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東莨菪堿法和高滲鹽水法復(fù)制小鼠干燥綜合征模型的比較①

2023-03-17 04:53谷瑤紅馬玉萌郝靜超
中國免疫學(xué)雜志 2023年2期
關(guān)鍵詞:東莨菪堿淚液脾臟

文 鳳 李 清 李 萃 谷瑤紅 馬玉萌 郝靜超

(昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500)

干燥綜合征(Sj?gren syndrome,SS)也稱舍格倫綜合征,是累及外分泌腺體慢性炎癥的自身免疫結(jié)締組織疾?。?]。其病理表現(xiàn)為大量淋巴細(xì)胞浸潤外分泌腺體間質(zhì),并伴有外分泌腺體上皮細(xì)胞破壞和萎縮[2]。臨床局部表現(xiàn)為唾液黏蛋白缺失引起的口干燥、口腔黏膜潰瘍或繼發(fā)感染、淚腺分泌黏蛋白減少引起眼干燥性角結(jié)膜炎等;系統(tǒng)性表現(xiàn)為全身乏力、低熱,約有2/3 患者出現(xiàn)全身系統(tǒng)性損害[3]?;颊哐逯写嬖诙喾N自身抗體。SS 分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類,僅有外分泌腺受累則稱為原發(fā)性干燥綜合征(pSS);若同時(shí)伴有其他結(jié)締組織損害或繼發(fā)其他自身免疫性疾病則稱為繼發(fā)性干燥綜合征(sSS)。SS 主要患者為中年婦女,全世界患病率為0.3‰~3‰,我國患病率為0.3%~0.7%,40 歲以上人群患病率高達(dá)3%~4%[4-5]。

SS 發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為其與遺傳、感染及環(huán)境等多種因素密切相關(guān)[6-7]。經(jīng)自體蛋白激活免疫反應(yīng)途徑產(chǎn)生IFN,從而促進(jìn)單核細(xì)胞、 T細(xì)胞、B 細(xì)胞和靶器官(如唾液腺上皮細(xì)胞)產(chǎn)生 B細(xì)胞活化因子BAFF,BAFF 與免疫細(xì)胞受體BAFFR 結(jié)合后繼續(xù)促進(jìn)B 細(xì)胞的增殖活化,進(jìn)而分泌自身抗體SSA、SSB 和抗核抗體ANA[8]?;罨腡 細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10 等細(xì)胞因子聯(lián)合自身抗體共同作用促進(jìn)疾病進(jìn)程[6,9]。

動(dòng)物模型是研究SS發(fā)病機(jī)制的重要輔助手段,但由于目前缺乏SS 特異性高的生物標(biāo)志物和能夠完全模擬臨床SS 病理的動(dòng)物模型,故抗SS 藥物篩選研究僅能以動(dòng)物干眼模型作為主要研究對象。因此選擇便利的造模方法和穩(wěn)定的動(dòng)物模型顯得非常關(guān)鍵。

