羅嬌依 ,鄭越男 ,劉彤彤 ,曹 進 ,郭亞輝 ,孫姍姍*

(1.中國食品藥品檢定研究院 國家市場監(jiān)管重點實驗室(食品質(zhì)量與安全),北京 100050;2.松滋市公共檢驗檢測中心,松滋 434200;3.江南大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,無錫 214122)

目前,已有多種食品分析技術(shù)應(yīng)用于食品物種鑒別及過敏原檢測,但可同時完成食品物種鑒別和過敏原檢測的快速、可靠、高靈敏度的分析方法尚有待開發(fā)。DNA 條形碼技術(shù)和定量免疫學(xué)分析技術(shù)(如免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法)是傳統(tǒng)魚類鑒別的重要方法[1-2],前者可提供魚類清晰可識別的DNA 序列,為水產(chǎn)品鑒定開辟新途徑,提供水產(chǎn)品的物種序列[3-4]。雖然DNA 序列指導(dǎo)蛋白合成,但DNA 片段在基因表達(dá)過程中能否正確表達(dá)出過敏原蛋白具有不確定性,不能直接檢測產(chǎn)品中的致敏蛋白;另一方面,食品基質(zhì)及加工過程的復(fù)雜性會影響DNA 的提取效率,因此DNA 條形碼技術(shù)在過敏原檢測應(yīng)用中存在局限性。定量免疫學(xué)分析技術(shù)不僅能對物種進行鑒別,還可以對過敏原成分進行檢測,但是該方法靈敏度較低[5],食品基質(zhì)的復(fù)雜性以及食品加工步驟可能改變蛋白結(jié)構(gòu),干擾對物種特異性蛋白的識別,從而出現(xiàn)假陰性或假陽性[6]。

基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)不僅可以對食品中的目標(biāo)蛋白進行鑒定,還可以完成食品真實性鑒別,該技術(shù)有自上而下和自下而上兩種途徑[7]。物種不同但關(guān)系密切的同源蛋白可能僅存在幾種氨基酸差異[8],這種差異很難被捕捉,因此自上而下研究策略不適用于物種鑒別。而自下而上研究策略是通過蛋白酶在特定位點切割蛋白形成多肽片段,對特定肽段的氨基酸序列進行分析,從而實現(xiàn)不同肽段在氨基酸序列水平上的分離[9-11]。這些特定肽段可被用作食品過敏原的生物標(biāo)志物,也可作為物種真實性鑒別的標(biāo)志性肽段。食品檢驗中選擇特殊性強、差異化大的生物標(biāo)志性肽段對于開發(fā)一種特定、通用的方法具有十分重要的意義[12]。文獻(xiàn)[8]通過超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法篩選出大西洋鮭和虹鱒魚的各5種生物標(biāo)志性肽段,并對其特異性和穩(wěn)定性進行考察,其中大西洋鮭的生物標(biāo)志性肽段GDPGPGQQGVGPGGVGPAGGDK可用于大西洋鮭中虹鱒魚摻假含量的定量檢測,并成功區(qū)分了不同地區(qū)和不同批次的大西洋鮭和虹鱒魚樣品。文獻(xiàn)[13-15]通過硫酸銨鹽析、離子交換層析結(jié)合凝膠過濾方法對大西洋鮭中的小清蛋白進行純化,得到的小清蛋白純度達(dá)90%以上,應(yīng)用免疫印跡法對純化的小清蛋白進行過敏原性鑒定,結(jié)合激光輔助解析-飛行時間質(zhì)譜法進行結(jié)構(gòu)鑒定,采用圓二色譜、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)熒光探針及紫外-可見光譜技術(shù)研究了超聲處理對大西洋鮭中的小清蛋白抗原性和結(jié)構(gòu)的影響。鑒于此,本工作采用納升液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法(Nano-UHPLC-Q/Exactive-HRMS)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)篩選、鑒定大西洋鮭的生物標(biāo)志性肽段和β-小清蛋白特異性肽段,并建立目標(biāo)肽段的定量方法,旨在為大西洋鮭中過敏原β-小清蛋白的檢測及大西洋鮭物種鑒別提供技術(shù)支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Nano Ultimate 3000型液相色譜儀;Q-Extractive plus Orbitrap型質(zhì)譜儀,配DPV 550 digital pico VIEW nanospray 型離子源;UPLC-Xevo TQ-S型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀;Bio Tek SYNERGY HT 型酶標(biāo)儀;ZWF-110X30型恒溫水浴搖床;CF16RXⅡ型離心機;SORVALL Legend MICRO 21R 型離心機。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1 mmol·L-1,將4種標(biāo)準(zhǔn)特異性肽段及其同位素內(nèi)標(biāo)分別溶于水,配制成1 mmol·L-1單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

