劉金輝，方亞妮，劉 孜，李 翡

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西咸陽 712046；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科，西安 710061；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)婦科教研室，陜西咸陽 712046)

宮頸癌是全球范圍常見的女性惡性腫瘤之一，按照病理類型主要分為鱗狀細(xì)胞癌和腺細(xì)胞癌兩種，前者占80%以上[1-2]。臨床通常將ⅠB2～ⅣA期的宮頸癌統(tǒng)稱為局部晚期宮頸癌(locally advanced cervical cancer,LACC)。目前，順鉑聯(lián)合放療的同步放化療(concurrent chemo-radiotherapy，CCRT)是LACC患者的主要治療手段[3]。雖然CCRT明顯改善了患者的總體生存情況，并降低了腫瘤復(fù)發(fā)率[4]，但仍有部分患者無法從治療中受益，急需進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制[5]。

類RAS基因激活物2(ras protein activator like 2,RASAL2)基因編碼的產(chǎn)物為一種RAS-GTPase激活蛋白，催化RAS-GTP水解為RAS-GDP，進(jìn)而抑制Ras基因活性[6]。研究顯示，RASAL2基因在Luminal B型乳腺癌發(fā)揮抑癌基因作用[7-8]，但在部分三陰性乳腺癌中則是扮演著致癌基因的角色[9]。此外，RASAL2基因啟動(dòng)子區(qū)在肝細(xì)胞癌組織中普遍呈超低甲基化狀態(tài)，而下調(diào)該基因可明顯抑制肝癌細(xì)胞生長和侵襲[10]。這些有爭議的結(jié)果表明，RASAL2基因在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著不同的角色[11]。RAS基因突變存在于多種類型惡性腫瘤中，但在宮頸鱗癌中發(fā)生率很低[12]。然而也有研究證實(shí)，K-RAS及H-RAS基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織，且參與了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[13]，表明RAS基因在宮頸鱗癌中可能依賴其他機(jī)制激活，而并非依賴于獲得性突變。因此，探索RASAL2基因在宮頸鱗癌中的狀態(tài)，有助于進(jìn)一步闡明宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并為其臨床治療提供潛在的靶點(diǎn)。

本文研究了RASAL2基因在宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的甲基化和表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在宮頸鱗癌組織中，RASAL2基因呈現(xiàn)為異常高甲基化和表達(dá)下調(diào)狀態(tài)，同時(shí)，RASAL2基因甲基化狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞分化程度及患者對(duì)CCRT的應(yīng)答呈相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年9月至2019年9月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受CCRT治療的60例宮頸鱗癌患者標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)組織病理學(xué)確診為宮頸鱗癌；(2)保存有足夠的活檢組織標(biāo)本；(3)隨訪時(shí)間≥1年。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)活檢取標(biāo)本前已接受化療、放療等治療；(2)同時(shí)患有≥2種惡性腫瘤。收集同期就診的10例卵巢癌患者的正常宮頸組織，經(jīng)組織病理學(xué)檢測確定未發(fā)生病變。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，患者均簽署知情通知書。

1.2 方法

1.2.1分組

60例宮頸鱗癌患者均接受CCRT，其中放療包括外放射治療(external beam radiation therapy,EBRT)和隨后進(jìn)行的近距離局部高劑量腔內(nèi)放射治療(high-dose rate intracavitary brachytherapy,HDR-ICBT)。EBRT實(shí)施于整個(gè)盆腔，總照射劑量為50 Gy，每周進(jìn)行5次，每次2 Gy，共25～28次。HDR-ICBT照射劑量在25 Gy左右，每周進(jìn)行2次，共4～5次。進(jìn)行EBRT的患者同時(shí)接受順鉑治療，劑量為25 mg/m2，靜脈滴注給藥，每周1次，化療5個(gè)周期。患者治療前后均進(jìn)行婦科檢查，B超或CT檢測，治療周期結(jié)束后根據(jù)實(shí)體瘤治療應(yīng)答評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors,RECIST)[14]評(píng)估臨床應(yīng)答情況，分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)，其中CR患者歸為敏感組，PR、SD和PD患者歸為耐受組。

1.2.2主要試劑

DNA提取試劑盒QIAmp DNA mini試劑盒和重亞硫酸鹽處理試劑盒EpiTect Bisulfite Kit 購自美國Qiagen公司，甲基化和表達(dá)引物購自上海生工生物工程有限公司，ResoLight染料購自瑞士Roche公司，HiTaq HS聚合酶購自深圳菲鵬生物科技有限公司，組織蛋白質(zhì)裂解液(C500028)購自上海生工生物工程有限公司，兔抗人RASAL2抗體(ab121578)購自英國Abcam公司。

