數(shù)為0.334)[16]，分別進行牛角花齒薊馬(Odontothripsloti)接蟲和不接蟲處理，利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，分析薊馬取食誘導(dǎo)的苜蓿代謝物變化，從代謝水平探究薊馬取食引起的苜蓿誘導(dǎo)性防御機制，豐富植物誘導(dǎo)性抗蟲理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗設(shè)計

本研究于2019年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草地資源教育部重點實驗室進行。供試苜蓿材料為草原2號、草原4號苜蓿，供試蟲源為實驗室飼養(yǎng)的牛角花齒薊馬成蟲。在人工氣候室種植草原2號、草原4號苜蓿各20盆，每盆3株，晝夜平均氣溫分別控制在(30±5)、(20±5)℃；晝夜相對濕度控制在(55±5)%、(70±5)%，保證所有材料生長環(huán)境一致。待苜蓿生長60 d后，進行薊馬接種，分別記為草原2號接種薊馬(2-T)、草原4號接種薊馬(4-T)，草原2號未接種薊馬(2-CK)、草原4號未接種薊馬(4-CK)。選擇長勢一致的牛角花齒薊馬成蟲，在苜蓿植株上進行接種，每盆50頭，并用防蟲網(wǎng)罩住。接種7 d后，選取上述材料相同部位的葉片，送北京百邁克生物科技有限公司進行廣泛靶向代謝組分析，3次重復(fù)。

1.2 代謝組分析

用于代謝組學(xué)分析的樣品處理、提取和代謝物檢測均在北京百邁克生物科技有限公司按照其標(biāo)準化程序進行。正離子模式：流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；負離子模式：流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液，進樣體積為1 μL。

質(zhì)譜條件：在采集軟件[MassLynx V4.2，沃特世科技(上海)有限公司]的控制下，沃特世Xevo G2-XS QTof高分辨質(zhì)譜儀在全信息串聯(lián)質(zhì)譜模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，可以同時對低碰撞能量(2 V)和高碰撞能量(10～40 V)，以0.2 s掃描頻率進行雙通道數(shù)據(jù)采集。ESI離子源參數(shù)如下：毛細管電壓：2 000 V(正離子模式)或-1 500 V(負離子模式)；錐孔電壓：30 V；反吹氣流速：50 L/h；脫溶劑流速：800 L/h；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃[17]。

1.3 代謝組數(shù)據(jù)分析

利用軟件Analyst 1.6.3(AB SCIEX，Ontario，Canada)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理。在獲得不同樣本中代謝物的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，按峰面積對所有物質(zhì)的質(zhì)譜峰進行積分，并對不同樣品中相同代謝物的質(zhì)譜峰進行積分校正。缺失值被認為低于檢測限，并用最小記錄值進行估算。離子強度通過對數(shù)轉(zhuǎn)換歸一化，代謝物豐度使用Dunnett檢驗計算，多重檢驗由FDR控制。使用正交信號校正偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)和投影中的變量重要性投影(VIP)來獲得控制和薊馬感染之間的最大差異。VIP>1.0 的代謝物被認為是用于群體區(qū)分的差異代謝物。KEGG數(shù)據(jù)庫用于注釋和顯示差異代謝物。其他分析包括主成分分析(PCA)和通路富集，是通過使用R完成的[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控分析

通過混合所有樣本提取物制備質(zhì)控樣品，并用于在相同處理方法下分析樣本的重復(fù)性。本試驗在每10個檢測分析樣本中插入1個質(zhì)控樣本，結(jié)果(圖1)表明，代謝物檢測到的總離子流曲線重疊性高，表明質(zhì)譜在不同時間檢測同一樣品時，信號穩(wěn)定性好。

2.2 總體樣本主成分分析

為了解各組樣本之間的總體代謝差異以及組內(nèi)樣本之間的變異度，對樣本進行PCA分析。如圖2所示，第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)共解釋了樣品之間53.18%的差異。同時，4個不同處理之間分離明顯，同一處理的3個重復(fù)聚在一起，表明代謝物在組間變化明顯，組內(nèi)重復(fù)較好。

