李鵬飛，黃朝康，楊小林, 4，牛騰飛, 4，陳軍峰, 4，趙淑娟, 3, 4，王崢濤, 3, 4，王如鋒, 3, 4*

? 藥材與資源 ?

竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆及生物信息學分析

李鵬飛1, 2，黃朝康1, 2，楊小林1, 2, 4，牛騰飛1, 2, 4，陳軍峰1, 2, 4，趙淑娟1, 2, 3, 4，王崢濤1, 2, 3, 4，王如鋒1, 2, 3, 4*

1. 上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，上海 201203 2. 上海中醫(yī)藥大學 中藥新資源與品質評價國家中醫(yī)藥管理局重點研究室，上海 201203 3. 上海中藥標準化研究中心，上海 201203 4. 上海中醫(yī)藥大學 中藥標準化教育部重點實驗室，上海 201203

克隆竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因（squalene epoxidase，）的全長cDNA序列，進行生物信息學分析和原核表達。設計特異性引物，從竹節(jié)參中克隆得到序列；以基因序列作為輸入數(shù)據(jù)，利用多序列同源比對等生物信息學分析工具進行序列分析；構建重組原核表達載體pCold-，轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中進行蛋白誘導表達；采用實時熒光定量PCR技術分析該基因在竹節(jié)參不同組織中的相對表達量。基因開放閱讀框長度為1884 bp，編碼627個氨基酸，PjSE蛋白相對分子質量為68 639.49，初步預測其具有跨膜結構域，可能定位在葉綠體上；聚丙烯凝膠電泳結果顯示誘導表達蛋白的相對分子質量大小與預期結果一致；該基因在竹節(jié)參葉中表達量最高，須根次之，根中表達量最低。基因的克隆、生信分析及原核表達研究，不僅有助于豐富竹節(jié)參中該類功能蛋白的種類和數(shù)量，完善竹節(jié)參皂苷類成分的生物合成途徑，也為后期開展竹節(jié)參皂苷的異源合成提供了可供選擇的關鍵基因元件。

竹節(jié)參；鯊烯環(huán)氧酶；基因克??；生物信息學分析；原核表達

竹節(jié)參是五加科植物C. A. Mey. 的干燥根莖[1]，藥用記載最早出現(xiàn)于清代《本草綱目拾遺》[2]。竹節(jié)參具有滋補強壯、散瘀止痛、止血祛痰等傳統(tǒng)功效，被土家族和苗族等少數(shù)民族聚集區(qū)美譽為“草藥之王”，常用作人參和三七的替代品[3]。竹節(jié)參與同科植物人參、西洋參、三七相似，三萜皂苷類成分（以下統(tǒng)稱為“人參皂苷”）是其主要的藥效成分。研究表明，人參皂苷具有顯著的抗炎、抗肥胖、抗衰老、免疫調節(jié)和降血糖等藥理作用[4]，已廣泛應用于臨床研究與藥物開發(fā)。

隨著近年來對三七、人參、西洋參、竹節(jié)參等藥用植物三萜代謝途徑探究的不斷深入[5-6]，已基本闡明三萜皂苷的生物合成途徑。三萜皂苷苷元母核是由法尼基焦磷酸（farnesyl-pyrophosphate，F(xiàn)PP）在鯊烯合成酶（squalene synthase，SQS）和鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）的逐步催化下環(huán)合而成[7]。鯊烯環(huán)氧酶是三萜皂苷生物合成途徑中的限速酶之一。大量研究表明，SE的催化活性和表達量與藥用植物三萜類活性成分的產(chǎn)量直接相關[8]。近年來已經(jīng)從人參、西洋參、三七等藥用植物中成功克隆得到多條基因，并開展了較為深入的研究[9]，但有關竹節(jié)參SE的研究報道尚少。

本研究利用分子克隆技術獲得了竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶候選基因（squalene epoxidase，），對其序列進行了生物信息學分析，構建了重組原核表達載體并在大腸桿菌中實現(xiàn)了異源表達，同時考察了在不同組織中的相對表達量。該研究為后續(xù)開展以三萜皂苷類活性成分為導向的竹節(jié)參藥用植物生源合成途徑解析、分子調控及異源合成奠定了相關基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