1.2.3DNA提取和重亞硫酸鹽處理

采用QIAmp DNA mini試劑盒提取和純化DNA，實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行，標(biāo)本統(tǒng)一洗脫體積為40 μL。DNA經(jīng)NanoDrop2000定量后，Tris-乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL。進(jìn)行甲基化特異性定量檢測(quantitative methylation-specific PCR，qMSP)反應(yīng)前對(duì)基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。重亞硫酸鹽可使未發(fā)生甲基化的C脫氨形成U，而對(duì)發(fā)生甲基化的C不起作用。因此，針對(duì)CpG設(shè)計(jì)的甲基化特異性引物，相應(yīng)的堿基序列仍為C。本研究采用EpiTect Bisulfite 試劑盒對(duì)待測標(biāo)本DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，各標(biāo)本的DNA轉(zhuǎn)化起始量均為1 μg。

1.2.4qMSP

qMSP通過在基礎(chǔ)PCR反應(yīng)體系中加入雙鏈核酸染料實(shí)現(xiàn)。采用相對(duì)定量方式分析RASAL2基因甲基化程度，選取膠原Ⅱα1(collagen type Ⅱ Alpha 1，COL2A1)作為內(nèi)參基因，其擴(kuò)增引物針對(duì)該基因非CpG位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)。qMSP過程采用25 μL反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)體系中加入0.25 μL ResoLight染料，0.5 U HiTaq HS聚合酶，引物250 nmol/L及20 ng重亞硫酸氫鹽處理過的DNA。所有qMSP反應(yīng)均在ABI ViiATM7實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)上進(jìn)行。反應(yīng)程序：95 ℃變性10 min；隨后運(yùn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增程序；95 ℃變性15 s，Tm退火20 s，72 ℃延伸20 s。反應(yīng)完成后，根據(jù)ViiATM7軟件給出的Ct值對(duì)RASAL2基因進(jìn)行甲基化相對(duì)定量分析。使用2—ΔΔCt計(jì)算RASAL2基因相對(duì)甲基化率，其中ΔCt指同一標(biāo)本RASAL2基因Ct與內(nèi)參基因Ct的差值。如果樣品內(nèi)部控制反應(yīng)失敗，則棄用該標(biāo)本數(shù)據(jù)。

1.2.5蛋白提取和定量

提取標(biāo)本總蛋白，使用NanoDrop2000進(jìn)行定量。蛋白標(biāo)本上樣量為50 μg，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進(jìn)行電泳；轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入RASAL2一抗(1∶500)和GAPDH(1∶2 000)一抗于4 ℃孵育過夜，洗膜后使用二抗(1∶3 000)于室溫孵育4 h?；赟yngene化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照并依據(jù)Image J進(jìn)行灰度分析，進(jìn)行RASAL2蛋白定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 患者臨床信息

60例患者均可評(píng)價(jià)療效，其中敏感組(CR)32例、耐受組(PR 21例、PD 7例)28例，兩組年齡、腫瘤大小、病理類型、國際婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)(Federation International of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期(2009年標(biāo)準(zhǔn))等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較[n(%)]

2.2 宮頸癌組織及正常宮頸組織RASAL2基因甲基化狀態(tài)

qMSP結(jié)果顯示，宮頸癌組織RASAL2基因甲基化水平較正常組織明顯升高(0.317±0.029vs. 0.174±0.078，P=0.020)，耐受組高于敏感組(0.400±0.040vs. 0.244±0.036，P=0.003)，見圖1。

A：宮頸癌組織和正常宮頸組織比較；B：敏感組、耐受組和正常宮頸組織比較；a：P<0.05。圖1 宮頸癌組織及正常宮頸組織RASAL2基因甲基化狀態(tài)

2.3 宮頸癌組織和正常宮頸組織RASAL2基因的表達(dá)水平

敏感組(0.184±0.014)和耐受組(0.131±0.010)RASAL2基因表達(dá)水平均低于正常組(0.307±0.048)，且耐受組低于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。相關(guān)性分析顯示，宮頸癌組織RASAL2基因表達(dá)水平與RASAL2甲基化程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.665，P<0.001)，見圖2。

A：敏感組、耐受組和正常宮頸組織RASAL2基因表達(dá)情況比較；B：宮頸癌組織RASAL2基因表達(dá)水平與RASAL2甲基化程度相關(guān)性；a：P<0.05。圖2 宮頸癌和正常組織RASAL2基因表達(dá)情況

2.4 RASAL2基因甲基化與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

中高分化腫瘤組織RASAL2基因甲基化水平低于低分化腫瘤組織RASAL2基因甲基化水平(0.023±0.003vs. 0.045±0.005)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

aP<0.001。圖3 RASAL2基因高甲基化與晚期宮頸癌細(xì)胞分化程度相關(guān)

