高漸聯，周 霖，王肖輝，聶興國，朱超男

基于液質聯用結合網絡藥理學的復方傷痛膠囊中5種藥效成分定量及作用機制研究

高漸聯1，周 霖2*，王肖輝2*，聶興國3，朱超男1

1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 藥學部，河南 衛(wèi)輝 453100 2. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院 藥學部，河南 鄭州 450052 3. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 骨科，河南 衛(wèi)輝 453100

對復方傷痛膠囊中的5種藥效成分進行定量，提升藥物質量標準，并對藥效成分在藥物治療中的作用機制進行研究。采用Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）進行成分初步分離，乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相梯度洗脫；采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS儀器，使用Full mass/dd MS2模式對藥物中的關鍵成分進行快速、準確含量測定；基于網絡藥理學構建關鍵成分-重要靶點網絡，并進一步進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本體（gene ontology，GO）分析，找到關鍵信號通路和作用靶點。建立的分析方法學較為穩(wěn)定，能夠滿足分析的標準需要；5種藥效成分（沒食子酸、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚和延胡索乙素）線性關系均良好，≥0.999 0；網絡藥理學結果顯示，藥物中的藥效成分可能是通過基質金屬蛋白酶9（matrix metallo protein 9，MMP9）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、MMP2、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等炎癥、疼痛關鍵靶點，從而發(fā)揮緩解疼痛及炎癥等作用。實驗驗證結果發(fā)現，沒食子酸能夠明顯降低脂多糖誘導的小鼠單核巨噬細胞白血病RAW264.7細胞中的IL-2水平，大黃素能夠明顯降低RAW264.7細胞中的PTGS2水平，大黃酸能夠明顯降低RAW264.7細胞中的MMP9水平，大黃素甲醚能夠明顯降低RAW264.7細胞中的EGFR水平，延胡索乙素能夠明顯降低RAW264.7細胞中的MMP2水平。對復方傷痛膠囊的質量提升提供了重要的參考依據，同時為中醫(yī)藥相關藥效成分研究提供了一種借鑒思路。

網絡藥理學；復方傷痛膠囊；沒食子酸；大黃素；大黃酸；大黃素甲醚；延胡索乙素；基質金屬蛋白酶9；前列腺素內過氧化物合酶2；白細胞介素-2；表皮生長因子受體；核因子-κB；轉化生長因子-β；腫瘤壞死因子

復方傷痛膠囊（Fufang Shangtong Capsule，FSC）是由大黃（酒制）、當歸、柴胡、天花粉、桃仁（去皮）、紅花、醋延胡索、甘草等中藥材，在中醫(yī)藥理論的指導下，經現代工藝提取加工而成的中藥復方制劑[1]，具有化瘀、行氣、止痛的功效，臨床上常用于急性胸壁扭挫傷之瘀滯證等，療效確切，應用廣泛[2-4]。藥效成分是藥物中的關鍵物質，也是藥物發(fā)揮治療疾病作用的根本基礎。本研究查閱文獻并采用網絡藥理學方法對FSC中的成分進行篩選，發(fā)現其中的沒食子酸、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚和延胡索乙素在疼痛以及炎癥性疾病治療中發(fā)揮著關鍵作用，是FSC的潛在重要藥效成分[5-7]。由于藥物中的有效成分含量較低，且目前尚未有對該藥物中此類成分定量研究的相關報道。因此，本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS高分辨液質聯用系統，建立了快速、科學、準確的一級Full mass全掃描同時定性、定量分析方法對FSC中的5種藥效成分進行含量測定。該方法具有分析時間短、選擇性強、靈敏度高等優(yōu)點，可用于FSC中復雜活性成分的快速定性及定量分析。同時，本研究基于網絡藥理學及實驗藥理學對以上成分的關鍵作用靶點進行系統分析，深入挖掘其在藥物治療疾病中的作用。

1 儀器與材料

Q-Exactive型液相色譜-質譜聯用系統，美國Thermo Fisher Scientific公司；Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），美國Waters公司；New Classic MS型十萬分之一分析天平，瑞士Mettler Toledo上海有限公司；BX7200HP型臺式超聲波清洗器，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