磷酸鹽緩沖溶液(PBS):取1片PBS片劑溶于100 mL 水,配制成 含0.01 mol·L-1磷酸鹽、0.002 7 mol·L-1氯化鉀、0.137 mol·L-1氯化鈉的PBS。

二硫蘇糖醇(DTT)溶液:500 mmol·L-1,稱取7.7 mg DTT 標(biāo)準(zhǔn)品粉末,溶 于100 μL 50 mmol·L-1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液(pH 8.0),配制成500 mmol·L-1DTT 溶液。

碘乙酰胺(IAA)溶液:100 mmol·L-1,稱取18.6 mg IAA 標(biāo)準(zhǔn)品粉末,溶于1 mL 8 mol·L-1尿素溶液,配制成100 mmol·L-1IAA 溶液。

標(biāo)準(zhǔn)特異性肽段VAVNVEETK(纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸-天冬酰胺-纈氨酸-谷氨酸-谷氨酸-蘇氨酸-賴氨酸)及其內(nèi)標(biāo)V*(13C6,15N)AVNVEETK[V*(13C6,15N)同位素標(biāo)記纈氨酸]、VAPLSEDFK(纈氨酸-丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-絲氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸)及其內(nèi)標(biāo)VAPL*(13C6,15N)SEDFK[L*(13C6,15N)同位素標(biāo)記亮氨酸]、LTEIQSLER(亮氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-谷氨酰胺-絲氨酸-亮氨酸-谷氨酸-精氨酸)及其內(nèi)標(biāo)L*(13C6,15N)TEIQSLER[L*(13C6,15N)同位素標(biāo)記亮氨酸]、TFFHTIGFASK(蘇氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-組氨酸-蘇氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-絲氨酸-賴氨酸)及其內(nèi) 標(biāo)TF*(13C6,15N)FHTIGFASK[F*(13C6,15N)同位素標(biāo)記苯丙氨酸]的純度均不小于98%;胰蛋白酶(批號UA278568)、甲酸、乙腈、異丙醇、無水乙醇均為質(zhì)譜級;DTT、IAA 標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于99%;鹽酸為優(yōu)級純;三羥甲基氨基甲烷和尿素均為分析純;試驗用水為超純水。

豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉、扇貝、章魚、青龍蝦、基圍蝦、黑虎蝦、鮑魚、生蠔、虹鱒魚、大西洋鮭(挪威大西洋鮭)等樣品均為市售產(chǎn)品。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 Nano-UHPLC-Q/Exactive-HRMS

1)色譜條件 C18毛細(xì)管柱(15 cm×75μm,3μm);AcclaimTMPep MapTM100 Trap C18色譜柱(2 cm×100μm,5μm);Loading泵系統(tǒng),流動相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為含0.1%甲酸的50%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇溶液,流量5.0μL·min-1;Nano泵系統(tǒng),流動相A 為0.1%甲酸溶液,B為含0.1%甲酸的80%(體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液,流量0.3μL·min-1;柱溫4℃,樣品室溫度4℃;進樣量10μL。Nano泵系統(tǒng)梯度洗脫程序:0～10 min時,B為5%;10～95 min時,B 由5%升至70%;95～100 min時,B由70%升至90%;100～130 min時,B由90%降至5%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子(ESI＋)模式電離,一級全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級子離子模式(Full MS/dd-MS2)掃描;噴霧電壓2.5 kV;毛細(xì)管溫度250 ℃。Full MS掃描參數(shù):分辨率70 000;目標(biāo)自動增益控制(AGC)值1×106;最大注入時間60 ms;掃描范圍 質(zhì)荷比(m/z)300～1 500。dd-MS2掃描參數(shù):分辨率17 500;目標(biāo)AGC值1×105;最大注入時間60 ms;循環(huán)次數(shù)(Loop count)為10;最強離子數(shù)(Top N)為10;四極桿隔離窗口m/z2。