2.5 RASAL2基因甲基化與宮頸癌患者CCRT敏感性的關(guān)聯(lián)分析

單因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，RASAL2基因甲基化水平可作為預(yù)測宮頸癌患者CCRT敏感性的因子(P<0.05)，RASAL2基因高甲基化患者的臨床應(yīng)答率明顯低于該基因低甲基化患者，見表2。

表2 單因素logistics回歸分析結(jié)果

3 討 論

啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是基因沉默的重要機(jī)制，是宮頸癌中常見的分子事件[15]，但目前甲基化分子標(biāo)志物與宮頸癌患者臨床應(yīng)答的相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。YE等[16]進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明，TP73蛋白水平與宮頸癌患者的放療敏感性呈現(xiàn)出相關(guān)性，表現(xiàn)為TP73基因表達(dá)水平高的患者對(duì)放療更為敏感。該項(xiàng)研究進(jìn)一步證實(shí)，TP73基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與該蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且去甲基化試劑處理可使宮頸癌細(xì)胞系TP73基因表達(dá)明顯上調(diào)，表明高甲基化是引起該基因沉默的原因。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ANCF基因啟動(dòng)子高甲基化在宮頸癌細(xì)胞中十分普遍，且高甲基化使得細(xì)胞對(duì)多種可造成DNA損傷的藥物異常敏感[17]。而最近的一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)ANCF基因去甲基化會(huì)引起卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的不敏感[18]。由此可推測，F(xiàn)ANCF基因啟動(dòng)子高甲基化可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，但仍需進(jìn)一步證實(shí)。此外，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路DAPK及FAS基因甲基化水平被證實(shí)與宮頸癌患者接受CCRT的敏感性明顯相關(guān)[19]。本研究分析了60例宮頸鱗癌患者的RASAL2基因甲基化和表達(dá)情況，以及這些變化與患者臨床病理特征、臨床應(yīng)答的關(guān)聯(lián)性，證實(shí)RASAL2基因甲基化可作為預(yù)測患者CCRT敏感性的標(biāo)志物。

RASAL2基因啟動(dòng)子甲基化和表達(dá)缺失在Luminal B型乳腺癌普遍存在，而正常功能的RASAL2基因可有效抑制該類腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[7-8]。然而，在肝細(xì)胞癌組織中，RASAL2基因啟動(dòng)子卻呈現(xiàn)為低甲基化狀態(tài)，且RASAL2基因缺失可有效抑制癌細(xì)胞的生長和侵襲能力[10]。基于qMSP實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)腫瘤標(biāo)本中RASAL2基因甲基化水平較正常宮頸組織明顯上調(diào)，且甲基化程度在低分化腫瘤細(xì)胞中最高。此外，在腫瘤標(biāo)本中檢測到RASAL2基因表達(dá)的缺失，且與甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果證實(shí)，RASAL2基因轉(zhuǎn)錄沉默與異常啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，且后者參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。另外，在部分正常組織中也檢測到了RASAL2基因甲基化的存在，雖然不能排除一些組織標(biāo)本被鄰近的腫瘤細(xì)胞污染的可能性，但既往的研究表明，導(dǎo)致這種情況產(chǎn)生的原因很可能是“正常組織”實(shí)際已產(chǎn)生了癌前病變[20]。而深入解決這個(gè)問題，需要更大樣本量開展研究。

值得注意的是，耐受組RASAL2基因甲基化水平明顯高于敏感組，且RASAL2基因高甲基化可作為獨(dú)立預(yù)測患者不良應(yīng)答的因子。結(jié)合其他研究成果，有理由認(rèn)為RASAL2基因在宮頸鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮著抑制RAS基因活性的生物學(xué)功能。低甲基化時(shí)，正常表達(dá)的RASAL2基因可有效抑制宮頸癌細(xì)胞的RAS基因活性，進(jìn)而一定程度上抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和克隆形成能力；相應(yīng)地，高甲基化誘導(dǎo)的RASAL2基因表達(dá)缺失會(huì)失去對(duì)Ras基因的抑制作用，給腫瘤細(xì)胞的生長和增殖提供環(huán)境，進(jìn)而為放化療后殘存的腫瘤細(xì)胞帶來生存和種群再生的優(yōu)勢，臨床表現(xiàn)為患者對(duì)CCRT不敏感。RASAL2基因影響宮頸癌患者CCRT敏感性的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，RASAL2基因異常甲基化和低表達(dá)在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。與遺傳改變不同，表觀遺傳改變是可逆的，這使得它成為一個(gè)有吸引力的治療目標(biāo)，后續(xù)研究需要闡明RASAL2基因去甲基化在宮頸癌臨床治療中的可行性。