新鮮竹節(jié)參樣品采自湖北恩施（30°02′45″N，109°50′13″E），經(jīng)上海中醫(yī)藥大學王崢濤教授鑒定為五加科植物竹節(jié)參C. A. Mey.。標本保存于上海中醫(yī)藥大學中藥新資源與品質評價國家中醫(yī)藥管理局重點研究室。

1.2 試劑

Takara Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq DNA Polymerase、Prime STAR Max DNA Polymerase、T4連接酶購自TaKaRa公司，限制性核酸內切酶購于賽默飛世爾科技公司，凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1 總RNA提取及cDNA合成

取約50 mg竹節(jié)參根，在液氮中將其研磨粉碎，轉移至1.5 mL離心管中，利用RNA提取試劑盒提取竹節(jié)參根總RNA，用超微量紫外分光光度計檢測其濃度。利用反轉錄試劑盒將所提取的竹節(jié)參總RNA反轉錄成cDNA，測定濃度，?80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PjSE基因克隆及重組質粒構建

根據(jù)實驗室前期獲得的基因序列，選擇HI和I作酶切位點，設計基因特異性引物（上游引物：-F：5′-CGCGGATCCATGTTG- TTGGGCTTGGGCGTAAGAT-3′：下游引物：-R：5′-CCGCTCGAGTCAGAATTTGATGTC- ATCTGCAGGA-3′）。以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為：ddH2O 8.5 μL，上下游引物各0.5 μL（工作濃度10 μmol/L），cDNA模板0.5 μL，PrimeSTAR Max DNA Polymerase 10 μL；擴增程序為：98 ℃預變性3 min；再進行32個循環(huán)：98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步判斷目的基因條帶，利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，經(jīng)超微量紫外分光光度計檢測其濃度和260/280值后，利用限制性核酸內切酶HI和I將目的片段連接至pCold表達載體，轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行PCR驗證和雙酶切鑒定，重組質粒送基因公司測序。

2.3 PjSE基因的生物信息學分析

以基因核酸序列作為輸入數(shù)據(jù)，利用開放閱讀框（open reading frame，ORF） Finder查找ORF；利用ExPASy、NPS、PDBsum、Swiss-Model、TMHMM等在線工具預測基因編碼蛋白的相對分子質量、氨基酸序列、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、卷曲螺旋等理化性質，并對蛋白質二級、三級結構、磷酸化和-糖基化位點以及跨膜結構域等性質進行預測分析；同時運用ClustalW軟件結合ESPript 3.x在線網(wǎng)站將氨基酸序列與已鑒定功能的SE氨基酸序列進行比對，利用MEGA7.0軟件構建分子進化樹。

2.4 PjSE基因的原核表達

挑選測序結果正確的菌株，轉接至LB液體培養(yǎng)基（含終質量濃度50 mg/mL氨芐霉素）中，在37 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)至6000.6～0.8；加入終濃度為0.25 mmol/L的IPTG，在16 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)20 h，誘導產(chǎn)生PjSE重組蛋白。8000 r/min離心10 min收集菌體，將菌體懸浮于緩沖液（Tris-HCl，pH 7.4）中，采用超高壓連續(xù)流細胞破碎儀破碎。細胞破碎液于4 ℃、13 000 r/min離心30 min，含有可溶性蛋白的上清液轉移至潔凈離心管中；取一定量緩沖液重懸沉淀，12 000 r/min離心5 min后，去除上清液，再次加入一定量緩沖液重懸沉淀。分別取10 μL上清液和沉淀重懸液裝于PCR小管中，各加入2 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸3 min，制得蛋白電泳樣品。采用SDS-PAGE方法檢測蛋白表達情況。

