邱 菁，徐純藝，周瑋玲，趙淋仙，李燕燕，胡慧玲

基于“藥輔合一”理念的當(dāng)歸精油納米乳遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建、表征及評(píng)價(jià)

邱 菁，徐純藝，周瑋玲，趙淋仙，李燕燕，胡慧玲*

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137

構(gòu)建當(dāng)歸精油納米乳（essential oil-loaded nanoemulsion，AEO-NE）遞藥系統(tǒng)并對(duì)其進(jìn)行表征及穩(wěn)定性、毛囊靶向、毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)作用評(píng)價(jià)。分別應(yīng)用偽三元相圖法和星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（central composite experiment design-response surface method，CCD-RSM）對(duì)納米乳處方進(jìn)行篩選和優(yōu)化。對(duì)納米乳乳劑類型、粒徑、ζ電位、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）、微觀形態(tài)、黏度、pH值進(jìn)行表征。以粒徑、PDI、外觀變化及-藁本內(nèi)酯含量為指標(biāo)，評(píng)價(jià)最優(yōu)處方納米乳離心穩(wěn)定性、放置穩(wěn)定性以及稀釋穩(wěn)定性。通過在體給藥熒光標(biāo)記的AEO-NE于小鼠背部皮膚研究制劑毛囊靶向能力。應(yīng)用C57BL/6小鼠研究AEO-NE體內(nèi)促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用。AEO-NE最優(yōu)處方為AEO-辛基酚聚氧乙烯醚10（OP-10）-無水乙醇-水（2.25∶0.75∶1∶96）；按最優(yōu)處方所制AEO-NE外觀澄清、透明、微泛藍(lán)光，乳劑類型為O/W型，平均粒徑為（15.95±0.33）nm，PDI為0.11±0.02，ζ電位為（?0.14±0.10）mV，pH值為5.89±0.16，黏度為（1.57±0.08）mPa·s，透射電鏡結(jié)果表明AEO-NE乳滴呈球形，外觀圓整，大小在20 nm內(nèi)。AEO-NE離心穩(wěn)定性、稀釋穩(wěn)定性良好，在4 ℃條件下密封避光放置穩(wěn)定性良好，粒徑及-藁本內(nèi)酯含量無顯著變化。AEO-NE局部皮膚給藥24 h內(nèi)均表現(xiàn)出毛囊靶向性，具有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用?；凇八庉o合一”理念，成功構(gòu)建了以AEO為唯一油相的AEO-NE，其宏觀及微觀形態(tài)、相關(guān)理化性質(zhì)符合納米乳制劑要求，穩(wěn)定性良好，在靶向促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)方面具有一定潛力。

當(dāng)歸精油；納米乳；偽三元相圖；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；表征；穩(wěn)定性評(píng)價(jià)；毛囊靶向；促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便的功效，兼具極高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值[1]。當(dāng)歸精油（essential oil，AEO）是當(dāng)歸中主要活性部位之一，含量約為1%。研究表明AEO具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抑菌等[2-5]。除此之外，當(dāng)歸作為“血中圣藥”，對(duì)因氣血不足和失于調(diào)達(dá)造成的斑禿、脂溢性脫發(fā)等具有良好的治療效果。臨床研究發(fā)現(xiàn)，以95%乙醇配制的含生藥質(zhì)量濃度為0.25 g/mL的AEO溶液臨床治療脫發(fā)有效率達(dá)76.2%[6]。

無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員（wingless-type MMTV integration site family，Wnt）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、外胚葉發(fā)育不全蛋白基因（ectodysplasin-A，Eda）、Notch和Shh（Sonic hedgehog）通路與毛囊的分化及其形態(tài)產(chǎn)生密切相關(guān)，而核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的水平對(duì)于以上信號(hào)通路的調(diào)控至關(guān)重要[7]。Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AEO的主要成分-藁本內(nèi)酯具有抑制NF-κB信號(hào)通路的作用。對(duì)接斑禿主要原因——免疫炎性浸潤(rùn)，AEO具有顯著的抗炎作用，能夠顯著下調(diào)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β等促炎因子水平[9-10]。綜上，AEO在改善脫發(fā)、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)方面具有一定潛力。然而，AEO親脂性強(qiáng)，其主要成分具有遇光、熱不穩(wěn)定，水溶性差的缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

與普通乳液不同，納米乳（nanoemulsion，NE）乳滴平均直徑通常小于100 nm，因而其外觀一般呈透明或半透明狀[11-12]。NE具有增加難溶性藥物溶解度[13]、提高穩(wěn)定性[14]及生物利用度[15]的作用，是揮發(fā)油類藥物的優(yōu)良載體。此外，NE具有較強(qiáng)的皮膚遞送能力[16]，且其黏度小，皮膚順應(yīng)性良好[17]。AEO作為改善脫發(fā)癥狀的潛力藥效物質(zhì)，不但自身具有良好的皮膚滲透性，還對(duì)多種生物活性成分具有一定的促滲透作用[18]，具備“藥輔合一”的應(yīng)用特色。

