姬霄霄 李 振 郝慧琴 高玉亭 （山西中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合基礎實驗室，晉中 030619）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性疾病，主要病理特征為持續(xù)性滑膜炎、血管炎和軟骨破壞，后期可侵犯骨關節(jié)，引起不可逆關節(jié)損傷，嚴重者可導致殘疾［1-2］。RA 西醫(yī)治療集中于非甾體抗炎藥、改善病情抗風濕藥、糖皮質(zhì)激素等藥物，雖可改善RA 癥狀，但其不良反應極大降低了患者用藥依從性［3］。中藥復方在中醫(yī)傳統(tǒng)辨證思想指導下具有多靶點多療效特點，在中藥復方中尋找安全有效的RA 治療措施具有潛在研究價值。

防己黃芪湯（Fangji Huangqi Decoction，F(xiàn)HD）首見于《金匱要略》，由防己、黃芪、白術、甘草組成，加生姜和大棗煎服，可祛風除濕、健脾利水，是臨床治療RA 的經(jīng)典方劑。研究表明，F(xiàn)HD 具有抗氧化、殺菌、抗炎、鎮(zhèn)痛作用，在風濕免疫、腎病、循環(huán)系統(tǒng)疾病中應用廣泛［4］。另有研究證實，F(xiàn)HD 可有效緩解膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠關節(jié)腫脹度，抑制關節(jié)滑膜血管新生，降低TNF-α 體外誘導的滑膜成纖維細胞MH7A 遷移、侵襲及黏附能力［5-6］。FHD 治療RA 的藥理學機制尚未見報道。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法預測得到FHD 治療RA 的核心通路為PI3K-Akt 通路，通過構(gòu)建CIA大鼠模型，進一步探索FHD對CIA大鼠PI3KAkt 通路的調(diào)控作用，為后期FHD 臨床治療RA 提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 60 只6～8 周齡SPF 級健康雌性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（200±10） g，購自北京市昌揚西山養(yǎng)殖場，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010， 實驗大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學實驗動物中心，（23±2） ℃，（50±15）%濕度，自由進食飲水。本實驗經(jīng)山西中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（2019LL156）。

1.1.2 藥材及試劑 防己、黃芪、白術、甘草均購自山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；牛Ⅱ型膠原（Chondrex，20022）；弗 氏 完 全/不 完 全 佐 劑（Sigma， SLBR3877V、SLBM9362V）；大鼠TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物，202105）；HE 染色液（雷根生物，DH0006）；一抗PI3K、Akt、p-Akt（Ser473，CST，4257、4685、4060）；p-PI3K（Y607，Abcam，AB182651）；β-actin（ABclonal，AC038）；二抗羊抗兔IgG（Solarbio，SE134）；RIPA 裂解液、PMSF、蛋白磷酸酶 抑 制劑、BSA、EDTA 脫鈣液（Solarbio，R0020、P0100、P1260、SW3015、E1171）；BCA、SDS-PAGE 試劑盒（Boster，AR0146、AR0138）；ECL 發(fā)光液（百奧生物，M1033）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及CIA 造模 60 只Wistar 大鼠隨機分為健康對照組（Control）、CIA 模型組（CIA）、低劑量FHD 治療組（Low-FHD）、中劑量FHD 治療組（Medium-FHD）、高劑量FHD治療組（High-FHD），每組12 只。牛Ⅱ型膠原和弗氏完全/不完全佐劑誘導CIA 大鼠模型［7］。初次免疫：冰上將牛Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑混勻乳化，終濃度為1 mg/ml，除Control 組外，分別在大鼠背部、尾跟部2 cm 處和右后足掌中心行5點皮下注射乳化劑（0.1 ml/點）。加強免疫：1 周后，牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑等量混合，腹腔注射乳化劑（0.3 ml/只）。

