阿曼古麗·如則， 王雪梅， 尼魯帕爾·謝甫開(kāi)提， 趙 翎， 趙幫豪， 霍 強(qiáng)， 高曉明

(1省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 2新疆醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830054；3西安醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生學(xué)教研室， 西安 710021； 4新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心， 烏魯木齊 830054)

心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病，我國(guó)心血管疾病導(dǎo)致的死亡居城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是冠心病、心力衰竭、房顫等心血管疾病的病理基礎(chǔ)[2]，其早期標(biāo)志性的病理特征是血管內(nèi)皮下大量巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積及泡沫細(xì)胞的形成[3-4]。探討巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬的分子機(jī)制，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的早期治療具有重要的意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, LncRNA) 是無(wú)明顯的蛋白質(zhì)編碼功能的非編碼RNA[5]。H19基因位于人類11號(hào)染色體上，在RNA聚合酶II的催化作用下可轉(zhuǎn)錄生成LncRNA H19[6]。LncRNA H19在多種腫瘤疾病[7-11]及代謝性疾病[12-15]發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近期研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化患者中，LncRNA H19表達(dá)升高，且血漿LncRNA H19水平升高與冠狀動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[16-18]，提示LncRNA H19可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，但其分子機(jī)制尚不明確。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體 α(PPAR-α)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在脂質(zhì)和葡萄糖代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[19-20]。研究證實(shí)，LncRNA H19的抑制通過(guò)miR-675/PPAR-α軸的調(diào)節(jié)來(lái)減輕缺血再灌注對(duì)心肌造成的損傷[21]，但LncRNA H19是否通過(guò)抑制PPAR-α活性介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化中的脂質(zhì)蓄積尚不清楚。本研究在細(xì)胞水平，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)探討LncRNA H19在THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬中的作用以及與脂代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PPAR-α之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料人外周血單核細(xì)胞系(THP-1)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、PBS購(gòu)自Gibco公司，siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，Lipo-fectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol總RNA抽提試劑購(gòu)自Invitrogen公司，佛波酯(PMA)，油紅O染料購(gòu)自Sigma-Aldrich?公司，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)購(gòu)自廣州奕元生物技術(shù)有限公司，高效RIPA裂解液購(gòu)自索萊寶公司，F(xiàn)astKing一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司、SYBR Green熒光定量試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，PPAR-α抗體、β-actin 抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及泡沫細(xì)胞模型的建立 將THP-1細(xì)胞置于含15%胎牛血清以及1%青-鏈霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。1～2天換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板上。用200 nmol/L的PMA處理THP-1細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞。使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑，分別將H19小干擾RNA(siRNA)(5′-CCCGUCCCUUCUGAAUUUATT UAAAUUCAGAAGGGACGGGTT-3′)和陰性對(duì)照組siRNA(5′-ACAGAACAUAACGACGAACTTGU-UCGUCGUUA UGUUCUGUTT-3′)轉(zhuǎn)染至THP-1源性巨噬細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后換培養(yǎng)基，用含50 μg/mL ox-LDL的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，使其吞噬脂質(zhì)形成巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞。

1.2.2 油紅O染色及脂質(zhì)含量測(cè)定 ox-LDL刺激48 h后，吸去上清液。PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min(37℃)。去除固定液，用蒸餾水清洗3遍，油紅O染色液染色15 min(37℃)；蒸餾水洗3遍，顯微鏡下觀察并拍照。此后，去除蒸餾水加入異丙醇，37℃孵育箱中放置5 min，抽提油紅O。吸取每孔中的液體加入至96孔板中，酶標(biāo)儀測(cè)定560 nm波長(zhǎng)的OD值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度，并取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。H19引物：上游序列5′-CTTTCATGTTGTGGGTTCTGG-3′，下游序列5′-CGGGTCTGTTTCTTTACTTCC-3′，內(nèi)參18S引物：上游序列5′CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，下游序列5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3′。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，循環(huán)40次。樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以18S為內(nèi)參，用2-ΔΔCT的方法來(lái)計(jì)算LncRNA H19的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot檢測(cè) 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行定量，100℃加熱使蛋白變性。取20 μg蛋白提取液，室溫下行SDS-PAGE電泳。用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉。加入相應(yīng)的一抗(均1∶1 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜。0.1%TBST洗膜3次，每次5 min。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)，室溫避光孵育2 h，洗膜后顯色。用Image Lab圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western印跡圖片進(jìn)行定量分析，以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白GAPDH條帶的灰度比值表示。

2 結(jié)果

2.1 THP-1來(lái)源泡沫細(xì)胞中LncRNA H19表達(dá)升高正常的THP-1為懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，形態(tài)呈圓形，折光度良好，無(wú)顆粒。經(jīng)200 nmol/L的PMA處理24 h后，由懸浮式生長(zhǎng)變成貼壁生長(zhǎng)，由圓形變成不規(guī)則形態(tài)，體積進(jìn)一步增大，代表細(xì)胞已分化為巨噬細(xì)胞(圖1)。經(jīng)50 μg/mL 的ox-LDL處理48 h后，油紅O染色，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的紅色脂滴顆粒(圖2B)，符合泡沫細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，表明泡沫細(xì)胞模型建立成功。

與對(duì)照組相比，ox-LDL處理組脂滴含量明顯增加(圖2A，B)，異丙醇抽提定量結(jié)果顯示，脂質(zhì)含量增加1.25倍(圖2C，P<0.01)。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ox-LDL處理后泡沫細(xì)胞中的LncRNA H19 mRNA表達(dá)量比對(duì)照組升高1倍(圖2D，P<0.01)。