基于提高AEO穩(wěn)定性、增強(qiáng)患者順應(yīng)性并充分體現(xiàn)“藥輔合一”的原則，本研究擬將AEO作為油相制成經(jīng)皮給藥的納米乳制劑，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征，并評(píng)價(jià)制劑穩(wěn)定性及其毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)作用，以為斑禿、脂溢性脫發(fā)等皮膚疾病相關(guān)制劑的研發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

辛基酚聚氧乙烯醚10（OP-10）、氫化蓖麻油聚氧乙烯醚（C0-40）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH 40）、1,3-丁二醇、Labrasol、聚乙二醇-400（PEG-400），山東優(yōu)索化工科技有限公司；聚山梨酯-80（Tween-80，T80）、無水乙醇、甘油，成都市科隆化學(xué)品有限公司；蘇丹III染色液、1%亞甲基藍(lán)染色液，北京索萊寶科技有限公司；無水硫酸鈉，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)照品-藁本內(nèi)酯，批號(hào)MUST-22022602，10 mg/mL，2 mL/支，成都曼斯特生物科技有限公司；尼羅紅，上海麥克林生化科技有限公司；達(dá)霏欣（2%米諾地爾），陜西振東安欣生物制藥有限公司，批號(hào)20220503。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2A型數(shù)顯恒溫測(cè)速磁力攪拌器，常州越新儀器制造有限公司；QUINTIX35-1CN型十萬分之一電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；pHs-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LitesizerTM500型納米粒度電位儀，上海安東帕商貿(mào)有限公司；JEM 2100F型透射電子顯微鏡（TEM），日本捷歐路科貿(mào)有限公司；DM6B型顯微鏡、SOPI-SW0033型冷凍切片機(jī)，德國(guó)徠卡儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，含DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡健康雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（川）2020-030。所有小鼠實(shí)驗(yàn)期間全程飼養(yǎng)于（25±1）℃和50%～60%濕度下，每12小時(shí)進(jìn)行光照/黑暗交替，并允許自由獲取水和食物，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 AEO的制備

取當(dāng)歸藥材粉末適量，精密稱定，參照《中國(guó)藥典》2020年版揮發(fā)油測(cè)定法甲法采用水蒸氣蒸餾法提取AEO，收集并用無水硫酸鈉處理后，于4 ℃避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩２捎肎C-MS分析AEO的化學(xué)成分，其中以-藁本內(nèi)酯含量最高，占比約80%。

2.2 當(dāng)歸精油納米乳（AEO-NE）的制備

精密稱取處方量的OP-10和無水乙醇，磁力攪拌混勻后加入AEO，磁力攪拌使其充分混勻，再逐滴加入去離子水，于室溫、800 r/min條件下磁力攪拌30 min，即得AEO-NE。

2.3 Z-藁本內(nèi)酯HPLC含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Desc: Uranus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（55∶45）；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；柱溫35 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

2.3.2-藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液的配制 精密量取-藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液（10 mg/mL）100 μL置于10 mL棕色量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的-藁本內(nèi)酯對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.3 AEO-NE供試品溶液的制備 精密吸取200 μL AEO-NE于10 mL棕色量瓶中，先加5 mL甲醇超聲5 min破乳后，靜置，再用甲醇定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為AEO-NE供試品溶液。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取空白納米乳（blank NE，B-NE）溶液，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備，即得陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 專屬性考察 分別將-藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液、AEO-NE供試品溶液、陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣高效液相色譜儀，記錄各色譜圖，結(jié)果見圖1，-藁本內(nèi)酯在供試品溶液和對(duì)照品溶液中的出峰位置一致，結(jié)果表明AEO-NE中其他成分對(duì)-藁本內(nèi)酯含量測(cè)定無影響。

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密配制質(zhì)量濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 μg/mL的-藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，以-藁本內(nèi)酯對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），得回歸方程為＝9.704 7＋2.158 2，2＝0.999 6，結(jié)果表明-藁本內(nèi)酯在1.00～100.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

圖1 B-NE (A)、Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品(B) 和AEO-NE樣品(C)的HPLC圖

2.3.7 精密度考察 取同一AEO-NE供試品溶液，用0.22 μm微孔濾膜濾過后，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積并計(jì)算其RSD值，結(jié)果表明RSD值為0.12%，儀器精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批AEO-NE 6份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積并計(jì)算-藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度的RSD值，結(jié)果表明其RSD為1.95%，方法重復(fù)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新鮮制備的AEO-NE，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在制備后的0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，并計(jì)算峰面積RSD值。結(jié)果表明，RSD值為0.69%，AEO-NE供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密吸取5、10、20 μg/mL的-藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液1 mL于一定體積B-NE樣品中，每個(gè)濃度平行3份，渦旋混勻后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積并計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果表明加樣回收率分別為（98.66±0.33）%、（96.79±0.24）%、（104.78±0.28）%，RSD值為0.33%、0.25%、0.27%，該方法準(zhǔn)確性良好。

2.4 納米乳遞藥系統(tǒng)構(gòu)建

2.4.1 處方篩選 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，以AEO為納米乳遞藥系統(tǒng)的唯一油相，可以制得澄清、透明、微泛藍(lán)光納米乳。因此，基于精簡(jiǎn)處方、提高載藥量和“藥輔合一”理念，以目標(biāo)藥物AEO作為納米乳遞藥系統(tǒng)的油相。基于水包油型（O/W）納米乳的制備目的，根據(jù)親水親油平衡值（hydrophilic and lipophilic balance value，HLB）初步確定待篩選乳化劑為T80（HLB值∶15）、OP-10（HLB值∶13.6）、RH-40（HLB值∶14～16）、CO-40（HLB值∶14～16），待篩選助乳化劑為常用的甘油、PEG-400、Labrasol、1,3-丁二醇、無水乙醇。

采用水滴定法結(jié)合偽三元相圖法，確定納米乳遞藥系統(tǒng)中乳化劑和助乳化劑的種類以及乳化劑與助乳化劑的質(zhì)量比（m）。偽三元相圖的繪制：將乳化劑與助乳化劑按質(zhì)量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2混勻，再將混合表面活性劑（Smix）與AEO以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4的質(zhì)量比混合均勻，在800 r/min、（25±1）℃條件下逐滴加入去離子水，記錄臨界加水量，應(yīng)用Origin 2019繪制偽三元相圖并觀察成乳區(qū)域面積。以偽三元相圖納米乳區(qū)域面積大小為指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合混合乳化劑的乳化能力（與油相在一定質(zhì)量比條件下形成納米乳的能力）確定納米乳的處方組成。結(jié)果表明，以T80為乳化劑無法形成納米乳，如圖2～4所示，確定乳化劑為OP-10，助乳化劑為無水乙醇，m為2∶1。

2.4.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以m（1）、油相與油相及混合表面活性劑得質(zhì)量比［油/(油＋Smix)，2］為影響因素，以粒徑（1）、PDI（2）、揮發(fā)油含量（3）的總評(píng)歸一值（overall desirability，OD）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，應(yīng)用Design Expert8.0.6軟件采用2因素5水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素、水平、實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表1。

圖2 乳化劑篩選的偽三元相圖

圖3 助乳化劑篩選的偽三元相圖

圖4 Km篩選的偽三元相圖

表1 CCD-RSM因素、水平及結(jié)果

OD＝(12…d)1/n

對(duì)于取值越小越好的因素：d＝(max－y)/(max－min)

對(duì)于取值越大越好的因素：d＝(y－min)/(max－min)

2.4.3 模型擬合 通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)OD值進(jìn)行二次非線性擬合，＝26.63，＝0.000 5＜0.05，方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬項(xiàng)＝1.27，＝0.397＞0.05，并擬合得回歸方程OD＝0.319 43－0.127 631＋3.226 152＋0.885 3412－11.114 1322。方差分析結(jié)果表明，回歸模型＝0.000 2＜0.001，2為0.916 6，失擬項(xiàng)水平不顯著（＝ 0.397＞0.05），說明模型擬合良好，預(yù)測(cè)性好。根據(jù)所擬合的方程，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件繪制三維效應(yīng)面圖，見圖5。

2.4.4 最優(yōu)處方預(yù)測(cè) 根據(jù)平均粒徑和PDI越小越好，OD值越大越好的標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合效應(yīng)面圖，預(yù)測(cè)出最優(yōu)處方m＝3∶1，揮發(fā)油與混合表面活性劑的質(zhì)量比為0.26，OD值為0.715。最優(yōu)處方為1% AEO、2.25% OP-10、0.75%無水乙醇、96%水。

圖5 X1及X2對(duì)OD值影響的三維效應(yīng)面圖(A)及二維等高線圖(B)

2.4.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照最佳處方，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備3批AEO-NE，測(cè)定粒徑、PDI并計(jì)算AEO含量，結(jié)果見表2。照優(yōu)化處方制備的AEO-NE粒徑較小且分布均一性良好，偏差較小，表明該方程預(yù)測(cè)性良好，重復(fù)性良好。

表2 最優(yōu)處方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(, n = 3)