對照品沒食子酸（批號MUST-18032801）、延胡索乙素（批號MUST-17022720），購于成都曼思特生物科技有限公司；對照品大黃酸（批號wkq16062204）、大黃素（批號wkq16071004）、大黃素甲醚（批號wkq16070403），購于四川維克奇生物科技有限公司；質量分數均大于99%。甲酸、乙腈、甲醇為色譜級純，美國Fisher公司；水為哇哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；其他試劑均為分析純。

RAW264.7細胞（批號CL0173）購自普諾賽生物科技有限公司；胎牛血清（批號BL205C）、DMEM培養(yǎng)基（批號A8190R）、SDS-PAGE（批號BL502B）、ECL試劑盒（批號GK10008）購自河南天馳生物技術有限公司；基質金屬蛋白酶9（matrix metallo protein 9，MMP9，批號ab100610）、MMP2（批號ab100606）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2，批號ab221834）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2，批號ab278922）及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR，批號ab269558）ELISA試劑盒購自Abcam生物科技有限公司。

一抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH，批號GB15002）、MMP9（批號GB11132）、IL-2（批號GB11114）、PTGS2（批號GB11077-2）、MMP2（批號GB111507）、EGFR（批號GB111504）；二抗辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-山羊抗小鼠（批號GB23301）、HRP-山羊抗兔（批號GB23303）試劑盒均購自Servicebio生物科技有限公司。

FSC編號為S1～S20，批次分別為805031、806038、805076、810002、805074、808031、806053、809031、807073、803022、811003、805038、805019、809020、807018、806064、803038、808020、807067、807070，均購自甘肅省西峰制藥有限公司，密封保存于陰涼干燥處。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的配制

精密稱定適量的沒食子酸、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚和延胡索乙素的對照品，加入純甲醇制備成混合對照品儲備液，各成分質量濃度分別為19.52、278.68、1.61、39.41、1.46 μg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

取FSC內容物，置于錐形瓶中加入純甲醇50 mL，密封，稱定總質量，超聲輔助溶解20 min（參數設置為200 W、50 kHz），放冷，再次稱定質量，用純甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，經0.22 μm微孔濾膜濾過后，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫，洗脫程序為0～1.0 min，5%乙腈；1.0～3.0 min，5%～20%乙腈；3.0～6.0 min，20%～30%乙腈；6.0～9.0 min，30～50%乙腈；9.0～12.0 min，50%～30%乙腈；12.0～18.0 min，30%～0乙腈；18.0～20.0 min，0～5%乙腈。體積流量為0.3 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。

2.4 質譜條件

離子源為HESI（heated ESI）源，離子傳輸管溫度為320 ℃，輔助氣溫度為300 ℃，輔助氣體積流量為10 μL/min；正離子模式下：鞘氣體積流量為40 μL/min，噴霧電壓為3.50 kV；負離子模式下：鞘氣體積流量為38 μL/min，噴霧電壓為2.80 kV，/掃描范圍為80～1200，一級掃描分辨率為70 000。在優(yōu)化的色譜質譜條件下5種待測成分的提取離子流圖及質譜圖見圖1，目標分析物參數見表1。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性考察 取“2.1”項下混合對照品溶液、“2.2”項下供試品溶液和空白對照溶液（甲醇），按“2.3”及“2.4”項下色譜及質譜條件進樣測定。結果顯示，空白溶液對所測成分無干擾，且供試品溶液中5種待測成分的出峰時間與對照品溶液中的基本一致，說明方法專屬性較好。