2.5 PjSE基因的組織特異性表達水平分析

利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測基因在竹節(jié)參根、葉、須根中的相對表達量。選用竹節(jié)參基因作為內參基因，運用Primer Premier 5.0軟件設計引物（基因上游引物：5′-CTCTTTCCATCCCACCTTTCT-3′；下游引物：5′-ATCTTGCTGTTGCTGCCTTTT-3′，基因實時熒光定量PCR上游引物：5′-GGCATCAC- ACTTTCTACAACG-3′；下游引物：5′-GGCAGG- AACATTAAAGGTTTC-3′）。提取竹節(jié)參根、葉、須根中的總RNA，反轉錄合成cDNA，備用，應用實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增。反應中體系（10 μL）：TB Green Premix Ex Taq II（2×）5 μL、ROX Reference Dye（50×）0.2 μL、基因上游引物0.2 μL、基因下游引物0.2 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3.4 μL。PCR程序：95 ℃、30 s，95 ℃、5s，60 ℃、30 s，40次循環(huán)，設置3個重復組別，繪制標準曲線來確定反應性能，運用2?ΔΔCt法來分析基因在不同組織中的相對表達量。

3 結果與分析

3.1 PjSE基因克隆與核苷酸序列分析

以反轉錄得到的竹節(jié)參cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴增得到目的片段，電泳條帶約為1 884 bp，與目的基因長度相符（圖1）。利用ORF Finder對基因cDNA序列進行分析，基因開放閱讀框為1 884 bp，編碼627個氨基酸。對PjSE蛋白序列在NCBI上進行序列比對，結果顯示基因與東方苔草同源相似性為79.92%，與獼猴桃同源相似性為79.8%，與河岸葡萄同源相似性為75.61%。比對結果表明所得基因屬于SE家族。

M-Marker 1-PjSE基因全長

3.2 PjSE基因編碼蛋白理化性質分析

利用在線軟件ExPASy對基因進行理化性質分析，結果顯示PjSE相對分子質量為68 639.49，理論等電點為9.20，氨基酸殘基中帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為52，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為68。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為41.85，可初步判定為不穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為92.57，親水性總平均值為?0.068，疏水氨基酸的數(shù)量多于親水氨基酸的數(shù)量，可初步推斷其為疏水蛋白（圖2）。

3.3 PjSE蛋白結構功能域和跨膜結構域預測

Conserved domains在線工具分析表明，PjSE在保守區(qū)含有1個PLN02985超家族保守結構域，屬于SE超家族，推測具有催化鯊烯形成2,3-氧化鯊烯的功能（圖3-A）。HMHMM在線工具預測蛋白跨膜結構結果顯示，PjSE含有顯著的跨膜螺旋區(qū)，屬于跨膜蛋白（圖3-B）。

圖2 PjSE氨基酸序列的親水/疏水性質

3.4 PjSE蛋白信號肽分析及亞細胞定位預測

SinalP5.0預測分析PjSE信號肽結果顯示，預測存在信號肽的概率僅為0.07%，PjSE不存在信號肽，屬于非分泌蛋白，推測該蛋白合成后不發(fā)生轉運（圖3-C）。Plant-mPLoc亞細胞定位預測結果表明，該蛋白可能定位于葉綠體上。

3.5 氨基酸翻譯后磷酸化和糖基化修飾

利用在線工具NetPhos 3.1預測竹節(jié)參基因編碼蛋白中3類氨基酸（Ser、Thr、Tyr）磷酸化位點，結果顯示PjSE蛋白中存在62個潛在的氨基酸磷酸化位點（4個酪氨酸磷酸化位點，32個可能的絲氨酸磷酸化位點，26個可能的蘇氨酸磷酸化位點），潛在的磷酸化位點在酶發(fā)揮功能過程中或可起到重要作用。通過NetNGlyc-1.0預測，處于47、55、118和289位的天冬氨酸可能需要進行-糖基化修飾。

圖3 PjSE的結構功能域(A)與跨膜結構域(B) 以及信號肽預測(C)

3.6 PjSE蛋白二級和三級結構分析

如圖4所示，PjSE蛋白的二級結構元件中無規(guī)卷曲所占的比例最高，有254個氨基酸，占40.51%；α-螺旋包含218個氨基酸，占34.77%；延伸鏈占據(jù)114個氨基酸，為18.18%；β折疊所占比對最低，為6.54%，包含41個氨基酸（圖4-A）。

利用SWISS-MODEL在線工具結合PyMOL軟件預測得到PjSE蛋白的三維空間模型及活性中心（紅色球形結構示意酶的活性中心氨基酸），以人的SE（Human squalene epoxidase，PDB：6c6n.1.A）作為同源模板，氨基酸相似性為47.77%，全球性模型質量評分為0.6（圖4-B、4-C）。