2.5 納米乳表征

2.5.1 乳劑類型鑒別 采用染色法和稀釋法對(duì)AEO-NE乳劑類型進(jìn)行鑒別。取等量AEO-NE裝于2個(gè)磨口玻璃瓶中，分別加入等量水溶性染料亞甲基藍(lán)和油溶性染料蘇丹紅III，觀察比較二者在AEO-NE中的擴(kuò)散速度。結(jié)果表明，水溶性染料亞甲基藍(lán)在AEO-NE中的擴(kuò)散速度快于油溶性染料蘇丹紅III。取適量AEO-NE，向其中加入一定量水，結(jié)果表明AEO-NE能被水稀釋而不發(fā)生外觀性狀的變化。綜上，AEO-NE為O/W型納米乳。

2.5.2 粒徑、ζ電位及多分散系數(shù) 按優(yōu)化后處方制備AEO-NE 3批，于25 ℃條件下采用納米粒度儀測(cè)定粒徑、ζ電位及多分散系數(shù)。結(jié)果如圖6所示，AEO-NE平均粒徑大小為（15.95±0.33）nm，PDI為0.11±0.02，ζ電位為（?0.14±0.10）mV。

圖6 AEO-NE的粒徑分布

2.5.3 宏觀和微觀形態(tài) 最優(yōu)處方AEO-NE外觀澄清、透明、微泛藍(lán)光，符合納米乳的制劑特征（圖7-c、d）。采用TEM對(duì)AEO-NE的微觀形態(tài)進(jìn)行表征，取少量AEO-NE滴于銅網(wǎng)的支持膜上，自然晾干，再用2%磷鎢酸負(fù)染10 min，用濾紙吸去多余的染液，經(jīng)自然晾干后，將銅網(wǎng)置于TEM下觀察制劑微觀形態(tài)并拍照。結(jié)果如圖7-a、b所示，AEO-NE乳滴之間無黏連，呈球形，外觀圓整，粒徑在20 nm內(nèi)。

2.5.4 pH值及黏度 人體正常皮膚表面pH值為5左右，呈弱酸性，皮膚給藥制劑直接作用于皮膚，影響皮膚表面pH，因此，相關(guān)制劑pH應(yīng)盡可能接近皮膚本身pH值[19-20]。按最優(yōu)處方平行制備3批AEO-NE，應(yīng)用pH計(jì)于室溫條件下測(cè)定其pH值，平行3次。測(cè)量結(jié)果表明，最優(yōu)處方AEO-NE pH為5.89±0.16（＝3），符合皮膚給藥制劑弱酸性的要求。皮膚外用制劑的感官特性對(duì)于患者尤為重要，易于涂抹、使用后無黏膩感可顯著提高患者的順應(yīng)性。此外，較小的黏度有利于制劑滲透皮膚[21]。

圖7 AEO-NE的TEM微觀形態(tài)(100 nm, a; 50 nm, b)和宏觀形態(tài)(c, d)

按最優(yōu)處方平行制備3批AEO-NE，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)于室溫條件下測(cè)定其黏度，平行3次。結(jié)果表明，最優(yōu)處方制備的AEO-NE的黏度為（1.57±0.08）mPa·s（＝3），屬于低黏度流體，適于皮膚局部給藥。

2.5.5 載藥量及包封率 照最優(yōu)處方制備3批AEO-NE，并按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過后取續(xù)濾液加入樣品瓶，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄-藁本內(nèi)酯峰面積，計(jì)算樣品中-藁本內(nèi)酯的含量。結(jié)果表明，AEO-NE載藥量以-藁本內(nèi)酯計(jì)為（0.69±0.01）%。

采用超濾離心法，取一定量AEO-NE于10 000超濾離心管中，以10 000 r/min離心（離心半徑為9.2 cm）20 min，取濾液以適量甲醇溶解混勻，經(jīng)HPLC檢測(cè)-藁本內(nèi)酯含量，并按公式計(jì)算包封率。結(jié)果表明，AEO-NE的包封率為（99.28±0.44）%。

包封率＝(total－free)/total

total為制劑中-藁本內(nèi)酯含量，free為濾液中-藁本內(nèi)酯含量

2.6 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.6.1 離心穩(wěn)定性 取適量AEO-NE分別于6000、8000、10 000 r/min（離心半徑為6.2 cm）條件下離心20 min，觀察并測(cè)定離心前后外觀性狀、粒徑及PDI的變化。結(jié)果如表3所示，AEO-NE在6000、8000、10 000 r/min離心后粒徑未發(fā)生顯著變化，PDI仍保持在30%以內(nèi)，且外觀仍呈澄清、透明、微泛藍(lán)光狀，未產(chǎn)生分層、沉淀等不穩(wěn)定現(xiàn)象，表明離心穩(wěn)定性良好。

表3 不同離心轉(zhuǎn)速條件下AEO-NE離心前后粒徑和PDI變化(, n = 3)

2.6.2 稀釋穩(wěn)定性 用蒸餾水將AEO-NE分別稀釋50、100、200、1000倍，觀察AEO-NE稀釋前后外觀性狀。結(jié)果表明，按照以上倍數(shù)稀釋后，AEO-NE仍呈澄清透明狀，未產(chǎn)生分層、破乳、沉淀等不穩(wěn)定現(xiàn)象，表明稀釋穩(wěn)定性良好。