1-沒食子酸 2-大黃素 3-大黃酸 4-大黃素甲醚 5-延胡索乙素

表1 5種待測成分的質譜分析參數

2.5.2 線性關系考察 分別精密量取混合對照品儲備液適量，純甲醇稀釋并定容，依次配制成6個質量濃度的系列梯度溶液，其中沒食子酸0.61、1.22、2.44、4.88、9.76、19.52 μg/mL；大黃素8.71、17.42、34.83、69.67、139.34、278.68 μg/mL；大黃酸0.05、0.10、0.20、0.40、0.81、1.61 μg/mL；大黃素甲醚1.23、2.46、4.93、9.85、19.71、39.41 μg/mL；延胡索乙素0.05、0.09、0.18、0.36、0.73、1.46 μg/mL在“2.3”和“2.4”項下UHPLC-Q-Orbitrap HRMS色譜、質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以各待測物的質量濃度為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，得回歸方程、相關系數（）及線性范圍；以信噪比為10計算定量限，結果分別為沒食子酸＝4.25×108＋8.00×107，＝0.999 8，線性范圍0.61～19.52 μg/mL，定量限0.130 ng/mL；大黃素＝2.40×107－1.20×106，＝0.999 0，線性范圍8.71～278.68 μg/mL，定量限1.505 ng/mL；大黃酸＝2.04×109＋3.49×107，＝0.999 4，線性范圍0.05～1.61 μg/mL，定量限0.020 ng/mL；大黃素甲醚＝3.68×106－2.78×106，＝0.999 0，線性范圍1.23～39.41 μg/mL，定量限1.945 ng/mL；延胡索乙素＝4.82×109＋1.27×108，＝0.999 5，線性范圍0.05～1.46 μg/mL，定量限0.033 ng/mL。結果表明，5種待測化合物在質量濃度范圍內線性關系均良好，≥0.999 0。

2.5.3 精密度考察 精密吸取供試品溶液（批號806038）5 μL，連續(xù)進樣6次，結果顯示沒食子酸、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、延胡索乙素的峰面積的RSD分別為1.40%、1.32%、2.22%、4.15%、1.64%，結果表明該方法精密度良好。

2.5.4 重復性考察 取同一批樣品（批號806038），按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，分別進樣測定并計算含量，測得沒食子酸、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、延胡索乙素的平均質量分數分別為237.72、4128.27、10.74、886.53、8.85 μg/g，RSD分別為0.68%、1.40%、0.87%、1.28%、0.66%，結果表明該方法重復性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號806038），分別于0、2、6、10、12、24 h進樣分析，測得沒食子酸、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、延胡索乙素的峰面積的RSD分別為1.08%、1.86%、1.26%、0.83%、0.68%，結果表明，供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收率試驗 稱取樣品粉末（批號806038）共9等份，每3份為1組，精密稱定，分別加入沒食子酸、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、延胡索乙素的對照品適量，使加入各成分含量分別為FSC中相應成分含量的50%、100%、150%。按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液，處理后分別進樣測定。計算各待測物的平均回收率及RSD，結果顯示沒食子酸、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、延胡索乙素的平均回收率分別為99.75%、98.84%、100.12%、99.56%、99.16%，RSD分別1.81%、0.62%、1.46%、0.62%、0.57%，結果表明該方法下5種待測成分的測定準確度較好。

2.5.7 樣品含量測定 取20個不同批次的FSC，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液各3份，在“2.3”和“2.4”項下色譜、質譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算5種待測物在FSC中的含量，結果見表2。

2.6 關鍵藥效成分的網絡藥理學分析及分子對接實驗

2.6.1 作用靶點獲取 結合PharmMapper數據庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/，數據庫靶點篩選物種為人，Fit值＞2）、Swiss Target Prediction數據庫［http://www.swisstargetprediction.ch/，數據庫選擇物種為人，靶點選擇概率（probability）＞0］和Similarity Ensemble Approach（SEA）數據庫（https://sea.bkslab.org/，數據庫靶點篩選物種為人）3個權威網站預測5種定量成分的作用靶點，共獲得593個作用靶點。

表2 FSC中5種待測成分的測定結果(, n = 20)

2.6.2 成分-靶點網絡的構建 基于Cytoscape 3.9.1軟件構建以上關鍵藥效成分的成分-靶點相互作用網絡圖，該網絡包含433個節(jié)點和593條邊，如圖2所示。分析網絡圖，以度（degree）值為中位數2倍為篩選條件，獲得73個關鍵作用靶點；頻率較高的靶點基因分別是MMP9、PTGS2、MMP2、IL-2、EGFR、絲裂原激活蛋白激酶8（mitogen activated protein kinase 8，MAPK8）、細胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin dependent kinase 1，CDK1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator- activated receptor γ，PPARγ）等，這些基因與免疫炎癥、疼痛以及血管調節(jié)等密切相關。