2.2 LncRNA H19的基因沉默減輕THP-1來(lái)源泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬為了進(jìn)一步明確LncRNA H19在THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬中的作用，分別用陰性對(duì)照H19 scramble和H19 siRNA轉(zhuǎn)染THP-1源巨噬細(xì)胞48 h，qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，H19 siRNA組LncRNA H19基因表達(dá)比陰性對(duì)照組降低了83%(P<0.01，圖3A)。油紅O染色及異丙醇定量結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，H19 siRNA組脂質(zhì)含量減少了28%(P<0.01，圖3B，C)，說(shuō)明LncRNA H19在THP-1源巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬中發(fā)揮重要作用。

2.3LncRNAH19的基因沉默抑制PPAR-α的表達(dá) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ox-LDL刺激后，THP-1源巨噬細(xì)胞中的PPAR-α蛋白表達(dá)水平相比對(duì)照組降低了36%，LncRNA H19敲低后，PPAR-α蛋白表達(dá)水平恢復(fù)到對(duì)照組水平(P<0.01，圖4A，B)。提示LncRNA H19可能通過(guò)抑制PPAR-α的表達(dá)來(lái)增加THP-1源巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬。

圖1 THP-1來(lái)源泡沫細(xì)胞的建立，放大倍數(shù)(×50)

圖2 THP-1來(lái)源泡沫細(xì)胞模型中的脂質(zhì)含量及LncRNAH19的基因表達(dá)變化(×200)

圖3 H19 siRNA轉(zhuǎn)染后THP-1源巨噬細(xì)胞中LncRNA H19基因表達(dá)及脂質(zhì)含量的測(cè)定，放大倍數(shù)(×200)

圖4 不同處理后THP-1源巨噬細(xì)胞中PPAR-α蛋白表達(dá)測(cè)定

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期，血管內(nèi)皮損傷分泌趨化因子和黏附分子，促使外周血中的單核細(xì)胞遷移進(jìn)入內(nèi)膜下，活化成為巨噬細(xì)胞。隨后，在炎癥介質(zhì)的作用下巨噬細(xì)胞表面清道夫受體(Scavenger receptor，SR)的表達(dá)增加，使巨噬細(xì)胞大量吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的形成是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵起始步驟[3]。因此建立穩(wěn)定的體外泡沫細(xì)胞模型，對(duì)研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要[22]。本研究用ox-LDL處理THP-1源巨噬細(xì)胞的方法建立體外泡沫細(xì)胞模型，并用油紅O染色及異丙醇定量來(lái)鑒定模型。結(jié)果顯示，ox-LDL處理后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的紅色脂滴顆粒，脂質(zhì)含量明顯增加，表明泡沫細(xì)胞模型建立成功。

LncRNA參與機(jī)體多種生物學(xué)及病理生理過(guò)程，與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治都有著密切聯(lián)系[23]。研究表明，共354個(gè)差異表達(dá)LncRNA與ApoE-/-小鼠高脂飲食的病理變化密切相關(guān)[24]，可能在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥和代謝過(guò)程中發(fā)揮作用，提示LncRNA是參與動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的重要因素，但其在動(dòng)脈粥樣硬化中的功能和機(jī)制尚不清楚。近期研究報(bào)道，LncRNA H19在冠心病等多種動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中發(fā)揮重要作用[12, 16, 25]，但其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮的具體作用及相關(guān)的分子機(jī)制仍未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，THP-1源泡沫細(xì)胞模型中LncRNA H19表達(dá)明顯增加。用小干擾RNA敲低LncRNA H19表達(dá)后，THP-1源泡沫細(xì)胞模型中脂質(zhì)含量明顯降低，說(shuō)明LncRNA H19在THP-1源巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬中發(fā)揮重要作用。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體包含的三個(gè)亞型(PPAR-α、PPAR-β/δ和PPAR-γ)是核受體超家族的成員，作為配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，在葡萄糖和脂質(zhì)代謝中起著至關(guān)重要的作用[20]。PPAR-α為脂質(zhì)代謝的主要調(diào)節(jié)因子，調(diào)控多個(gè)脂代謝相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些基因包括脂肪酸活化相關(guān)激酶?；o酶A氧化酶、硫酶，長(zhǎng)鏈脂肪酸運(yùn)輸相關(guān)蛋白脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP)，脂肪酸氧化過(guò)程的限速酶肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I(CPT1)和糖脂代謝關(guān)鍵酶過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ-輔激活物1-α(PGC-1α)等[19]，因此PPAR-α可能作為肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等多種類型脂質(zhì)代謝綜合征的有效治療靶點(diǎn)[26]。為了進(jìn)一步探索LncRNA H19促進(jìn)THP-1源巨噬細(xì)胞脂質(zhì)吞噬的調(diào)控機(jī)制，本研究在不同處理組中檢測(cè)了PPAR-α的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，THP-1源泡沫細(xì)胞模型中，PPAR-α表達(dá)水平降低，而在LncRNA H19基因沉默后，PPAR-α表達(dá)顯著回升，脂質(zhì)含量顯著減少。這些結(jié)果表明在高脂條件下LncRNA H19可能通過(guò)抑制PPAR-α的表達(dá)來(lái)促進(jìn)THP-1源巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬。