鄭小妹 林葉飛 張韶瓊 楊 潔 陳曼玲 （海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，?？?570100）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是我國(guó)婦科惡性腫瘤的常見(jiàn)類型，其發(fā)病率已位居?jì)D科惡性腫瘤第二位。EC主要發(fā)生于絕經(jīng)后婦女人群，僅有約7%的患者為20～44 歲，然而，近年來(lái)其在年輕女性中發(fā)生率逐漸升高［1-2］。盡管多數(shù)患者可在疾病早期診斷出，但仍有部分惡性程度高、發(fā)生轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性疾病的患者預(yù)后較差，甚至引發(fā)死亡［3］。EC 的傳統(tǒng)治療方法包括外科治療、免疫療法、放射療法及化學(xué)療法，其中一些療法不可避免地對(duì)人體造成損害并產(chǎn)生毒副作用。因此，在正常人體功能范圍內(nèi)尋找一種新型有效的治療方法對(duì)于EC 患者至關(guān)重要。

巨噬細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，參與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及血管生成等過(guò)程。外泌體（exosome，Exo）是由包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌的膜性囊泡，直徑為50～100 nm，參與許多細(xì)胞行為，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞間的信息交換過(guò)程，通過(guò)與靶細(xì)胞融合并釋放信號(hào)分子來(lái)介導(dǎo)表觀遺傳或非表觀遺傳機(jī)制，以調(diào)節(jié)基因表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化［4-5］。芍藥苷-6'-O-苯磺酸酯（paeoniflorin-6'-O-benzene sulfonate，CP-25）是一種酯化修飾合成的藥物，屬于芍藥苷的新型衍生物，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，但相關(guān)作用機(jī)制研究較少［6］。本研究從巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體著手，研究其對(duì)EC Ishikawa 細(xì)胞活性與轉(zhuǎn)移的影響，并檢測(cè)CP-25 干預(yù)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體后對(duì)Ishikawa 細(xì)胞的作用及機(jī)制，為EC的診治研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人單核細(xì)胞株THP-1 和人EC 細(xì)胞系Ishikawa（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）；CP-25（安徽臨床藥理研究所）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、RPIM1640培養(yǎng)基及DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司）；佛波酯（PMA，Sigma公司）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、ECL試劑液和結(jié)晶紫染液（上海碧云天生物研究所）；Transwell 小室（Corning 公司）；CCK-8 試劑盒、Hoechst 33342 染色試劑盒、免疫熒光染色試劑盒（南京諾唯贊生物公司）；Matrigel 膠和Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD公司）；CD9、CD63、Alix、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1 及P62 抗體（Abcam 公司）；GAPDH和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體（北京中杉金橋公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 THP-1 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)與誘導(dǎo) 在THP-1細(xì)胞中加入含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPIM1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2恒溫箱，消化傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為 1×106個(gè)/ml，接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿（直徑10 cm），加入含終濃度為100 ng/ml PMA 的RPMI1640 培養(yǎng)液，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 外泌體的分離與鑒定 使用PBS 洗滌誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞，加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)48 h 后，在低溫離心機(jī)中依次以300 g 離心15 min，留取上清液；2 000 g 離心15 min，留取上清液；10 000 g 離心30 min，留取上清液；再以100 000 g 離心1.5 h，棄上清液，加入PBS重懸沉淀，通過(guò)0.22 μmol/L 過(guò)濾器過(guò)濾，再次離心后獲得外泌體懸液。透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)，NTA 測(cè)量直徑，Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、Alix表達(dá)。