2.3 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

雖然主成分分析可以有效地提取主要信息，但對相關(guān)性較小的變量不敏感。正交偏最小二乘判別分析可解決這一問題。與PCA相比，OPLS-DA可以將X矩陣信息分解成與Y有關(guān)的信息和無關(guān)的信息，通過清除無關(guān)差異的方法來篩選差異變量，以最大限度地區(qū)分各組，更容易篩選差異代謝物。由圖3可得，R-CK_vs_R-T的Q2為0.884；S-CK_vs_R-CK 的Q2為0.923；S-CK_vs_S-T的Q2為0.888；S-T_vs_R-T的Q2為0.886。不同組間的Q2均大于0.5，接近或高于0.9，說明所構(gòu)建的模型是有效或出色的模型，可用于后續(xù)的差異分析。

2.4 薊馬取食誘導(dǎo)的苜蓿差異代謝物篩選

基于正交偏最小二乘判別分析的結(jié)果，利用獲得的OPLS-DA 模型的變量重要性投影篩選差異代謝物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草原2號苜蓿在薊馬取食前后的差異代謝物為178個(S-CK vs S-T)，而草原4號苜蓿在薊馬取食前后差異代謝物為116個(R-CK vs R-T)。其中，有60個差異代謝物在2個品種中都受到薊馬取食影響(圖4)。為了進一步分析薊馬取食對苜蓿代謝物影響的普遍規(guī)律，探究苜蓿誘導(dǎo)性抗薊馬代謝調(diào)控機理，筆者所在課題組對這60個差異代謝物進行進一步分析。

通過對共同誘導(dǎo)表達的60個差異代謝物的KEGG功能注釋(表1)發(fā)現(xiàn)，包括生物堿、氨基酸及衍生物、核苷酸及衍生物、有機酸及衍生物、黃酮類、吲哚及衍生物、苯丙素、花青素、多酚、酚胺、醌類等12大類。其中主要集中在黃酮類化合物(圖5)，包括黃酮、黃酮類、黃烷酮、黃酮醇和異黃酮，共有31個，約占51%，其次為有機酸及衍生物、苯丙素及氨基酸及衍生物，分別占11%、11%和8%。

在31個黃酮類化合物中，與麥黃酮、槲皮素和木樨草素等相關(guān)的24個代謝物薊馬取食以后整體表現(xiàn)為上調(diào)，而與白楊素、芹菜苷和芒柄花苷相關(guān)的4個化合物在抗蟲品種和感蟲品種中均表現(xiàn)為下調(diào)，只有柚皮苷、蕓香柚皮苷和阿福豆苷3個化合物在 S-CK_vs_S-T表現(xiàn)為下調(diào)，而在R-CK_vs_R-T表現(xiàn)為上調(diào)。此外，7個有機酸及衍生物和7個苯丙素在抗蟲品種和感蟲品種中均表現(xiàn)為上調(diào)；5個氨基酸及衍生物中，N-苯乙?；?L-谷氨酰胺、苯乙酰甘氨酸等含苯環(huán)的氨基酸表現(xiàn)為上調(diào)，谷胱甘肽還原型、3-N-甲基-L-組氨酸及γ-L-谷氨酸-L-半胱氨酸等與谷胱甘肽代謝相關(guān)的氨基酸及衍生物則下調(diào)(表1)。

表1 薊馬取食誘導(dǎo)的苜蓿差異代謝物

3 討論與結(jié)論

植物的誘導(dǎo)型防御是植物對病蟲的一種重要防御反應(yīng)，近年來，也受到更多的重視，并從生理生化、代謝調(diào)控、生態(tài)調(diào)控、分子機制等方面取得了系列進展[19-20]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過組學(xué)技術(shù)開展植物抗蟲機制研究的相關(guān)報道逐年增多[21-22]。代謝組學(xué)可以對某一生物體或細胞在特定生理時期的所有低分子量代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析。本研究采用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)，探究薊馬取食引起的苜蓿誘導(dǎo)性代謝防御反應(yīng)。

無論是抗蟲材料還是感蟲材料，昆蟲取食都會誘導(dǎo)代謝物或相關(guān)基因發(fā)生變化，但感蟲品種變化更多[12]。本研究中草原2號(感蟲)苜蓿在薊馬取食前后差異代謝物178個(S-CK vs S-T)，而抗性材料草原4號(抗蟲)苜蓿在薊馬取食前后差異代謝物116個(R-CK vs R-T)，說明同抗薊馬品種相比，感薊馬品種受薊馬取食誘導(dǎo)的代謝變化更敏感。