2.6.3 KEGG信號通路及GO生物過程富集分析將篩選到的73個關鍵作用靶點導入DAVID數據庫進行KEGG富集分析，以＜0.05為篩選條件，共得到44條通路，排名靠前的20條重要通路，分別為核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-17、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis）、Toll樣受體（Toll-like receptor）和MAPK信號通路等，結果見圖3。由此可見，在藥物成分對應的靶基因下，富集的信號通路主要集中在對炎癥性信號通路等方面，這些炎性信號與疼痛疾病密切相關，與FSC的主治疾病契合度較高，表明了本研究對這些藥效成分定量的科學性和合理性。

圖2 5種主要成分-靶點網絡圖

基于DAVID數據庫對篩選出來的73個關鍵作用靶點分別從生物過程、細胞組分及分子功能3個層面進行注釋，即GO生物學過程富集分析。GO富集分析結果顯示，這些關鍵作用靶點主要富集在264個生物學過程，69種細胞組分和60種分子功能。主要生物過程富集結果見圖4，分子功能及細胞組分富集分別見圖5和圖6。由圖中GO分析結果可見，以上藥效成分的生物過程主要涉及炎癥反應、細胞分化以及免疫應答等；在分子功能中與生長因子活性、凝血酶活性以及能量活性等高度相關；這些靶點在細胞組分中與胞質、胞膜以及胞核等相關性較大。

圖3 經KEGG富集分析后的主要通路

2.6.4 分子對接實驗 首先，從RCSB PDB在線平臺（http://www.rcsb.org/）導出與關鍵靶點相關的3D蛋白結構并導出為PDB格式。然后，從PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性化合物的3D結構，以SDF格式存儲。隨后導入OpenBabel 3.1.1軟件轉化為AutoDock可以識別的格式。使用Pymol對活性化合物和蛋白結構進行去水，去除小分子的操作，并導入AutoDockTools-1.5.7軟件將活性化合物設置為配體（加全氫、檢測設置扭轉?。?，蛋白結構設置為受體（加全氫），同時轉換為“pdbqt”格式；運行AutoDock4（設置對接Box、對接參數、運算方法等）進行分子對接，對接結果在Pymol上進行可視化。最后，利用對接結合能來評估化合物小分子與疾病靶蛋白結合的能力。

圖4 關鍵作用靶點的生物過程GO分析(生物過程)

圖5 關鍵作用靶點的分子功能GO分析(分子功能)

圖6 關鍵作用靶點的細胞組成GO分析(細胞組分)

分子對接結果（圖7）顯示，大黃酸對接MMP9、沒食子酸對接IL-2、大黃素對接PTGS2、延胡索乙素對接MMP2、大黃素甲醚對接EGFR的結合能較低，分子對蛋白質之間至少形成2個氫鍵，對接結果較為穩(wěn)定。

2.7 實驗驗證

2.7.1 細胞培養(yǎng) 將小鼠單核巨噬細胞（RAW 264.7）采用含10%胎牛血清（FBS）、80 U/mL青霉素以及0.08 mg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，用細胞刮刀刮取細胞進行傳代。

圖7 藥效成分與關鍵靶點的分子對接結果

2.7.2 ELISA法檢測細胞上清液中MMP-9、IL-2、PTGS2、MMP2及EGFR水平 本研究依據相關參考文獻[8-12]并采用MTT法確定了各成分作用于細胞的最佳劑量，進一步進行實驗驗證。取對數生長期細胞，按照每孔2×105的密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，棄上清液，分別進行大黃酸（設置對照組、模型組和大黃酸6、12、24 μmol/L）、沒食子酸（設置對照組、模型組和沒食子酸5、10、25 μg/mL）、大黃素（設置對照組、模型組和大黃素40、80、160 μmol/L）、延胡索乙素（設置對照組、模型組和延胡索乙素5、10、20 μmol/L）、大黃素甲醚（設置對照組、模型組和大黃素甲醚2、4、6 μmol/L）的藥效實驗。其中對照組僅給予培養(yǎng)基，模型組給予1 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），各成分低、中、高劑量組在給予1 μg/mL LPS的基礎上，同時添加相應濃度的藥物。藥物干預24 h后，取細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測各組的MMP9、IL-2、PTGS2、MMP2及EGFR水平。檢測結果（表3～7）顯示，大黃酸能夠明顯降低細胞上清中的MMP9水平（＜0.05），沒食子酸能夠明顯降低細胞上清中的IL-2水平（＜0.05），大黃素能夠明顯降低細胞上清中的PTGS2水平（＜0.05），延胡索乙素能夠明顯降低細胞上清中的MMP2水平（＜0.05），大黃素甲醚能夠明顯降低細胞上清中的EGFR水平（＜0.05）。