2.6.3 放置穩(wěn)定性 將AEO-NE裝于棕色密封螺口瓶中，分別在4、25、60 ℃條件下放置3個(gè)月，觀察外觀性狀并測(cè)定粒徑及-藁本內(nèi)酯含量變化情況。AEO-NE在60 ℃條件下不穩(wěn)定，發(fā)生分層、破乳等不穩(wěn)定現(xiàn)象，而在4、25 ℃條件下可維持澄清透明。

如表4所示，AEO-NE在4 ℃條件下放置穩(wěn)定性良好，粒徑無顯著變化，在25 ℃條件下粒徑顯著增加（＜0.001）；2種溫度條件下，PDI均保持在30%以內(nèi)；4 ℃、避光條件下，AEO-NE中主要成分-藁本內(nèi)酯含量?jī)H下降約2.5%，而在25 ℃、避光條件下，制劑中主要成分-藁本內(nèi)酯含量下降達(dá)75%。綜上，AEO-NE在4 ℃、避光條件下放置穩(wěn)定性良好。

表4 不同溫度下AEO-NE放置3個(gè)月粒徑、PDI及Z-藁本內(nèi)酯含量變化(, n = 3)

與同溫度0 d比較：***＜0.001；與同時(shí)間4 ℃比較：###＜0.001

***< 0.0010 d at the same temperature;###< 0.0014 ℃ at the same time

2.7 毛囊靶向研究

以尼羅紅為熒光探針制備熒光標(biāo)記的AEO-NE和AEO，精密吸取100 μL涂抹于C57BL/6小鼠背部脫毛區(qū)皮膚（2 cm×2 cm），分別于給藥12、24 h后將小鼠處死，取給藥區(qū)皮膚，經(jīng)冷凍切片（縱切，10 μm）后置于熒光顯微鏡（552 nm，×20）下觀察。如圖8-c、d所示，AEO給藥12 h，藥物主要停留在皮膚表皮層，給藥24 h后可觀察到藥物進(jìn)入皮膚真皮層，但分布無規(guī)則。如圖8-a、b所示，AEO-NE給藥12、24 h后，皮膚全層均有紅色熒光，說明AEO-NE能成功穿透皮膚各層；其中以真皮層毛囊部位的熒光最強(qiáng)，說明AEO-NE具有一定的毛囊靶向能力。

2.8 AEO-NE的體內(nèi)促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)藥效學(xué)研究

2.8.1 造模 用寵物剃毛器剃除小鼠脊柱兩側(cè)背部的毛發(fā)（面積約為4 cm2＝2 cm×2 cm）使其變短后，取適量脫毛膏涂抹于剃毛部位，3～4 min后除去殘余毛發(fā)并用溫水清洗干凈，選取脫毛區(qū)皮膚為粉紅色或膚色且無破損的小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

a、b-AEO-NE給藥12、24 h c、d-AEO給藥12、24 h

2.8.2 動(dòng)物分組及給藥 24只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（B-NE）、AEO-NE組、陽性對(duì)照組（2%米諾地爾）及AEO組，每組6只。在造模24 h后，用微量移液器吸取藥液后，用吸頭均勻涂抹在小鼠脫毛區(qū)皮膚上，待背部涂藥區(qū)完全揮干后，再放入籠中。每次給藥前使用生理鹽水將背部給藥區(qū)清洗干凈后擦干，隨即給藥，每天涂抹100 μL，每天1次，連續(xù)21 d。

2.8.3 體內(nèi)促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)作用評(píng)價(jià) 于給藥第21天測(cè)定小鼠新生毛發(fā)長(zhǎng)度，在脫毛區(qū)中間部位隨機(jī)拔取新生毛發(fā)5根，在放大鏡下用游標(biāo)卡尺下觀察測(cè)量，將毛發(fā)兩端的最遠(yuǎn)距離記為毛發(fā)長(zhǎng)度，取平均值。末次給藥24 h后，將小鼠備皮，處死，取背部定點(diǎn)皮膚（面積約2 cm×2 cm），10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，對(duì)比分析各組的毛囊生長(zhǎng)情況，并將病理切片置于光學(xué)顯微鏡（×200倍）對(duì)毛囊進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

結(jié)果如表5所示，與對(duì)照組相比，AEO-NE及陽性藥（2%米諾地爾）組小鼠毛發(fā)長(zhǎng)度、毛囊密度均顯著增加（＜0.05、0.01），AEO組雖無顯著性差異，但仍有增加趨勢(shì)。AEO-NE組小鼠毛囊密度最大（＜0.01），且顯著高于AEO組（＜0.01），說明納米乳遞藥系統(tǒng)有利于AEO的局部皮膚遞送。如圖9所示，各組小鼠給藥區(qū)域皮膚各層分界清晰，均未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，AEO-NE組小鼠可見大量毛囊增多。綜上，AEO-NE可以顯著增加新生毛發(fā)長(zhǎng)度、增大毛囊密度，具有促進(jìn)C57BL/6小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的作用，且無明顯皮膚刺激性。