1.2.2 給藥方法及取材 初次免疫2周后（0周）開始給藥，F(xiàn)HD（防己∶黃芪∶白術∶甘草=4∶5∶3∶2）傳統(tǒng)水煎法煎煮。按照人體表面積公式將人的用藥劑量轉(zhuǎn)換為大鼠用藥劑量，低、中、高FHD 劑量分別為2.2、4.4、8.8 g/（kg·d），2 次/d，連續(xù)灌胃6 周，Control組和CIA組大鼠灌胃4.4 g/（kg·d）生理鹽水。治療結(jié)束后，10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心，取上清，-80 ℃保存，脫頸處死大鼠，取左踝關節(jié)-80 ℃保存，右踝關節(jié)和脾臟用4%多聚甲醛固定。

1.2.3 大鼠體質(zhì)量及關節(jié)炎評分 給藥0～6周，根據(jù)表1 關節(jié)炎評分標準，每周記錄各組大鼠體質(zhì)量和關節(jié)炎評分，四肢累積得分即為每只大鼠關節(jié)炎指數(shù)［8］。

表1 關節(jié)炎評分標準Tab.1 Standard of arthritis score

1.2.4 不同實驗組大鼠關節(jié)和脾臟病理學檢測 取4%多聚甲醛固定的大鼠踝關節(jié)（10%EDTA 脫鈣5 周）和脾臟，梯度乙醇脫水→二甲苯透明→石蠟包埋→4 μm 切片→脫蠟至水→HE 染色，顯微鏡下觀察關節(jié)和脾臟病理變化。關節(jié)組織以滑膜增生、細胞浸潤、血管翳形成和軟骨侵蝕4 個特征進行病理評分，評分范圍為0 分（無影響）至3 分（嚴重影響），脾臟組織以淋巴樣白髓增生和生發(fā)中心總數(shù)2個特征進行病理評分，評分范圍為0 分（無影響）至4 分（嚴重影響）［9］。

1.2.5 血清炎癥因子檢測 ELISA 試劑盒檢測各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6 表達。按照說明書依次稀釋標準品，取各組大鼠血清各50 μl，450 nm 處檢測OD 值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.2.6 網(wǎng)絡藥理學預測FHD 治療RA 的核心信號通路 借助PubMed、TCMSP、BATAMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫收集FHD 化學成分［10-11］。TCMSP 數(shù)據(jù)庫以OB≥30%、DL≥0.18、AlogP≤5、MW≤500 為標準進行篩選，BATMAN-TCM 數(shù) 據(jù) 庫 以Score cut off＞30，P＜0.05 為標準篩選［12］。Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫進行活性成分-靶標預測［13］。Uniprot 數(shù)據(jù)庫對預測靶點進行標準化處理［14］。利用OMIM、GeneCards、Dis-GeNET 數(shù)據(jù)庫以score＞平均值篩選RA 疾病靶點［15-17］。將FHD 治療RA 的作用靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，設置蛋白互作評分≥0.9，獲得PPI 數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡并進行網(wǎng)絡拓撲分析，以各節(jié)點度值（degree）、介數(shù)中心值（closeness）及緊密關系值 （betweenness）參數(shù)＞平均值篩選FHD 治療RA 的核心靶點［18］。以P＜0.01 為條件，DAVID 數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行信號通路富集分析，獲得FHD 治療RA的核心信號通路［19］。