研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲取食植物誘導(dǎo)初生代謝物和次生代謝物變化，包括糖類、氨基酸、有機酸、黃酮類、酚類和單寧等[23-24]。為了進一步分析薊馬取食對苜蓿代謝物影響的普遍規(guī)律，探究苜蓿誘導(dǎo)性抗薊馬代謝調(diào)控機制，筆者所在課題組對薊馬取食引起的抗薊馬品種和感薊馬品種共同變化的60個差異代謝物進行分析。KEGG功能注釋發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要包括黃酮類、生物堿、氨基酸及衍生物、有機酸及衍生物和苯丙素等12大類。

眾多報道發(fā)現(xiàn)，次生代謝物在誘導(dǎo)性防御中更重要[25-28]。本研究中78%的次生代謝物大多都表現(xiàn)為上調(diào)。Burghardt等研究發(fā)現(xiàn)，黃酮含量的顯著提升與抗蟲相關(guān)[29]。本研究也發(fā)現(xiàn)，薊馬誘導(dǎo)取食代謝物變化也主要集中在黃酮類化合物，說明黃酮類化合物在苜蓿誘導(dǎo)性防御中具有重要作用。研究報道麥黃酮及其衍生物在禾本科植物的抗蟲性中有重要的作用[30-31]。本研究中發(fā)現(xiàn)，3個麥黃酮相關(guān)的化合物均顯著上調(diào)，說明麥黃酮可能參與了苜蓿的誘導(dǎo)性防御。Bouaziz等研究發(fā)現(xiàn)，木樨草素對昆蟲取食植物沒有影響[32]。但本研究中2個與木樨草素相關(guān)的代謝物都上調(diào)，推測木樨草素也參與了苜蓿的誘導(dǎo)性抗蟲。此外，本研究發(fā)現(xiàn)2個與白楊素相關(guān)的代謝物和1個芹菜苷無論在抗薊馬品種和感薊馬品種中都表現(xiàn)為下調(diào)，在其他研究中暫無相關(guān)報道，推測白楊素與芹菜苷可作為苜?？顾E馬研究的候選代謝物。

生物堿在植物抗蟲中發(fā)揮重要作用[33]。張文輝等研究發(fā)現(xiàn)，生物堿中的茄堿能夠組織馬鈴薯甲蟲取食[34]。本試驗結(jié)果顯示，薊馬取食誘導(dǎo)草原2號和草原4號中α-茄堿、對香豆酰五羥色胺己糖苷、阿魏酰五羥色胺3種生物堿含量均上升，推測生物堿也不利于薊馬的生長發(fā)育。

除了次生代謝物，可溶性糖、氨基酸和蛋白質(zhì)等初生代謝物在植物誘導(dǎo)性防御中也發(fā)揮著重要的作用[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)除氨基酸及衍生物之外的酸類均表現(xiàn)為上調(diào)，說明昆蟲取食可能導(dǎo)致酸的增加。谷胱甘肽及其衍生物是植物清除活性氧的一種信號物質(zhì)[37]。本研究發(fā)現(xiàn)3個與谷胱甘肽代謝相關(guān)的氨基酸均表現(xiàn)為下調(diào)，說明谷胱甘肽對苜蓿的誘導(dǎo)性抗蟲也具有重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)2個含苯環(huán)的氨基酸：N-苯乙?；?L-谷氨酰胺和苯乙酰甘氨酸均表現(xiàn)為上調(diào)，推測含苯環(huán)的氨基酸可能與苜蓿誘導(dǎo)性抗蟲相關(guān)。

薊馬取食會誘導(dǎo)代謝物發(fā)生變化，但感薊馬品種比抗薊馬品種更敏感。在次生代謝物中，主要集中在黃酮類化合物，包括麥黃酮、木樨草素、白楊素、芹菜苷等，說明它們在苜蓿誘導(dǎo)性防御中可能具有更重要的作用。此外，也包括一些初生代謝物的變化，包括氨基酸及衍生物和有機酸及衍生物等也參與了苜蓿誘導(dǎo)性薊馬防御反應(yīng)。