表5 C57BL/6小鼠新生毛發(fā)長(zhǎng)度、毛囊密度測(cè)量結(jié)果(, n = 6)

與對(duì)照組比較：*＜0.05**＜0.01；與AEO-NE組比較：##＜0.01

*< 0.05**< 0.01control group;##< 0.01AEO-NE group

圖9 C57BL/6小鼠皮膚組織病理學(xué)

3 討論

脫發(fā)疾病發(fā)生率高，影響著全世界上億人，僅斑禿就困擾著數(shù)百萬人[22-23]。脫發(fā)屬于皮膚科常見病和多發(fā)病，以脂溢性脫發(fā)和斑禿最為常見[24]，雖不會(huì)危及生命健康，但均明顯影響患者外在形象，從而可能會(huì)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的心理后果，包括高度焦慮和抑郁等[25]。治療脫發(fā)的藥物以合成藥物為主，包括鉀離子通道類藥物（米諾地爾及其衍生物）、抗雄激素藥物（非那雄安和螺內(nèi)酯）、抗炎的糖皮質(zhì)激素類藥物等[26-27]。上述藥物安全性、長(zhǎng)期有效性、不良反應(yīng)等問題的存在，限制了其臨床應(yīng)用。基于安全性較高的特點(diǎn)，天然藥物及其有效成分在脫發(fā)疾病的治療領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。研究表明，酸棗仁精油、薰衣草精油、薄荷精油、側(cè)柏精油等揮發(fā)油均有一定的促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用[28-31]，提示天然植物來源的揮發(fā)油在治療脫發(fā)疾病方面具有一定潛力。

皮膚是人體最大的器官，經(jīng)皮給藥途徑為藥物的吸收提供了更大的表面積，有利于臨床療效的發(fā)揮[32]。且與口服、注射劑等相比，經(jīng)皮膚遞藥具有增強(qiáng)患者順應(yīng)性的優(yōu)勢(shì)。皮膚角質(zhì)層的障礙是藥物進(jìn)入皮膚的關(guān)鍵難題，其解決方法一般分為物理方法（微針、微射流、激光、電導(dǎo)等）和化學(xué)方法（滲透促進(jìn)劑、生物肽等）2種[33-34]。“藥輔合一”是中藥制劑過程中輔料使用的一大重要原則，也是中藥制劑區(qū)別于化藥制劑的顯著特征，但在新型遞藥系統(tǒng)中較少得到體現(xiàn)。AEO既是改善脫發(fā)癥狀的潛力藥效物質(zhì)，又具有促滲透作用，可作為一種具有促滲透作用的親脂性油狀液體，在納米乳遞藥系統(tǒng)中既能充當(dāng)油相又能作為促滲透劑，充分體現(xiàn)了“藥輔合一”的原則。此外，基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及精簡(jiǎn)處方、提高目標(biāo)藥物含量的考慮，本研究以AEO為納米乳遞藥系統(tǒng)唯一油相，制備皮膚給藥發(fā)揮局部作用的AEO-NE，以提高原料藥物AEO的穩(wěn)定性，精準(zhǔn)遞藥于毛囊，發(fā)揮促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)作用。本實(shí)驗(yàn)首先通過單因素實(shí)驗(yàn)確定磁力攪拌速度為800 r/min，攪拌時(shí)間為30 min，應(yīng)用偽三元相圖法篩選納米乳處方中乳化劑、助乳化劑的種類以及m。乳化劑篩選過程中發(fā)現(xiàn)，以AEO為油相，常用乳化劑T80與各助乳化劑在一定質(zhì)量比條件下均不能形成納米乳，可能與濕度有關(guān)。RH-40偽三元相圖面積稍大于OP-10，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以RH-40為乳化劑、混合表面活性劑與油相質(zhì)量比為6∶4時(shí)，不能形成納米乳；以O(shè)P-10為乳化劑、混合表面活性劑與油相質(zhì)量比為6∶4時(shí)，能形成納米乳，因此綜合考慮初步確定乳化劑為OP-10。

藥物的尺寸會(huì)影響其皮膚遞送的效率，一般尺寸越小越容易進(jìn)入皮膚的較深層[35]。制劑表征結(jié)果表明，AEO-NE粒徑較小，利于AEO進(jìn)入皮膚深層發(fā)揮藥理作用。藥效學(xué)研究證實(shí)，AEO-NE較AEO增加毛發(fā)長(zhǎng)度、毛囊密度的作用強(qiáng)，表明NE有利于AEO的皮膚遞送，發(fā)揮毛發(fā)生長(zhǎng)促進(jìn)作用。熒光成像結(jié)果表明，皮膚給藥AEO-NE在24 h內(nèi)表現(xiàn)出一定的毛囊靶向性，有利于藥效的精準(zhǔn)發(fā)揮和毒性的降低。綜上，納米乳在毛囊相關(guān)疾病的制劑開發(fā)方面具有一定前景。本研究成功構(gòu)建了適于皮膚給藥的AEO-NE，揭示了其在靶向治療毛囊相關(guān)疾病的潛力，但皮膚刺激性、皮膚滲透及滯留等性能的體內(nèi)外評(píng)價(jià)有待進(jìn)一步開展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2020: 139.