1.2.7 基于PI3K-Akt 信號通路檢測各組大鼠關節(jié)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達 液氮研磨大鼠關節(jié)滑膜組織至粉末狀，RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 檢測蛋白濃度和純度，取30 μg 蛋白上樣，SDSPAGE電泳，5%濃縮膠（80 V，30 min）和10%分離膠（120 V，90 min）濕轉(zhuǎn)（230 mA，90 min）至PVDF 膜，5%BSA 室 溫封 閉1 h，分 別 加入 兔 源PI3K、Akt、 p-PI3K（Y607）、p-Akt（Ser473）抗體（1∶1 000）、β-actin 抗體（1∶5 000） 4 ℃孵育過夜（12～16 h），加入羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST 充分洗膜，eECL（A 液、B 液各500 μl）避光顯色，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示，不同時間段各組比較采用重復測量數(shù)據(jù)的兩因素方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，符合方差齊性采用LSD-t檢驗，不符合方差齊性采用Dunnett T3 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和關節(jié)炎評分 給藥0～6周，CIA 組大鼠體質(zhì)量較Control 組顯著降低（P＜0.01），給藥4 周后，不同劑量FHD 治療組較CIA 組大鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01），F(xiàn)HD 高劑量組大鼠體質(zhì)量呈下降趨勢（圖1A）。CIA 組與不同劑量FHD 治療組關節(jié)炎評分顯著高于Control 組（P＜0.01），給藥 5 周后，不同劑量FHD 治療組關節(jié)炎評分顯著降低（P＜0.01，圖1B）。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量和關節(jié)炎評分Fig.1 Body weight and arthritis score of rats in each group

2.2 各組大鼠關節(jié)和脾臟病理學檢測 HE 染色結(jié)果顯示，Control 組大鼠關節(jié)組織結(jié)構(gòu)完整。CIA組關節(jié)腔內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，皮下滑膜組織增生伴血管翳形成，關節(jié)面粗糙，軟骨破壞明顯；與CIA組相比，不同劑量FHD 組大鼠關節(jié)軟骨形態(tài)改善，無明顯滑膜血管翳形成，可顯著抑制滑膜增生和炎癥細胞浸潤（圖2A）。CIA 大鼠脾臟內(nèi)淋巴樣白髓和主要生發(fā)中心增生明顯，不同劑量FHD 均可顯著減少生發(fā)中心總數(shù)并抑制白髓增生（圖2B）。

圖2 各組大鼠關節(jié)和脾臟病理改變及評分（×40）Fig.2 Pathological changes and scores of joints and spleen of rats in each group （×40）

2.3 各組大鼠血清炎癥因子表達 ELISA 結(jié)果顯示，與Control 組相比，CIA 組大鼠血清TNF-α、IL-1和IL-6 表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與CIA 組相比，低、中FHD劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1和IL-6表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），高劑量組TNF-α、IL-1表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠血清細胞因子水平Fig.3 Serum cytokine level of rats in each group

2.4 FHD 治療RA 的核心信號通路預測 網(wǎng)絡藥理學分析顯示，F(xiàn)HD 有效活性成分共270 個（防己 30 個、黃芪44 個、白術14 個、甘草190 個，黃芪和甘草共有成分8 個），潛在作用靶點762 個，RA 疾病靶點1 670 個，F(xiàn)HD 治療RA 潛在靶點250 個（圖4）。網(wǎng)絡拓撲分析結(jié)果顯示（表2），PPI網(wǎng)絡中各蛋白節(jié)點degree、closeness 和betweenness 平 均 值 分 別 為13.26、0.35、0.018，篩選出FHD 治療RA 的核心靶點30 個。核心靶點KEGG 富集分析結(jié)果表明：PI3K-Akt 通路為核心靶點富集最多的通路，提示FHD可能通過該通路發(fā)揮RA治療作用（圖5）。

圖5 核心靶點KEGG信號通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of core target KEGG signaling pathway

表2 核心靶點網(wǎng)絡拓撲參數(shù)Tab.2 Network topology parameters of core targets

圖4 FHD治療RA的PPI網(wǎng)絡Fig.4 PPI network in FHD therapy of RA

2.5 各組大鼠關節(jié)PI3K-Akt通路蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，CIA組p-PI3K、p-Akt表達顯著升高（P＜0.01），與CIA 組相比，不同劑量FHD 組大鼠關節(jié)PI3K、Akt 蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），各組大鼠PI3K、Akt表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖6A）。PI3K-Akt信號通路激活可調(diào)控細胞的存活、凋亡、增殖和分化，F(xiàn)HD 可能通過抑制p-PI3K、p-Akt 蛋白表達負調(diào)控PI3K-Akt 信號通路，進而抑制CIA 大鼠關節(jié)滑膜細胞增殖和破骨細胞分化、脾臟中淋巴細胞增殖、炎癥因子釋放緩解CIA 大鼠關節(jié)和脾病理損傷，發(fā)揮治療作用 （圖6C）。