1.2.3 Western blot 在外泌體或細(xì)胞中加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，抽提總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。制備10%SDS-PAGE 膠，取各樣本等量蛋白上樣后進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白，以90 min、恒流200 mA 電轉(zhuǎn)至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，膜上滴加稀釋的兔抗人Alix、CD9、CD63、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；第2 天，TBST 溶液洗膜，滴加稀釋的HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體置于搖床，室溫繼續(xù)孵育1 h；結(jié)束后，TBST 溶液再次洗膜，ECL試劑液顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，觀察各蛋白表達(dá)情況，其中自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)以GAPDH 為內(nèi)參，Image J 圖像軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 CP-25干預(yù)外泌體 在Ishikawa細(xì)胞中添加含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，消化傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml，取 100 μl接種于96孔板，并隨機(jī)分為5組，分別按照以下方法進(jìn)行處理：①對(duì)照組：正常培養(yǎng)Ishikawa 細(xì)胞；②Exo 組：使用外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng) 24 h；③0.1 μmol/L CP-25+Exo 組：使用0.1 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h； ④0.5 μmol/L CP-25+Exo組：使用0.5 μmol/L CP-25干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h；⑤1 μmol/L CP-25+Exo組：使用1 μmol/L CP-25干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。置于37 ℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)，處理結(jié)束后，收集Ishikawa 細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性 調(diào)整各處理組Ishikawa 細(xì)胞密度，以1×103個(gè)/孔接種于96 孔板，使用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，并置于37 ℃、5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，CCK-8 是一種基于WST-8 的細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，原理是在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxy PMS）存在的情況下，能夠被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，顏色深淺與細(xì)胞增殖成正比。每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，混合均勻，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處各孔細(xì)胞的吸光度（OD）值。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn) 將50 μl 稀釋的Matrigel 膠包被于24 孔Transwell 小室上室底部，置于37 ℃恒溫箱使膠凝固。將各處理組Ishikawa 細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個(gè)/ml，取200 μl 細(xì)胞懸液加入包被Matrigel膠的Transwell 小室上室，下室加入600 μl 含10%胎牛血清新鮮培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng) 24 h，取出小室，棄培養(yǎng)液，擦去上室細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS 清洗干凈，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝圖像，隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)取其平均數(shù)，結(jié)果記為細(xì)胞侵襲數(shù)目。Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移中除不鋪Matrigel 膠外，其他步驟均與侵襲步驟一致。

1.2.7 Hoechst 33342 染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ishikawa細(xì)胞，將濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml，取100 μl接種于96 孔板，隨機(jī)分為4 組，分別按照以下方法處理：①對(duì)照組：正常培養(yǎng)Ishikawa 細(xì)胞；②3-MA 組：使用5 mmol/L 3-MA 處理Ishikawa細(xì)胞24 h；③Exo-CP-25組：使用0.5 μmol/L CP-25干預(yù)的外泌體與Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)24 h；④3-MA+Exo-CP-25組：使用5 mmol/L 3-MA處理Ishikawa細(xì)胞24 h，再用0.5 μmol/L CP-25干預(yù)的外泌體與Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。

收集各處理組Ishikawa 細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，滴加0.5%Triton X-100 透化15 min，PBS 洗滌細(xì)胞，滴加終濃度5 mg/L 的Hoechst 33342 染色，避光條件下室溫孵育30 min，PBS 再次洗滌細(xì)胞，脫水，封片并干燥，熒光顯微鏡觀察并拍攝圖像。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù) Ishikawa細(xì)胞按照1.2.7進(jìn)行分組處理后，0.25%胰蛋白酶消化，PBS 洗滌細(xì)胞，以4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，使用染色緩沖液1×binding buffer 重懸細(xì)胞，制備細(xì)胞密度為 1×106個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液，在無(wú)菌離心管內(nèi)加入 100 μl 單細(xì)胞懸液，分別依次加入10 μl Annexin V-FITC與5 μl PI，混勻，避光條件下室溫孵育15 min，在1 h 內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各處理組細(xì)胞凋亡比例。

1.2.9 透射電子顯微鏡檢測(cè) Ishikawa 細(xì)胞按照1.2.7 進(jìn)行分組處理后，PBS 洗滌細(xì)胞，以預(yù)冷的戊二醛固定過(guò)夜，再固定在四氧化鋨中，不同濃度梯度丙酮脫水，使用四乙酸鈾和檸檬酸三水合物進(jìn)行雙重染色，包埋，于Zeiss 910 透射電子顯微鏡下觀察各處理組細(xì)胞中自噬體形態(tài)。

1.2.10 免疫熒光染色 Ishikawa 細(xì)胞按照1.2.7進(jìn)行分組處理后，收集各處理組細(xì)胞，PBS 洗滌，使用4%多聚甲醛固定30 min，自來(lái)水沖洗去除殘留固定液，滴加0.5%TritonX-100 透膜處理15 min，再用10%山羊血清室溫封閉2 h后，滴加稀釋的兔抗人LC3B 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；第2 天，棄去一抗液，PBS洗滌干凈，滴加對(duì)應(yīng)熒光二抗，避光條件下室溫 孵育1 h，洗去未結(jié)合的二抗，滴加DAPI 室溫染色10 min，PBS 再次洗滌，封片并干燥，熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)，Image J圖像軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料均采用±s表示，多樣本比較采用單因素方差分析，組間樣本比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定 利用透射電子顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞提取物，可見(jiàn)其外形呈杯狀或球形，邊緣膜狀，測(cè)量其直徑約為120 nm（圖1A）。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，外泌體標(biāo)志蛋白Alix、CD9、CD63 均表達(dá)為陽(yáng)性（圖1B），表明分離的納米顆粒為外泌體。

圖1 分離的外泌體觀察與鑒定Fig.1 Observation and identification of isolated exosomes

2.2 CP-25干預(yù)巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)Ishikawa細(xì)胞活性的影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，與巨噬細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，Ishikawa細(xì)胞活性顯著提高（P＜0.05）；而使用0.1、0.5、 1.0 μmol/L CP-25干預(yù)巨噬細(xì)胞外泌體再與Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，Ishikawa 細(xì)胞活性均明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各處理組Ishikawa細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值比較（±s）Tab.1 Comparison of absorbance values of Ishikawa cells at different time points in each treatment group （±s）

表1 各處理組Ishikawa細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值比較（±s）Tab.1 Comparison of absorbance values of Ishikawa cells at different time points in each treatment group （±s）

Note： Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with Exo group， 2）P＜0.05.

2.3 CP-25干預(yù)巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與巨噬細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)的Ishikawa 細(xì)胞，其遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；而經(jīng)0.1、0.5、1.0 μmol/L CP-25干預(yù)巨噬細(xì)胞外泌體再與Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)后，與巨噬細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)的Ishikawa細(xì)胞相比，各處理組Ishikawa 細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各處理組Ishikawa 細(xì)胞遷移與侵襲能力Fig.2 Transwell chamber experiment to detect migration and invasion ability of Ishikawa cells in each treatment group

2.4 CP-25干預(yù)巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)Ishikawa細(xì)胞凋亡的影響 通過(guò)Hoechst 33342 染色從形態(tài)上觀察各處理組Ishikawa 細(xì)胞的凋亡情況，可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞偶見(jiàn)核濃縮；3-MA處理的細(xì)胞核外圍輪廓較為清晰，未見(jiàn)明顯核濃縮；0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞中有較多濃縮、碎裂的藍(lán)色凋亡體；而經(jīng)5 mmol/L 3-MA 處理Ishikawa細(xì)胞再用0.5 μmol/L CP-25干預(yù)的外泌體與Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞核濃縮與碎裂的現(xiàn)象明顯減少，見(jiàn)圖3。

圖3 Hoechst 33342 染色觀察各處理組Ishikawa 細(xì)胞凋亡（×100）Fig.3 Hoechst 33342 staining to observe apoptosis of Ishikawa cells in each treatment group （×100）

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)3-MA處理的Ishikawa 細(xì)胞凋亡率顯著降低，0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡率顯著提高（P＜0.01）；而相較于0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)組， 5 mmol/L 3-MA 處理Ishikawa 細(xì)胞再用0.5 μmol/L CP-25干預(yù)的外泌體與Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各處理組Ishikawa細(xì)胞凋亡Fig.4 Flow cytometry detection of Ishikawa cell apoptosis in each treatment group