東莨菪堿是茄科植物中的一種莨菪烷型生物堿,其主要通過阻斷副交感神經(jīng)傳導(dǎo)作用于中樞和外周,競爭性拮抗毒蕈堿乙酰膽堿受體,從而發(fā)揮其鎮(zhèn)靜和抑制腺體分泌等作用。本文旨在利用東莨菪堿和高滲鹽水分別誘導(dǎo)復(fù)制SS小鼠模型,通過觀察比較小鼠體質(zhì)量變化百分比、飲水量消耗情況、淚液結(jié)晶變化、外周血自身抗體SSA、SSB 和抗核抗體ANA表達(dá)量、TNF-α和BAFFR炎癥因子表達(dá)量、脾臟濕重和脾臟系數(shù)、分泌腺組織中淋巴細(xì)胞浸潤評分等指標(biāo)比較兩種方法的便利性和穩(wěn)定性。本研究有利于SS 動(dòng)物模型的研究,并為抗SS 藥物臨床前藥理學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性BALB/c 小鼠,6~8周齡,體質(zhì)量(18±2) g,購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滇)2019-0008,使用許可證號(hào):SYXK(滇)K2015-0002。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)SPF環(huán)境,小鼠自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)開展前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。實(shí)驗(yàn)過程符合減少、替代和優(yōu)化的3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器 氫溴酸東莨菪堿(愛必信上海生物科技有限公司,規(guī)格500 mg,批號(hào):abs47000419);固體氯化鈉(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,規(guī)格500 g,批號(hào):210422);氯化鈉注射液(石家莊鵬海制藥股份有限公司,規(guī)格250 ml,批號(hào):2012062101);SSA、SSB、ANA、BAFFR 和TNF-α ELISA 試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司,規(guī)格:96T);倒置顯微鏡(上海維翰光電科技有限公司,型號(hào):50I);多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司,型號(hào):1510)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑的配制 稱取氫溴酸東莨菪堿 0.100 8 g 于燒杯,加入100 ml 生理鹽水玻棒攪拌溶解成1 mg/ml 的氫溴酸東莨菪堿溶液。置于4 ℃下保存待用。稱取固體氯化鈉1.401 3 g于燒杯,加入500 ml生理鹽水玻璃棒攪拌溶解,配制成2.8 mg/ml的高滲鹽水。置于4 ℃保存待用。

1.2.2 小鼠SS模型建立 SPF級BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組:正常組、氫溴酸東莨菪堿組和高滲鹽水組(n=10)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后,除正常組外,氫溴酸東莨菪堿組小鼠經(jīng)皮下注射氫溴酸東莨菪堿溶液,0.2 mg/次/20 g 體重(qid)。高滲鹽水組小鼠經(jīng)眼內(nèi)緩滴氯化鈉溶液,100 μl/(眼·次)(qid)。連續(xù)造模10 d。具體造模方案見表1。

表1 小鼠模型復(fù)制方案(n=10)Tab.1 Replicative regimen of mice models (n=10)

1.2.3 體質(zhì)量變化檢測 用小鼠秤測量每組小鼠體質(zhì)量,1次/2 d。計(jì)算每組體質(zhì)量變化百分比(%)。

1.2.4 飲水消耗量檢測 在d1 時(shí),以加滿水的鼠水瓶重量作為起始重量M1(g),隨后每2 d 稱量鼠水瓶重量,再次記錄作為Mn(g)。利用作差法ΔM飲水量=M1-Mn計(jì)算每組小鼠飲水消耗量(1 g≈1 ml)。結(jié)果保留1位小數(shù)。

1.2.5 淚液結(jié)晶形態(tài)檢測 實(shí)驗(yàn)期間,采集淚液(1 次/5 d)。采用毛細(xì)玻璃管在小鼠眼內(nèi)呲處收集淚液后轉(zhuǎn)至載玻片,待其干后,置于倒置顯微鏡×200視野下觀察淚液結(jié)晶形態(tài)。隨機(jī)拍5~8 個(gè)視野,每個(gè)視野拍3~5張。

1.2.6 脾臟系數(shù)檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,剖取小鼠脾臟,去除其周圍結(jié)締組織,生理鹽水清洗后濾紙吸干表面水分,稱量其濕重。按公式:脾臟系數(shù)(mg/g)=脾臟重量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g),計(jì)算脾臟系數(shù)。

1.2.7 脾臟HE 染色 脾臟置于4%甲醛溶液中固定48 h,石蠟包埋,經(jīng)切片、貼片、脫蠟和蘇木素-伊紅染色,乙醇脫水,中性樹脂進(jìn)行封片。將其置于倒置顯微鏡×100、×200 視野下觀察,每片隨機(jī)拍攝5~8 個(gè)視野。依據(jù)脾臟形態(tài)進(jìn)行評價(jià):0 級,脾臟結(jié)構(gòu)完整,白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清晰,脾小體結(jié)構(gòu)完整、清晰、排列整齊;1 級,脾臟病理改變程度較小,脾小體結(jié)構(gòu)較為整齊,體積較小,淋巴細(xì)胞較少,白髓增生程度有所緩解;2 級,脾臟紅髓、白髓分布不規(guī)則,排列不均勻,白髓區(qū)域淋巴細(xì)胞輕度增生,白髓區(qū)輕度增寬;3 級,病理改變程度較大,脾臟白髓呈重度增生,生發(fā)中心突出,淋巴細(xì)胞減少,脾小體萎縮,數(shù)量減少,紅髓髓索壓迫變窄,脾小梁密集。