圖6 各組大鼠關節(jié)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達 及FHD治療CIA大鼠的調(diào)控機制Fig.6 Protein expressions of PI3K， p-PI3K， Akt and p-Akt in joints of rats in each group and regulatory mechanism of FHD in CIA rats

3 討論

中醫(yī)經(jīng)典復方治療RA 具有獨特優(yōu)勢，臨床控制中藥用量對疾病治療十分重要，堅持“效毒權(quán)衡”原則才能達到最佳量效關系，指導臨床辨治疾?。?0］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量FHD 均可顯著緩解CIA 大鼠關節(jié)炎癥狀，但高劑量FHD 組大鼠體質(zhì)量自給藥4 周后呈下降趨勢，血清TNF-α 和IL-1 表達較CIA 組無明顯變化，提示8.8 g/（kg·d）FHD 可能產(chǎn)生毒副作用進而影響大鼠體質(zhì)量且尚未影響血清TNF-α 和IL-1 炎癥因子表達，推薦FHD 安全用藥劑量為2.2～4.4 g/（kg·d）。

TNF-α 主要由巨噬細胞和Th1 細胞分泌，在RA滑膜中廣泛存在，能夠促進IL-1、IL-6 等炎癥因子產(chǎn)生并形成級聯(lián)反應，加重RA 炎癥反應［21-22］。研究證實，RA 成纖維樣滑膜細胞（FLS）可被IL-1、IL-6、TNF-α 在內(nèi)的各種細胞因子激活，組織蛋白酶（CAT）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）高表達，膠原蛋白和蛋白聚糖分解，導致軟骨和骨骼破壞及關節(jié)侵蝕［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HD 可顯著緩解CIA 大鼠關節(jié)炎癥狀，抑制關節(jié)炎癥細胞浸潤、滑膜增生和軟骨破壞，降低血清TNF-α、IL-1、IL-6 表達，提示FHD 可能通過抑制炎癥因子生成緩解CIA 大鼠關節(jié)炎癥狀。

PI3K-Akt 通路可調(diào)控RA-FLS 增殖和凋亡，在RA炎癥反應中發(fā)揮重要作用［24-25］。研究表明，TNF-α等炎癥因子通過激活PI3K/Akt 通路大量釋放IL-1、IL-6等促炎因子，持續(xù)誘導FLS 增殖和炎癥反應，加重RA 病情［26］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通過促進破骨細胞形成與分化進而破壞骨質(zhì)與關節(jié)軟骨，導致關節(jié)畸形、僵硬，抑制該通路活化可能成為RA治療的新途徑［27］。MENG等［28］研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3KAkt 信號通路可促進IL-1β 刺激的RA-FLS 凋亡，降低TNF-α 和IL-6 表達。FENG 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt/mTOR 途徑可減少CIA 大鼠關節(jié)軟骨細胞增殖并加速細胞凋亡和自噬，有效改善關節(jié)炎癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，CIA組大鼠關節(jié)p-PI3K和p-Akt表達顯著增多，PI3K-Akt 通路異常激活，而不同劑量FHD 組p-PI3K 和p-Akt 表達較CIA 顯著降低，推測FHD 通過抑制PI3K-Akt 信號通路活化緩解CIA 大鼠炎癥反應和改善病理破壞。

綜上，不同劑量FHD 均可緩解CIA 大鼠關節(jié)炎癥狀，抑制關節(jié)腔內(nèi)滑膜增生和軟骨破壞，減少脾臟中白髓增生，降低血清炎癥因子表達，安全用藥范圍為2.2～4.4 g/（kg·d），其作用機制可能與抑制PI3K-Akt 信號通路活化有關。本研究對闡明FHD治療RA 的作用機制，及通過PI3K-Akt 信號通路靶向治療RA具有重要意義。