表3 大黃酸對細胞上清液中MMP9水平的影響(, n = 6)

與對照組比較：*＜0.05；與模型組比較：#＜0.05，下表同

*< 0.05control group;#< 0.05model group, same as below tables

表4 沒食子酸對細胞上清液中IL-2水平的影響(, n = 6)

表5 大黃素對細胞上清液中PTGS2水平的影響(, n = 6)

表6 延胡索乙素對細胞上清液中MMP2水平的影響(, n = 6)

表7 大黃素甲醚對細胞上清液中EGFR水平的影響(, n = 6)

2.7.3 蛋白印跡法（Western blotting）檢測細胞中MMP9、IL-2、PTGS2、MMP2及EGFR蛋白表達水平 按照“2.7.2”項下方法處理并收集細胞，加入裂解液，冰上裂解30 min后，于4 ℃、12 000 r/min條件下離心（半徑8.5 cm）30 min，二喹啉甲酸（bicin choninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，加入適量上樣緩沖液，沸水浴中處理8 min進行變性。蛋白（上樣量為30 μg）經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝膠電泳分離，轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗（稀釋比1∶2000）4 ℃孵育過夜，用添加聚山梨酯-20的Tris-緩沖鹽（tris-buffered saline tween，TBST）洗膜4次，孵育二抗（稀釋比1∶5000），增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）化學發(fā)光法進行顯色，GAPDH作為內參。檢測結果（圖8和表8～12）顯示，大黃酸能夠明顯降低細胞中的MMP9蛋白表達水平，沒食子酸能夠明顯降低細胞中的IL-2蛋白表達水平（＜0.05），大黃素能夠明顯降低細胞中的PTGS2蛋白表達水平（＜0.05），延胡索乙素能夠明顯降低細胞中的MMP2蛋白表達水平（＜0.05），大黃素甲醚能夠明顯降低細胞中的EGFR蛋白表達水平（＜0.05）。

圖8 各組細胞中MMP9、IL-2、PTGS2、MMP2及EGFR蛋白表達檢測

表8 大黃酸對細胞中MMP9蛋白表達水平的影響(, n = 6)

表9 沒食子酸對細胞中IL-2蛋白表達水平的影響(, n = 6)

3 討論

3.1 提取方法優(yōu)化

本實驗考察了不同的提取溶劑（乙醇、甲醇、80%乙醇、80%甲醇、40%乙醇、40%甲醇、水）及提取時間（10、20、30 min）對提取效果的影響。結果發(fā)現，乙醇、甲醇均具有最好的提取效果，但使用甲醇提取后各成分的出峰效果最好，因此采用純甲醇作為提取溶劑；提取時間設置為10 min時，待測成分提取不夠完全，影響分析效果，提取時間設置為30 min時的提取效率與20 min大體相同，表明20 min時藥物中的待測目標成分已經提取完全，因此本實驗采用的提取時間為20 min；本實驗分別使用純甲醇30、50、70 mL提取20 min，結果發(fā)現待測成分在30 mL溶劑中提取不夠完全，50 mL和70 mL的提取效率較為接近，表明待測成分在50 mL溶劑中可以提取完全，故本實驗使用純甲醇50 mL超聲提取20 min。

表10 大黃素對細胞中PTGS2蛋白表達水平的影響(, n = 6)

表11 延胡索乙素對細胞中MMP2蛋白表達水平的影響(, n = 6)

表12 大黃素甲醚對細胞中EGFR蛋白表達水平的影響(, n = 6)

3.2 流動相的選擇

本實驗分別考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液流動相系統的分離能力，結果發(fā)現乙腈的洗脫能力相對甲醇較強，各化合物的分離效果較好；而加入0.1%甲酸水可以使各成分響應更高，能夠更好地滿足分析要求。因此，本實驗最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相進行洗脫，達到有效分離的目的。