2.5 CP-25干預(yù)巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)Ishikawa細(xì)胞自噬的影響 通過(guò)免疫熒光染色觀察Ishikawa 細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)，與對(duì)照組相比，3-MA 處理的細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)明顯減弱，LC-3 表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，而0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)，LC-3 表達(dá)強(qiáng)度則顯著提高（P＜0.01）；5 mmol/L 3-MA 處理Ishikawa 細(xì)胞后再用0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)明顯減弱，LC-3表達(dá)強(qiáng)度顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 免疫熒光染色檢測(cè)各處理組Ishikawa細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)（×200）Fig.5 Immunofluorescence staining to detect expression of autophagy marker LC3 in Ishikawa cells of each treatment group （×200）

透射電子顯微鏡觀察到對(duì)照組細(xì)胞偶見(jiàn)自噬體，3-MA 處理的Ishikawa 細(xì)胞未觀察到自噬體， 0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)多個(gè)由單層膜或雙層膜組成的自噬體，5 mmol/L 3-MA 處理Ishikawa 細(xì)胞再用0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞中自噬體較少，見(jiàn)圖6。

圖6 透射電子顯微鏡觀察自噬體（×10 000）Fig.6 Observation of autophagosomes by transmission electron microscope （×10 000）

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，3-MA處理的Ishikawa細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)減少，P62 蛋白表達(dá)增多，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著下調(diào)，而0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達(dá)增加，P62 蛋白表達(dá)減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著上調(diào)（P＜0.01）；與0.5 μmol/L CP-25干預(yù)的外泌體與Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞相比，5 mmol/L 3-MA 處理Ishikawa細(xì)胞后再用0.5 μmol/L CP-25 干預(yù)的外泌體與Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達(dá)減少，P62 蛋白表達(dá)增多，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著下調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖7 Western blot 檢測(cè)各處理組Ishikawa 細(xì)胞自噬相關(guān) 蛋白表達(dá)Fig.7 Western blot detection of autophagy-related proteins expressions of Ishikawa cells in each treatment group

3 討論

目前，EC已成為多個(gè)國(guó)家和地區(qū)主要的婦科惡性腫瘤疾病之一，其發(fā)病率和病死率呈不斷上升趨勢(shì)，給患者和社會(huì)造成了越來(lái)越高的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。與EC發(fā)生相關(guān)的因素包括雌激素抵抗、飲食、肥胖、代謝紊亂和子宮內(nèi)膜增生等，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚不完全清楚［2］。盡管各項(xiàng)治療手段技術(shù)取得了一定的進(jìn)步，但在各種臨床試驗(yàn)中觀察到了低應(yīng)答率或不良反應(yīng)等現(xiàn)象，例如免疫療法的應(yīng)答率僅為13%［7］。迄今為止，尚無(wú)針對(duì)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)性EC 患者的精準(zhǔn)治療方法。

在既往研究中，CP-25 顯示出良好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性，例如，CP-25 通過(guò)減少滑膜炎癥和抑制炎癥反應(yīng)明顯抑制了小鼠自身免疫性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，該作用與其對(duì)免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等）的功能調(diào)節(jié)及免疫細(xì)胞和G 蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路的相互作用密切相關(guān)［8-9］；CP-25 通過(guò)抑制JAK1-STAT1/2-CXCL13 信號(hào)途徑并干擾 B 細(xì)胞向唾液腺的遷移來(lái)緩解抗原誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性干燥綜合征［10］；CP-25 對(duì)甲氨蝶呤誘導(dǎo)的大鼠腎毒性具有良好的保護(hù)作用，這種作用通過(guò)抗腎細(xì)胞凋亡和排毒特性實(shí)現(xiàn)［11］。此外，關(guān)于CP-25 在腫瘤中的作用研究也在逐步開(kāi)展。然而，關(guān)于CP-25 是否具有抗EC 的作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，值得進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)探究。