[2] Li X C, Wu X T, Huang L. Correlation between antioxidant activities and phenolic contents of(Danggui) [J]., 2009, 14(12): 5349-5361.

[3] Li S Y, Yu Y, Li S P. Identification of antioxidants in essential oil ofusing HPLC coupled with DAD-MS and ABTS-based assay [J]., 2007, 55(9): 3358-3362.

[4] Chao W W, Hong Y H, Chen M L,. Inhibitory effects ofethyl acetate extract and major compounds on NF-kappaB trans-activation activity and LPS-induced inflammation [J]., 2010, 129(2): 244-249.

[5] Gong W X, Zhou Y Z, Gong W L,. Coniferyl ferulate exerts antidepressant effect via inhibiting the activation of NMDAR-CaMKII-MAPKs and mitochondrial apoptotic pathways [J]., 2020, 251: 112533.

[6] 李銘. 當(dāng)歸精油的生發(fā)作用臨床觀察 [J]. 中醫(yī)藥研究, 1995(1): 28.

[7] Gregoriou S, Papafragkaki D, Kontochristopoulos G,. Cytokines and other mediators in alopecia areata [J]., 2010, 2010: 928030.

[8] Wu Z W, Uchi H, Morino-Koga S,.-ligustilide ameliorated ultraviolet B-induced oxidative stress and inflammatory cytokine production in human keratinocytes through upregulation of Nrf2/HO-1 and suppression of NF-κB pathway [J]., 2015, 24(9): 703-708.

[9] Li J, Hua Y L, Ji P,. Effects of volatile oils ofon an acute inflammation rat model [J]., 2016, 54(9): 1881-1890.

[10] Fu R H, Hran H J, Chu C L,. Lipopolysaccharide-stimulated activation of murine DC2.4 cells is attenuated by-butylidenephthalide through suppression of the NF-κB pathway [J]., 2011, 33(5): 903-910.

[11] McClements D J. Emulsion design to improve the delivery of functional lipophilic components [J]., 2010, 1: 241-269.

[12] McClements D J. Edible nanoemulsions: Fabrication, properties, and functional performance [J]., 2011, 7(6): 2297-2316.

[13] Shakeel F, Faisal M S. Nanoemulsion: A promising tool for solubility and dissolution enhancement of celecoxib [J]., 2010, 15(1): 53-56.

[14] Lima T S, Silva M F S, Nunes X P,. Cineole-containing nanoemulsion: Development, stability, and antibacterial activity [J]., 2021, 239: 105113.

[15] Zeng F Y, Wang D D, Tian Y,. Nanoemulsion for improving the oral bioavailability of hesperetin: Formulation optimization and absorption mechanism [J]., 2021, 110(6): 2555-2561.

[16] Abd E, Benson H A E, Roberts M S,. Minoxidil skin delivery from nanoemulsion formulations containing eucalyptol or oleic acid: Enhanced diffusivity and follicular targeting [J]., 2018, 10(1): 19.

[17] Grampurohit N, Ravikumar P, Mallya R. Microemulsions for topical use-A review [J]., 2011, 45(1): 100-107.

[18] 趙婷婷, 張彤, 項(xiàng)樂源, 等. 當(dāng)歸、丁香揮發(fā)油的促透皮吸收作用 [J]. 中成藥, 2016, 38(9): 1923-1929.

[19] Blaak J, Staib P. The relation of pH and skin cleansing [J]., 2018, 54: 132-142.

[20] Lambers H, Piessens S, Bloem A,. Natural skin surface pH is on average below 5, which is beneficial for its resident flora [J]., 2006, 28(5): 359-370.

[21] Ahmad K, Win T, Jaffri J M,. Palm olein emulsion: A novel vehicle for topical drug delivery of betamethasone 17-valerate [J]., 2018, 19(1): 371-383.

[22] Adil A, Godwin M. The effectiveness of treatments for androgenetic alopecia: A systematic review and meta-analysis [J]., 2017, 77(1): 136-141.

[23] 馬歡. “頭頂”市場(chǎng)規(guī)模擴(kuò)張防脫產(chǎn)品路向何方? [J]. 中國(guó)化妝品, 2020(11): 28-31.