3.3 實驗藥理學研究分析

本研究基于FSC中關鍵藥效成分進行了網絡藥理學分析及實驗藥理學驗證，以期能夠更加深刻理解該藥物藥效成分對藥物治療疾病的關鍵作用。研究結果顯示藥物中的5種藥效成分能夠有效干預MMP9、PTGS2、MMP2、IL2、EGFR等炎癥、血管因子關鍵靶點，表明本研究篩選到的藥效成分在藥物的治療過程中起到了重要作用。在以上篩選的關鍵靶點及通路中，MMP2及MMP9可作用于各種膠原、明膠、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，可能是發(fā)揮斑塊溶解進而發(fā)揮祛瘀作用的主要靶點[13]。PTGS2是非甾體抗炎藥物靶標，可控制前列腺素合成，有效控制炎性反應，進而減輕疼痛[14]。IL-2在中樞和外周有鎮(zhèn)痛作用，可能是藥物發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的關鍵靶點[15]。EGFR可以誘導并維持不同條件下的痛敏反應，其介導的信號通路對神經病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[16]。

有研究發(fā)現，通過抑制NF-κB信號通路，可以抑制炎癥因子釋放，從而緩解炎癥性疼痛[17]；TGF-β信號在造血的發(fā)生和發(fā)育中起著關鍵作用，可能是活血化瘀的重要信號通路之一[18]；TNF-α通過調控NF-κB等相關信號通路，導致了進行性加重的疼痛，并進一步作用于神經元，通過P物質等在神經元間產生痛覺敏化，最終傳入脊髓中樞導致劇烈的癌痛，因此，TNF信號通路也是緩解疼痛的重要通路之一[19]。

此外，有研究表明，沒食子酸對小鼠促炎因子（TNF-α、IL-6）以及過敏介質組胺具有顯著的抑制作用，能抑制炎癥過敏反應的發(fā)生，對于疼痛疾病具有較好的緩解作用[20-21]；大黃酸可減少IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎細胞因子的生成，同時抑制NF-κB和NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥因子途徑，顯著減少免疫細胞遷移而發(fā)揮強大的抗炎作用，還能抑制MMP2及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAkt）/ Akt比值的增加而減輕炎性反應，與調節(jié)疼痛等疾病密切相關[22-23]；大黃素可通過調節(jié)鞘脂代謝及精氨酸生物合成發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[24-25]；大黃素甲醚可通過調節(jié)沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）-腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）信號通路來緩解機體炎癥水平[26]；延胡索乙素具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，是FSC緩解疼痛的主要藥效物質之一[27-28]。以上藥效成分在藥物治療疼痛性疾病的過程中從不同角度發(fā)揮著抗炎、緩解疼痛等治療作用。

本研究采用先進的液質聯用技術對藥物中的關鍵藥效成分進行了快速、準確、科學的定量，為藥物質量標準的制定和提升奠定了扎實的前期基礎；同時，基于網絡藥理學和實驗藥理學全面、系統地揭示了藥效成分在藥物質量和治療方面的科學內涵，有助于更加直觀地認識藥效成分在藥物中扮演的重要角色。本研究將為FSC質量水平的提升提供參考依據，同時為中醫(yī)藥今后相關藥物藥效成分研究方法提供了一種新的借鑒思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 朱立國, 李盛華, 趙曉平, 等. 復方傷痛膠囊治療急性胸壁扭挫傷臨床應用專家共識 [J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2020, 38(5): 252-258.

[2] 王壽強, 雍娟. 復方傷痛膠囊在急性胸壁扭挫傷中的應用及對神經肽的影響 [J]. 中國醫(yī)師雜志, 2020, 22(2): 306-308.

[3] 朱鵬飛, 楊瑩瑩, 郭艷波. 復方傷痛膠囊治療肋骨骨折合并血胸的療效觀察 [J]. 中國中西醫(yī)結合外科雜志, 2019, 25(6): 915-918.

[4] 衛(wèi)杰, 林吉良. 從“筋骨同治”理論探討復方傷痛膠囊對橈骨骨折術后腫痛及骨折恢復的影響 [J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2021, 48(12): 93-95.