1.2.8 腺體組織淋巴細(xì)胞浸潤評分 剖取頜下腺、腮腺于4%中性甲醛溶液固定48 h。經(jīng)切片、貼片、脫蠟和蘇木素-伊紅染色,乙醇脫水,中性樹脂進(jìn)行封片。將其置于倒置顯微鏡×200 視野下觀察,每片隨機(jī)拍攝5~8 個(gè)視野。采用Chisholm-Mason 組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)腺體組織中淋巴細(xì)胞浸潤程度。評分標(biāo)準(zhǔn)為:0 分,偶見淋巴細(xì)胞浸潤;1 分,少量散在淋巴細(xì)胞浸潤;2 分,淋巴細(xì)胞中度浸潤(未成灶),伴有輕度實(shí)質(zhì)損傷;3 分,偶見0~1 個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤灶,5 個(gè)低倍視野,伴有中度實(shí)質(zhì)損傷;4 分,易見2~3 個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤灶,5 個(gè)低倍視野,伴有重度實(shí)質(zhì)損傷。>2分為發(fā)病。

1.2.9 血清中抗體和炎癥因子表達(dá)量檢測 參照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中自身抗體SSA 和SSB、抗核抗體ANA、炎癥因子BAFFR 和TNF-α 表達(dá)量。利用多功能酶標(biāo)在450 nm 波長下依序測定吸光值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線方程計(jì)算血清中抗體和炎癥因子的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用 SPSS26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;計(jì)量資料以±s表示,進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)期間正常組小鼠體質(zhì)量呈增長趨勢。與正常組相比,高滲鹽水組與東莨菪堿組小鼠體質(zhì)量變化百分比均下降(P<0.05,P<0.01);與高滲鹽水組相比,東莨菪堿組小鼠體質(zhì)量變化百分比下降幅度有顯著差異(P<0.01)。見圖1A。

2.2 小鼠飲水量消耗 實(shí)驗(yàn)期間正常組小鼠飲水量相對穩(wěn)定。與正常組相比,東莨菪堿組與高滲組的飲水量顯著增加(P<0.05);與高滲組相比,從d6開始,東莨菪堿組小鼠飲水量消耗顯著增加(P<0.05)。見圖1B。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化百分率和飲水量消耗變化(n=10)Fig.1 Percentage of weight changes and water consumption of mice in each group (n=10)

2.3 淚液結(jié)晶形態(tài)變化 圖2顯示,正常組小鼠淚液分泌量多,淚液結(jié)晶呈形態(tài)良好的蕨類物形狀 (Ⅰ型)。高滲鹽水組和東莨菪堿組小鼠淚液分泌均減少,其中東莨菪堿組最少。高滲組淚液結(jié)晶呈蕨類物形狀,邊界不清且形狀不規(guī)則(Ⅲ型),東莨 菪堿組淚液結(jié)晶中蕨類物形狀減少,分布散亂 (Ⅳ型)。

圖2 小鼠淚液結(jié)晶形態(tài)變化(×200)Fig.2 Morphological changes of tear crystal form of mice (×200)

2.4 脾臟系數(shù) 圖3A、3B 顯示,與正常組相比,高滲鹽水組脾臟濕重和脾臟系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而東莨菪堿組脾臟濕重和脾臟系數(shù)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與高滲鹽水組相比,東莨菪堿組脾臟濕重顯著增加,脾臟系數(shù)顯著提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5 脾臟HE 染色 圖4 顯示,正常組脾臟結(jié)構(gòu)完整,白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清晰,脾小體結(jié)構(gòu)完整、清晰、排列整齊(0 級),而東莨菪堿組小鼠脾臟白髓呈重度增生,生發(fā)中心突出,病理改變程度較大,淋巴細(xì)胞減少,脾小體萎縮,數(shù)量減少,紅髓髓索壓迫變窄,脾小梁密集(3 級);高滲鹽水組白髓增生程度有所緩解,脾臟病理改變程度較小,脾小體結(jié)構(gòu)較為整齊,體積較小,淋巴細(xì)胞較少(1級)。

圖4 各組脾臟HE染色(HE,n=10)Fig.4 HE staining of spleens in each group (HE, n=10)

2.6 頜下腺、腮腺HE 染色及其淋巴細(xì)胞浸潤評分 圖5 顯示,正常組小鼠頜下腺分泌黏液和漿液性的腺泡結(jié)構(gòu)完整,導(dǎo)管無阻塞、狹窄。與正常組(0 級)相比,東莨菪堿組小鼠頜下腺中腺泡結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)管阻塞、狹窄而導(dǎo)致頜下腺發(fā)生逆行性炎癥的程度較高,有膿性分泌物自導(dǎo)管口溢出(3 級);而高滲鹽水組中分泌黏液和漿液性腺泡結(jié)構(gòu)較為完整,少有導(dǎo)管阻塞、狹窄和膿性分泌物溢出(1級)。圖5 顯示,正常組小鼠腮腺漿液性腺泡明顯可見,閏管長,在腺小葉內(nèi)可見,無皮脂腺(0 級)。與正常組相比,東莨菪堿組腮腺漿液性腺泡較少,閏管不一,染色淺,在腺小葉內(nèi)少見,可見皮脂腺和淋巴(3 級);而高滲鹽水組腮腺漿液性腺泡明顯可見,閏管長,染色淺,在腺小葉內(nèi)可見,無皮脂腺(1級)。圖3C顯示,與正常組相比,高滲組小鼠頜下腺、腮腺組織中淋巴細(xì)胞浸潤程度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而東莨菪堿組中淋巴細(xì)胞浸潤程度均顯著升高(P<0.01)。

圖3 小鼠脾臟重量、脾臟系數(shù)和分泌腺組織淋巴細(xì)胞浸潤評分(n=5)Fig.3 Weight and indexes of spleens and lymphocyte infiltration scores of endocrine glands of mice (n=5)

圖5 各組頜下腺和腮腺HE染色(HE,n=10)Fig.5 HE staining of submandibular gland and parotid gland in each group (HE, n=10)

2.7 血清中自身抗體表達(dá)量 圖6A、6B 顯示,與正常組相比,東莨菪堿組血清中自身抗體SSA、SSB和抗核抗體ANA表達(dá)量均顯著升高(P<0.01),但高滲鹽水組僅SSA 表達(dá)量顯著升高(P<0.05),而SSB、ANA 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與高滲鹽水組相比,東莨菪堿組表達(dá)量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。表明東莨菪堿可顯著促進(jìn)小鼠體內(nèi)自身抗體和抗核抗體表達(dá)。

2.8 血清中BAFFR 和TNF-α 表達(dá)量 圖6C、6D 顯示,與正常組相比,東莨菪堿組血清中BAFFR、TNF-α表達(dá)量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01);但高滲鹽水組僅TNF-α 表達(dá)量升高(P<0.05),BAFFR表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。東莨菪堿組血清中BAFFR 表達(dá)量顯著高于高滲鹽水組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);但兩組TNF-α 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明東莨菪堿均能促進(jìn)BAFFR蛋白和TNF-α 表達(dá),但高滲鹽水僅能促進(jìn)TNF-α表達(dá)。