[24] ?kulj A Z, Polj?ak N, Glava? N K,. Herbal preparations for the treatment of hair loss [J]., 2020, 312(6): 395-406.

[25] Hunt N, McHale S. The psychological impact of alopecia [J]., 2005, 331(7522): 951-953.

[26] Blumeyer A, Tosti A, Messenger A,. Evidence-based (S3) guideline for the treatment of androgenetic alopecia in women and in men [J]., 2011, 9(Suppl 6): S1-S57.

[27] Meidan V M, Touitou E. Treatments for androgenetic alopecia and alopecia areata [J]., 2001, 61(1): 53-69.

[28] Yoon J I, Al-Reza S M, Kang S C. Hair growth promoting effect ofessential oil [J]., 2010, 48(5): 1350-1354.

[29] Oh J Y, Park M A, Kim Y C. Peppermint oil promotes hair growth without toxic signs [J]., 2014, 30(4): 297-304.

[30] Lee B H, Lee J S, Kim Y C. Hair growth-promoting effects of lavender oil in C57BL/6 mice [J]., 2016, 32(2): 103-108.

[31] Zhang Y, Chen S S, Qu F Z,.andevaluation of hair growth potential of, and GC-MS analysis of the active constituents of volatile oil [J]., 2019, 238: 111835.

[32] Desai P, Patlolla R R, Singh M. Interaction of nanoparticles and cell-penetrating peptides with skin for transdermal drug delivery [J]., 2010, 27(7): 247-259.

[33] Hwa C, Bauer E A, Cohen D E. Skin biology [J]., 2011, 24(5): 464-470.

[34] Münch S, Wohlrab J, Neubert R H H. Dermal and transdermal delivery of pharmaceutically relevant macromolecules [J]., 2017, 119: 235-242.

[35] Verma D D, Verma S, Blume G,. Particle size of liposomes influences dermal delivery of substances into skin [J]., 2003, 258(1/2): 141-151.

Construction, characterization and evaluation ofessential oil-loaded nanoemulsion drug delivery system based on concept of “combination of drugs and adjuvants”

QIU Jing, XU Chun-yi, ZHOU Wei-ling, ZHAO Lin-xian, LI Yan-yan, HU Hui-ling

State Key Laboratory of Southwestern Traditional Chinese Medicine Resources, College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To prepare, characterizeessential oil (AEO)-loaded nanoemulsion (AEO-NE) and evaluate on its hair follicle targeted capacity, hair growth promoting effect and stability.The pseudo-ternary phase diagram method and central composite design-response surface method (CCD-RSM) were used to screen and optimize the prescription of AEO-NE, respectively. The type, average droplet size, ζ potential, polydispersion index (PDI), microscopic morphology, viscosity and pH of AEO-NE were characterized. The centrifugation stability, placement stability and dilution stability of the optimized AEO-NE were evaluated with particle size, PDI, appearance change and content of-ligustilide as indicators. The hair follicle targeted ability of AEO-NE was investigated by administrating fluorescin-labeled AEO-NE to the back skin of mice. The promoting effect of AEO-NE on hair growth was studied in C57BL/6 mice.The optimized formula of AEO-NE consisted 2.25% octylphenol polyoxyethylene ether 10 (OP-10), 0.75% absolute ethanol, 1% AEO and 96% water; The appearance of the optimized AEO-NE was clear, transparent and slightly blue. The emulsion type is O/W type, the average particle size was (15.95 ± 0.33) nm, the PDI was 0.11 ± 0.02, the ζ potential was (?0.14 ± 0.10) mV, the pH value was 5.89 ± 0.16, and the viscosity was (1.57 ± 0.08) mPa·s. The result of transmission electron microscope showed that AEO-NE was spherical and round, and its size was within 20 nm. AEO-NE had good stability in centrifugation and dilution, and was stable at 4 ℃ avoiding light with no significant changes in droplet size and-ligustilide content. AEO-NE showed hair follicle targeted property within 24 h with local skin administration, and had the effect of promoting hair growth.Based on the concept of “combination of drugs and adjuvants”, the AEO-NE with AEO as the only oil phase was successfully constructed. Its macro- and micro-morphology, related physical and chemical properties met the requirements of nanoemulsion preparation. With good stability, AEO-NE had certain potential in hair follicle-targeted promoting hair growth.

essential oil; nanoemulsion; selection of composition; CCD-RSM; characterization; stability evaluation; hair follicle targeted; hair growth promoting effect

R283.6

A

0253 - 2670(2023)06 - 1783 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.010

2022-10-19

四川省科技廳項(xiàng)目（2019ZYZF0171）

邱 菁（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬聞┬?、新技術(shù)。E-mail: 1814105634@qq.com

胡慧玲，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┬聞┬汀⑿录夹g(shù)。E-mail: huhuiling@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]