1.2.2 UHPLC-MS/MS

1)色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫30 ℃,樣品室溫度10 ℃;流量0.3 mL·min-1;進樣量5μL;流動相A 為0.1%甲酸溶液,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～1 min時,B為5%;1～3 min時,B由5%升至70%;3～4 min時,B 由70%升至100%;4～6 min時,B由100%降至5%。

2)質(zhì)譜條件 ESI＋模式電離,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式掃描;毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度120 ℃;脫溶劑氣流量1 000 L·h-1,脫溶劑氣溫度500 ℃;錐孔氣流量150 L·h-1;碰撞氣為氬氣,流量0.15 mL·min-1;目標(biāo)肽段及其內(nèi)標(biāo)的MRM 參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)肽段及其內(nèi)標(biāo)的MRM 參數(shù)Tab.1 MRM parameters of the target peptides and its internal standards

1.3 試驗方法

1.3.1 數(shù)據(jù)分析

Nano-UHPLC-Q/Exactive-HRMS 原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入PEAKS蛋白鑒定分析軟件(版本8.0),進行De Novo、PEAKS DB、PEAKS PTM 分析。設(shè)定錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于0.01、母離子容錯度為10-5、每條肽段允許最大漏切數(shù)目為2;設(shè)定酰胺甲基化、去酰胺化、氧化、乙酰化修飾方式,每條肽段最多允許3種不同修飾方式,避免修飾過多導(dǎo)致肽段特異性匹配度降低。從Uniprot 網(wǎng)站(網(wǎng)址http://www.uniprot.org)下載大西洋鮭物種蛋白全序列譜庫,作為原始數(shù)據(jù)匹配依據(jù)。

1.3.2 蛋白提取、富集和純化

將大西洋鮭去除頭部、內(nèi)臟、魚皮與魚刺,攪碎后冷藏于-20 ℃。稱取5 g樣本于50 mL離心管,加入10 mL 正己烷,渦旋5 min,于4 ℃以轉(zhuǎn)速9 000 r·min-1離心10 min;移除上清液,于沉淀中加入5 mL PBS(提取劑),渦旋5 min,于60 ℃水浴加熱30 min,再于4 ℃以轉(zhuǎn)速9 000 r·min-1離心10 min;取全部上清液,加入20 mL冷丙酮(丙酮于-20 ℃放置過夜),渦旋混勻,于-20 ℃靜置2 h,再于4 ℃以轉(zhuǎn)速9 000 r·min-1離心10 min;移除上清液,沉淀用10 mL PBS復(fù)溶,過0.2μm 聚丙烯(GHP)膜。

1.3.3 總蛋白含量的測定

采用Brad-ford 試劑盒測定總蛋白含量。向96孔板中依次加入50μL PBS、5μL蛋白提取液或5μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液系列(質(zhì)量濃度依次為0.125,0.25,0.50,0.75,1.0,1.5,2.0 g·L-1)、200μL 考 馬斯亮藍(lán)染液,用酶標(biāo)儀測定吸光度(測定波長為595 nm)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)進行線性回歸,根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中總蛋白含量。將蛋白提取液質(zhì)量濃度稀釋或濃縮至2.0 g·L-1后,待酶解。

1.3.4 蛋白酶解

1)高分辨質(zhì)譜分析樣本的酶解 移取含2.0 g·L-1蛋白的大西洋鮭提取液200μL,加入8 mol·L-1尿素溶液200μL,500 mmol·L-1DTT溶液40μL,于37℃水浴加熱2 h,加入100 mmol·L-1IAA 溶液50μL,于暗處反應(yīng)1 h 后,再加入500 mmol·L-1DTT 溶液50μL。參考文獻(xiàn)[16-17],按照胰蛋白酶與總蛋白質(zhì)量比為1∶20的比例加入胰蛋白酶,渦旋混勻后,于30 ℃搖床中以轉(zhuǎn)速60 r·min-1孵育16 h,取出,加入10μL 甲酸終止反應(yīng),用水定容至1 mL,再于4℃以轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1離心10 min,上清液過0.2μm GHP 膜,待Nano-UHPLC-Q/Exactive-HRMS分析。