[5] 高雅, 李驊, 王四旺, 等. 沒食子酸的藥理作用及其藥物代謝動力學研究進展 [J]. 西北藥學雜志, 2014, 29(4): 435-438.

[6] 韓思琪, 哈偉, 師彥平. 大黃及其有效成分抗炎作用的研究進展 [J]. 中草藥, 2023, 54(1): 303-316.

[7] 唐逸豐. 延胡索化學成分與藥理作用研究概況 [J]. 中醫(yī)臨床研究, 2018, 10(23): 144-146.

[8] 鐘先鋒, 羅婷, 鄧澤元, 等. 大黃酸對正常和氧化損傷內皮細胞的增殖和氧化保護作用 [J]. 食品科學, 2012, 33(11): 257-261.

[9] 方國平, 周薈慧, 方穎, 等. 沒食子酸誘導ROS積蓄介導黑色素瘤B16-F10細胞內源性凋亡及周期阻滯 [J]. 現代腫瘤醫(yī)學, 2022, 30(21): 3835-3841.

[10] 熊思敏, 張金曉, 康瑋, 等. 大黃素誘導人肝癌HepG2細胞線粒體凋亡作用研究 [J]. 藥物評價研究, 2018, 41(5): 773-779.

[11] 蹇明輝, 陳文明, 張怡. 延胡索乙素對高糖誘導H9c2細胞凋亡和氧化應激的抑制作用 [J]. 遵義醫(yī)科大學學報, 2022, 45(3): 317-321.

[12] 陶正娣, 吳勤研, 藍曉紅, 等. 大黃素甲醚對人肝癌細胞增殖及糖酵解的調控作用及機制研究 [J]. 臨床腫瘤學雜志, 2022, 27(9): 769-775.

[13] 張莉, 白林英, 母凱茜, 等. 燈盞乙素對小型豬動脈粥樣硬化模型頸總動脈斑塊組織中基質金屬蛋白酶-1、2、9表達的影響 [J]. 中藥藥理與臨床, 2020, 36(6): 91-97.

[14] Gray R T, Cantwell M M, Coleman H G,. Evaluation of PTGS2 expression, PIK3CA mutation, aspirin use and colon cancer survival in a population-based cohort study [J]., 2017, 8(4): e91.

[15] 劉珊, 史霖, 王軍陽,等. 白介素2在小鼠分支選擇損傷神經源性疼痛模型中的鎮(zhèn)痛作用 [J]. 南方醫(yī)科大學學報, 2007, 27(8): 1180-1182.

[16] 李闊韜, 李順堂, 藍玲, 等. EGFR及其信號通路在神經病理性疼痛中的作用 [J]. 中國神經免疫學和神經病學雜志, 2020, 27(6): 474-479.

[17] 洪嘉琪, 史家欣, 敖歡, 等. 芍藥苷通過抑制脊髓Akt-NF-kB信號通路及小膠質細胞激活緩解炎癥性疼痛 [J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2018, 34(3): 325-333.

[18] 蘭雨, 楊曉. TGF-β信號在造血發(fā)育中的作用 [J]. 中國實驗血液學雜志, 2006, 14(6): 1253-1257.

[19] 吳藝舟, 林子晨, 孫杰. 基于腫瘤壞死因子TNF-α的癌癥疼痛機制及臨床治療策略 [J]. 醫(yī)學理論與實踐, 2018, 31(18): 2716-2719.

[20] Yang R N, Li Z J, Zou Y T,. Gallic acid alleviates neuropathic pain behaviors in rats by inhibiting P2X7 receptor-mediated NF-κB/STAT3 signaling pathway [J]., 2021, 12: 680139.

[21] 鄭雪花, 楊君, 楊躍輝. 沒食子酸藥理作用的研究進展 [J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2017, 37(1): 94-98, 102.

[22] 鄭舟琴, 杜宏. 大黃酸藥理作用的新進展 [J]. 重慶醫(yī)學, 2019, 48(22): 3897-3901.

[23] Zhou Y Y, Gao C F, Vong C T,.Rhein regulates redox-mediated activation of NLRP3 inflammasomes in intestinal inflammation through macrophage-activated crosstalk [J]., 2022, 179(9): 1978-1997.