外泌體是大多數(shù)細(xì)胞類型分泌的膜囊泡，已確定其在腫瘤生物學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域的細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。其不同特征和功能主要取決于來(lái)源的細(xì)胞類型，其中一些細(xì)胞特定的生物活性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)被包裝在外泌體中。其中，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠促進(jìn)血管生成，重塑基質(zhì)并調(diào)節(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［12］。此外，這還代表了一系列的免疫抑制機(jī)制。例如，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體以誘導(dǎo)活化的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨髓單核細(xì)胞的分化或關(guān)閉自然殺傷細(xì)胞的反應(yīng)［13］。由于不同環(huán)境中細(xì)胞的可塑性，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是一組異質(zhì)單核巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞，能夠根據(jù)不同的刺激表現(xiàn)出不同表型，活化的巨噬細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)的遷移、吞噬作用及抗原加工和呈遞對(duì)刺激做出反應(yīng)，并分泌各種細(xì)胞因子，通過(guò)募集更多極化的巨噬細(xì)胞，以反饋的方式放大或減小炎癥信號(hào)。已有研究表明，巨噬細(xì)胞釋放的外泌體可被心肌組織中的心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等吸收［14］。巨噬細(xì)胞外泌體還在多種生理及病理?xiàng)l件下發(fā)揮重要作用，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)和耐藥。近期研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞外泌體參與癌細(xì)胞代謝重編程，還可抑制特異性免疫細(xì)胞功能［15-16］。

本研究對(duì)分離的巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其外形呈球形至杯形，直徑約為120 nm，外泌體標(biāo)志蛋白Alix、CD9、CD63 均呈陽(yáng)性表達(dá)，以上結(jié)果均表明成功分離并得到巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體共培養(yǎng)的EC Ishikawa 細(xì)胞，其細(xì)胞活性與遷移侵襲能力均明顯提高。為進(jìn)一步探討CP-25是否能夠介導(dǎo)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體分泌影響EC Ishikawa 細(xì)胞，通過(guò)使用CP-25 干預(yù)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體并與EC Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖活性下降，同時(shí)，細(xì)胞的遷移數(shù)與侵襲數(shù)均明顯減少。由此推測(cè)，CP-25可能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體的分泌從而調(diào)控EC Ishikawa細(xì)胞的生物學(xué)行為。

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡一直是腫瘤研究中的重點(diǎn)內(nèi)容，細(xì)胞死亡過(guò)程復(fù)雜，涉及一系列調(diào)控因子，且越來(lái)越多的證據(jù)表明，許多類型的癌癥都可發(fā)展為具有抗凋亡特性的細(xì)胞，例如各種化療藥物的使用使得腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療抗性［17-18］。自噬是調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制，通過(guò)觸發(fā)降解細(xì)胞質(zhì)大分子物質(zhì)或細(xì)胞器為自身提供能量，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)的主要組成部分之一。過(guò)度自噬會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，且激發(fā)自噬死亡機(jī)制可使耐藥腫瘤細(xì)胞發(fā)生死亡，因此，以自噬作為細(xì)胞死亡發(fā)生機(jī)制是針對(duì)癌癥治療的一種反應(yīng)［19-20］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CP-25 干預(yù)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體并與EC Ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞凋亡增加，自噬水平也增加，由此推測(cè)，CP-25 可能干預(yù)EC Ishikawa 細(xì)胞自噬性死亡。為了驗(yàn)證這一猜想，通過(guò)自噬抑制劑3-MA 處理Ishikawa 細(xì)胞，再用CP-25 干預(yù)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體與EC Ishikawa 細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率降低，同時(shí)細(xì)胞自噬水平也降低。

綜上所述，本研究揭示了CP-25 干預(yù)巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)EC Ishikawa 細(xì)胞的作用，可抑制Ishikawa 細(xì)胞的活性、遷移與侵襲，調(diào)控自噬性死亡過(guò)程，為EC 病理機(jī)制與治療的研究提供了新視角。但CP-25干預(yù)巨噬細(xì)胞來(lái)源外泌體中的潛在靶點(diǎn)分子有待進(jìn)一步深入探究，以期為EC 的診治提供新途徑。