2)定量質(zhì)譜分析樣本的直接酶解 移取含2.0 g·L-1蛋白的大西洋鮭提取液100μL,按照胰蛋白酶與總蛋白質(zhì)量比為1∶20的比例加入胰蛋白酶,隨后步驟同高分辨質(zhì)譜分析樣本的酶解方法,并在酶解后加入內(nèi)標(biāo),使其濃度為2.00μmol·L-1,得到的濾液待UHPLC-MS/MS 分析。經(jīng)多次驗證,提取液處于相同蛋白濃度水平下,省去變性與還原步驟直接酶解時,被檢測離子對的豐度不受影響,可縮短操作時間,節(jié)省試驗成本,此結(jié)果同文獻(xiàn)[17]結(jié)果一致。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性肽段的初級篩選及物種間交叉源性的二級篩選

大西洋鮭物種特異性肽段的初級篩選是基于自下而上的蛋白鑒定策略。首先采用Full MS模式掃描樣本溶液中的母離子,四極桿進一步篩選響應(yīng)值前10位的母離子碎裂出的子離子,并動態(tài)循環(huán)掃描,采集子離子信息;然后采用dd-MS2模式掃描,提供肽段母離子及其子離子的實際質(zhì)量數(shù),并與肽段b/y型裂解的氨基酸序列對應(yīng)的理論質(zhì)量數(shù)匹配,使用PEAKS軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析。結(jié)果共計鑒定出636種大西洋鮭蛋白,2 406條肽段。

特異性肽段的篩選一般遵循以下原則:①選擇無缺失位點、無修飾、無漏切、響應(yīng)值高、肽段長度為7～20個氨基酸;②排除含不穩(wěn)定翻譯后修飾基團的氨基酸序列;③排除含易氧化基團的氨基酸M(甲硫氨酸)與W(色氨酸)所在的肽段序列[18];④選取離子化后帶兩個正電荷的肽段,更有利于定量質(zhì)譜分析。對于大西洋鮭中特定過敏原β-小清蛋白(序列號A0A286KA18),經(jīng)篩選、酶切后鑒定出29條肽段(表2),其中僅第1～14條肽段符合特異性肽段屬性。對于大西洋鮭物種特異性肽段,選擇出26條來源于不同蛋白的高豐度肽段(表3),但這些肽段兼顧篩選要求的同時,其來源蛋白的特性應(yīng)首先被評估,包括蛋白鑒定后在樣本中的豐度、自身穩(wěn)定性以及同源性等。例如,表3中α肌動蛋白、肌球蛋白-6作為肌肉蛋白在大西洋鮭中的豐度極高,肽段雖然符合篩選要求,但蛋白序列與其他物種的同源性也高度相似,可以排除作為特異性肽段篩選的來源蛋白。除此之外,還鑒定到了如丙酮酸激酶等多個中高豐度且參與代謝過程的酶類蛋白,但在蛋白提取過程中保持酶類蛋白穩(wěn)定難度極大,其溶解性也各不相同,若自身結(jié)構(gòu)在胰蛋白酶酶解前被破壞,會影響定量質(zhì)譜分析,導(dǎo)致回收率降低,甚至無法檢出。因此,鑒定出蛋白后,應(yīng)根據(jù)試驗?zāi)繕?biāo)依次對每個來源蛋白進行評估,綜合考慮肽段和來源蛋白的性質(zhì),從而完成特異性肽段的初步篩選。

表2 β-小清蛋白酶切后的肽段序列Tab.2 Peptide sequences ofβ-parvalbumin after enzymolysis

表2 (續(xù))

表3 大西洋鮭中高豐度肽段序列Tab.3 High abundant peptide sequences in Salmo salar

大西洋鮭物種特異性肽段的交叉源性二級篩選有兩個步驟。①BLAST 交叉源性二級篩選:通過Uniprot數(shù)據(jù)庫中BLAST 檢驗工具(網(wǎng)址https://www.uniprot.org/blast/)對初選肽段進行交叉源性二級篩選,經(jīng)BLAST 檢驗工具確認(rèn),分析同源性概率,結(jié)果篩選到過敏原特異性肽段1條(表2中△標(biāo)記)、生物標(biāo)志性肽段3條(表3中△標(biāo)記);②交叉源性定量質(zhì)譜驗證:以上4 條目標(biāo)肽段在雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、章魚、青龍蝦、基圍蝦、黑虎蝦、鮑魚、生蠔、扇貝的蛋白提取液中均未檢出。圖1展示了在與大西洋鮭極其相似的虹鱒魚提取液中4條目標(biāo)肽段的檢測結(jié)果。結(jié)果表明,作為魚類主要過敏原的β-小清蛋白酶切肽段被檢出[圖1(a)],但大西洋鮭的3條生物標(biāo)志性肽段未檢出[圖1(b)],說明大西洋鮭的3 條生物標(biāo)志性肽段對于虹鱒魚無特異性。

圖1 目標(biāo)肽段的子離子質(zhì)譜圖Fig.1 Daughter ion MS spectra of the target peptides

2.2 MRM 特異性肽段驗證

MRM 被公認(rèn)是靈敏度較高的檢測方法,在食品靶向蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用廣泛[19]。由于高分辨質(zhì)譜儀碰撞能量供給方式與普通定量質(zhì)譜不同,當(dāng)定量方法轉(zhuǎn)化時,所篩選的離子對未必在定量質(zhì)譜碰撞池中形成預(yù)測的子離子,因此需要將所篩選的大西洋鮭中生物標(biāo)志性肽段與過敏原特異性肽段的酶解溶液進一步經(jīng)MRM 分析確認(rèn),結(jié)果見圖2。

圖2 目標(biāo)肽段的二級質(zhì)譜圖Fig.2 Secondary MS spectra of the target peptides

結(jié)果表明:高分辨質(zhì)譜得到的肽段二級碎片離子(y離子)在定量質(zhì)譜中均能被檢測到,且高分辨質(zhì)譜的二級質(zhì)譜圖中高豐度的y離子在定量質(zhì)譜中的響應(yīng)值高,可用于定量分析。

2.3 UHPLC-MS/MS質(zhì)譜條件的優(yōu)化

移取適量的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水稀釋,配制成4條目標(biāo)肽段的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.2.2 節(jié)UHPLC-MS/MS儀器工作條件對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行二級質(zhì)譜掃描,選擇豐度高且穩(wěn)定的兩個子離子分別作為定性離子和定量離子,并優(yōu)化碰撞電壓和錐孔電壓,優(yōu)化后的MRM 參數(shù)見表1?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖見圖3。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of the mixed standard solution

2.4 蛋白提取條件的優(yōu)化

通過L9(33)正交試驗對料液比(樣品質(zhì)量∶提取液體積)、提取時間、提取溫度等進行優(yōu)化,根據(jù)檢測到的肽段含量與樣品總蛋白含量之比計算提取率。正交試驗方案及結(jié)果見表4,極差分析結(jié)果見表5。

表4 正交試驗方案及結(jié)果Tab.4 Scheme and results of the orthogonal test

表5 極差分析結(jié)果Tab.5 Results of the range analysis

結(jié)果表明:影 響 VAPLSEDFK、VAVNVEETK、LTEIQSLER 提取率的主要因素依次是提取溫度、料液比、提取時間,影響TFFHTIGFASK 提取率的主要因素依次是提取溫度、提取時間、料液比;VAPLSEDFK、VAVNVEETK、TFFHTIGFASK 的最佳提取溫度與提取時間均為60 ℃和30 min;LTEIQSLER 的最佳提取溫度與提取時間為40 ℃和2 h。但由于LTEIQSLER 提取率均可達(dá)到15%以上,而其他肽段提取率都在7%以下,為使更多肽段具有較高提取率,則優(yōu)先考慮VAPLSEDFK、VAVNVEETK、TFFHTIGFASK的最佳提取條件。因此,試驗選擇的料液比為1∶1(即當(dāng)樣品質(zhì)量為5 g時,提取液體積為5 mL),提取溫度為60 ℃,提取時間為30 min,此時4條目標(biāo)肽段均具有較高的提取率。

2.5 蛋白富集、純化方式的優(yōu)化

試驗比較了超濾管(截留分子量3 k Da)和冷丙酮對蛋白富集、純化的效果,并考察了冷丙酮加入量(提取液體積的1,2,4,6倍,即5,10,20,30 mL)對 4條目標(biāo)肽段提取率的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 超濾管和丙酮對目標(biāo)肽段提取率的影響Fig.4 Effects of ultrafiltration and acetone on the extration rates of the target peptides