[24] Chen P, Lin D S, Wang C,. Proteomic analysis of emodin treatment in neuropathic pain reveals dysfunction of the calcium signaling pathway [J]., 2021, 14: 613-622.

[25] 陳鵬, 王琛, 羅瑞熙, 等. 大黃素通過調節(jié)血清代謝改善神經病理性疼痛的機制研究 [J]. 中國中藥雜志, 2022, 47(8): 2187-2194.

[26] 王瑞婕, 楊勇, 白婷. 大黃素甲醚對酒精性肝損傷中SIRT1-AMPK通路的影響 [J]. 中國藥理學通報, 2020, 36(11): 1557-1562.

[27] Liu B B, Luo M, Meng D Y,. Tetrahydropalmatine exerts analgesic effects by promoting apoptosis and inhibiting the activation of glial cells in rats with inflammatory pain [J]., 2021, 17: 174480692110421.

[28] 王安鑄, 馬曉昌. 延胡索乙素的研究進展 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2020, 35(4): 1927-1929.

Quantitative analysis and mechanism research of five pharmacodynamic components in Fufang Shangtong Capsule based on liquid mass spectrometry combined with network pharmacology

GAO Jian-lian1, ZHOU Lin2, WANG Xiao-hui2, NIE Xing-guo3, ZHU Chao-nan1

1. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, China 2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China 3. Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui 453100, China

To accurately quantify the five pharmacodynamic components in Fufang Shangtong Capsule (復方傷痛膠囊, FSC), improve drug quality standards, and analyze the important role of pharmacodynamic components in drug therapy.An Acquity UPLC?BEH C18column (50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) was used to separate the components. Acetonitrile-0.1% formic acid water was used as mobile phase gradient elution. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS and Full Mass/dd MS2 model were used for rapid and accurate content determination of key ingredients in the drug. Key components-important target network was constructed based on network pharmacology, and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) and gene ontology (GO) analysis was further conducted to find key signaling pathways and action targets.The analytical methodology established in this study was robust and could meet the standard requirements of analysis. All the five pharmacodynamic components had good linearity in the range of mass concentration,≥ 0.999 0. Network pharmacology results showed that the pharmacodynamic components in drugs may be key targets of inflammation and vascular factors such as matrix metallo protein 9 (MMP9), prostaglandin endoperoxide synthase 2 (PTGS2), MMP2, interleukin-2 (IL-2), epidermal growth factor receptor (EGFR). As a result, it maps to nuclear factor-κB (NF-κB), transforming growth factor-β (TGF-β), tumor necrosis factor (TNF) signaling pathway inflammatory pathways, which has important reference value in drug quality and efficacy. The experimental results showed that gallic acid could significantly reduce the level of IL-2 in LPS induced RAW264.7 cells, emodin could significantly reduce the level of PTGS2 in cells, rhein could significantly reduce the level of MMP9 in cells, emodin methyl ether could significantly reduce the level of EGFR in cells, and fumarine ethyl rhizoma could significantly reduce the level of MMP2 in cells.This study provides an important reference for the quality improvement of FSC, and also provides a reference for the study of relevant TCM pharmacodynamic components.

network pharmacology; Fufang Shangtong Capsule; gallic acid; emodin; rhein; emodin methyl ether; tetrahydropalmatine; matrix metallo protein 9; prostaglandin endoperoxide synthase 2; interleukin-2; epidermal growth factor receptor; nuclear factor-κB; transforming growth factor-β; tumor necrosis factor

R283.6

A

0253 - 2670(2023)06 - 1793 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.011

2022-08-06

北京醫(yī)衛(wèi)健康公益基金會（TM19004）；河南省醫(yī)學攻關計劃（LHGJ20200524）；河南省科技攻關計劃（21210231107）

高漸聯，男，主管藥師，研究方向為臨床藥學、藥物分析。E-mail: gaolian2007@163.com

周 霖，男，主管藥師，研究方向為藥物分析、中藥藥理學。E-mail: 524734490@qq.com

王肖輝，女，主治醫(yī)師，研究方向為藥理學。E-mail: xhhyykl@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]