圖6 各組小鼠外周血清中自身抗體和炎癥因子表達(dá)(n=10)Fig.6 Expression levels of auto-antibodies and inflammatory factors in peripheral blood of mice in each group (n=10)

3 討論

SS 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜不清,現(xiàn)階段仍缺乏一個(gè)能真實(shí)、客觀、全面地模擬SS 臨床發(fā)病機(jī)制和表現(xiàn)的動(dòng)物模型。目前已有多種復(fù)制SS動(dòng)物模型的方法,如自發(fā)動(dòng)物模型、基因工程動(dòng)物模型、實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)型模型等。其中,實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型方法因其周期短和經(jīng)濟(jì)便利性仍是藥理學(xué)研究中體內(nèi)篩選的重要方法之一。本研究通過實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)方法,表明氫溴酸東莨菪堿法比高滲鹽水滴眼法在復(fù)制SS模型上更有優(yōu)勢。東莨菪堿是具有抗膽堿活性的生物堿,其通過阻斷毒蕈堿型乙酰膽堿受體(M受體)阻斷淚腺膽堿能受體,并通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控抑制腺體分泌,其抑制作用強(qiáng)于阿托品[10-12]。這種抑制作用在一定程度上模擬了臨床SS 患者的發(fā)病癥狀,如口干、眼干、分泌腺體功能降低、腺體結(jié)構(gòu)萎縮和免疫炎癥等。研究發(fā)現(xiàn),氫溴酸東莨菪堿引起的干眼以淚液分泌減少為主,伴有免疫性炎癥和細(xì)胞凋亡等多因素共同參與[12-14]。與高滲鹽水滴眼局部誘導(dǎo)干眼相比,東莨菪堿對分泌腺的抑制作用更強(qiáng)[13,15]。皮下注射途徑操作簡單,既能避免全身用藥的毒副作用,又能克服眼表用藥的局部限制,使誘導(dǎo)造模作用持久[16]。因此,本研究為選擇合理、經(jīng)濟(jì)快捷的造模方法提供依據(jù),有利于提高抗SS 藥物篩選效率,也為探索新的更接近臨床SS發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物建模方法提供參考。原發(fā)性和繼發(fā)性的SS 患者早期癥狀不典型,大部分以口干、眼干為首發(fā)癥狀。眼干可導(dǎo)致眼癢、干澀、眼紅、異物感等一系列不適癥狀,嚴(yán)重者可引起失明。早期口干的跡象包括齲齒數(shù)量增加、反復(fù)感染或口腔潰瘍及嚴(yán)重的牙齦疾?。?7]。我國以眼干、口干癥狀就診的主訴者較少,故臨床常常忽視SS 的首發(fā)癥狀?,F(xiàn)臨床確診主要依靠臨床癥狀、組織病理學(xué)檢查及對自身抗體、相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平檢測的綜合判斷。自身抗體SSA、SSB 對SS 的診斷敏感度較高,具有重要的診斷價(jià)值[17-18]??购丝贵wANA 能識(shí)別各種細(xì)胞核組分,特征性地出現(xiàn)于許多自身免疫性疾病的活動(dòng)性及預(yù)后指標(biāo)。TNF-α 雖然不作為SS 的特異性指標(biāo), 但其是判斷感染程度和免疫功能的重要炎癥因子之一[19-20]。B 淋巴細(xì)胞活化在SS 病程中具有關(guān)鍵作用,BAFF 是維持B 細(xì)胞功能的重要細(xì)胞因子,BAFF/BAFFR 能夠激活PI3K-Akt-mTOR 信號(hào)通路,調(diào)節(jié)B 淋巴細(xì)胞的增殖、存活和活化。近年也結(jié)合了抗著絲點(diǎn)抗體、抗-α 胞襯蛋白、抗線粒體抗體M2亞型(AMA-2)、抗毒蕈堿3 受體(M3R)抗體等指標(biāo)[21]。隨著SS發(fā)病機(jī)制的深入研究,新的特異性生物標(biāo)志物將被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于SS治療。

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