結(jié)果表明:超濾管對蛋白富集、純化效果低于冷丙酮,這可能是由于冷丙酮與水的親和力強,能破壞蛋白分子的水化膜[20],使蛋白變性、沉淀并終止蛋白本身的分解[21];當(dāng)加入20 mL 冷丙酮時,LTEIQSLER、VAPLSEDFK、VAVNVEETK、TFFHTIGFASK 的提取率均較高。因此,試驗選擇采用20 mL冷丙酮富集、純化蛋白。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取適量的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用水稀釋,配制成VAVNVEETK、VAPLSEDFK、LTEIQSLER 濃 度為0,0.01,0.10,0.50,1.00,5.00 μmol·L-1,TFFHTIGFASK濃度為0,0.50,1.00,2.50,5.00,10.00μmol·L-1,內(nèi)標(biāo)濃度為2.00μmol·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照UHPLC-MS/MS儀器工作條件進行測定,以目標(biāo)肽段與內(nèi)標(biāo)濃度之比為橫坐標(biāo),二者峰面積之比為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見表6。以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結(jié)果見表6。

表6 線性參數(shù)和檢出限Tab.6 Linearity parameters and detection limits

2.7 精密度和回收試驗

將豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉按照1∶1∶1∶1的質(zhì)量比混合,得到空白樣品。在空白樣品提取液中添加低、中、高等3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照試驗方法提取、富集、純化、直接酶解蛋白后,按照UHPLC-MS/MS 儀器工作條件進行測定,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表7。

表7 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.7 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

結(jié)果顯示:4條目標(biāo)肽段的回收率為90.2%～105%,測定值的RSD 為1.5%～4.6%。

2.8 樣品分析及大西洋鮭新鮮度評價

按照試驗方法對大西洋鮭貯存過程中VAVNVEETK、VAPLSEDFK、LTEIQSLER、TFFHTIGFASK 的含量進行測定。試驗發(fā)現(xiàn),在4 ℃條件下貯存4 d時,大西洋鮭樣品色澤稍暗淡,略帶異味,肌肉組織不致密但也不松散;貯存至10 d時,大西洋鮭樣品色澤暗淡,肌肉切面無光澤,有強烈的腥臭味,肌肉組織松散不致密,肌肉受壓后凹陷不消失,失去肌肉彈性,需停止貯存期的測定。測定結(jié)果見表8。

表8 大西洋鮭貯存過程中目標(biāo)肽段的含量Tab.8 Contents of the target peptides in Salmo salar during storage μg·g-1

結(jié)果顯示:來自富含亮氨酸蛋白-20 的生物標(biāo)志性肽段LTEIQSLER 和β-小清蛋白特異性肽段TFFHTIGFASK 的含量沒有發(fā)生明顯變化,而來自載脂蛋白A1的生物標(biāo)志性肽段VAVNVEETK、VAPLSEDFK 的含量隨貯存天數(shù)的延長逐漸減少,此結(jié)果與文獻(xiàn)[16]的研究結(jié)果一致,說明大西洋鮭中載脂蛋白A1含量隨貯存期的延長而減少,因此該蛋白有望成為判別大西洋鮭新鮮度的指標(biāo);貯存0～4 d 時,VAVNVEETK、VAPLSEDFK 含量相近;貯存6～10 d 時,VAVNVEETK 含量約為VAPLSEDFK的50%,并且8～10 d 時VAVNVEETK 含量在檢出限附近,而VAPLSEDFK 含量的下降幅度略緩慢,因此VAPLSEDFK 更適合作為大西洋鮭新鮮度評價指標(biāo)。來源相同的不同肽段在貯存過程中含量變化不一致的原因可能是因為VAVNVEETK 更容易被氧化,貯存環(huán)境加速了該肽段中氨基酸的降解[22]。

本工作基于蛋白質(zhì)組學(xué)自下而上研究策略,采用Nano-UHPLC-Q/Exactive-HRMS 和UHPLCMS/MS,篩選、鑒定大西洋鮭物種的生物標(biāo)志性肽段(VAVNVEETK、VAPLSEDFK、LTEIQSLER)和過敏原β-小清蛋白的特異性肽段(TFFHTIGFASK),對蛋白的提取條件、富集、純化方法進行優(yōu)化,并提出了UHPLC-MS/MS快速測定大西洋鮭中生物標(biāo)志性肽段和過敏原β-小清蛋白特異性肽段含量的方法。該方法分析快速、檢出限低、特異性好,提高了測定的靈敏度,減少了交叉反應(yīng)的干擾,推廣了肽段在大西洋鮭新鮮度評價中的適用性,為大西洋鮭中過敏原β-小清蛋白的檢測、大西洋鮭物種鑒別及新鮮度評價提供技術(shù)支持,為食品過敏原標(biāo)簽的規(guī)范化提供參考。