利用autodock 4.2.6對PjSE與其主要底物角鯊烯進行分子對接模擬實驗。如圖4-D和圖4-E顯示，鯊烯與PjSE中的Asp216、Glu220殘基通過氫鍵連接，且氫鍵鍵程均在0.22 mm以內，推測這2個氨基酸可能為PjSE蛋白識別底物小分子并結合的關鍵氨基酸殘基。

3.7 PjSE的氨基酸序列同源比對和系統(tǒng)進化樹構建

ESpript 3.0在線工具序列同源比對顯示，PjSE氨基酸序列與來源于五加科植物的人參SE（BAD15330.1）、三七SE（ABE73759.1）、西洋參SE（AGK62448.1）的同源性分別為57.04%、56.23%、56.32%；與黃芪SE（AKO83630.1）的同源性為58.76%。圖5所示，與其他植物中的SE一樣，PjSE也具有保守的NAD（P）結合結構域和底物結合結構域。為預測竹節(jié)參SE蛋白的進化關系，在NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇了來源于不同植物的SE的序列，利用MEGA 7.0軟件在bootstrap重復次數(shù)為1000次的參數(shù)下構建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹，結果表明竹節(jié)參PjSE和煙草SE蛋白序列關系更為親近（圖6）。

圖4 PjSE的二級結構(A)、三級結構(B，C) 和角鯊烯與PjSE分子對接結果(D，E)

圖5 竹節(jié)參、黃芪、西洋參、楤木、人參和三七SEs氨基酸序列同源性比對

圖6 PjSE的系統(tǒng)進化樹

3.8 PjSE基因的異源表達

重組菌株表達后收集菌體并進行破碎裂解，取上清液和沉淀重懸液進行SDS-PAGE電泳，結果（圖7）顯示，經(jīng)IPTG誘導后的重組表達菌株上清液中出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶，表明蛋白原核表達成功，且為可溶性蛋白。

M-Marker 1-PjSE上清液 2-PjSE沉淀 3-空載pCold

3.9 竹節(jié)參不同部位的PjSE基因表達差異分析

運用qRT-PCR檢測竹節(jié)參根、葉、須根的基因表達差異。結果顯示，基因在竹節(jié)參各個組織中均有表達，基因在葉中表達量最高，須根中其次，在根中的表達量最低（圖8）。

4 討論

竹節(jié)參中主要藥效成分為人參皂苷類成分，該成分主要是通過相關酶對前體物質2,3-氧化鯊烯進行環(huán)化、羥基化和糖基化等催化反應而最終合成[11-12]。SE處于人參皂苷生物合成途徑的關鍵節(jié)點，SE催化生成的2,3-環(huán)氧鯊烯是合成人參皂苷的重要底物，因此在人參皂苷合成途徑中發(fā)揮重要作用。目前已經(jīng)從人參、三七等多種藥用植物中成功克隆出基因的cDNA序列，并對其調控機制做了大量研究[13]。的表達和皂苷含量直接相關，Choi等[14]在對人參基因組的研究中揭示了鯊烯環(huán)氧酶基因的表達量與人參皂苷產(chǎn)量直接相關；Xu等[15]和Han等[16]分別利用化學分離和RNA干擾技術抑制了SE的轉錄、表達后，證實基因在一定程度上調控了人參皂苷的生物合成。上述研究證實鯊烯環(huán)氧酶在皂苷生物合成途徑中占據(jù)十分重要的地位。

圖8 PjSE在竹節(jié)參不同組織中的相對表達水平

目前，有關竹節(jié)參中基因報道甚少，仍有待進一步拓展挖掘。本研究通過對竹節(jié)參基因的克隆及生物信息學分析，挖掘得到一個未經(jīng)報道的基因，PjSE蛋白具有SE所特有的保守結構域結合位點，可與多種酶結合反應，證實PjSE屬于SEs家族[17-18]。序列分析發(fā)現(xiàn)PjSE與其他物種的基因具有較高的相似性，相似度均在50%以上，其中與煙草的親緣關系最高。本研究進一步豐富了藥用植物竹節(jié)參的基因庫，也為竹節(jié)參中人參皂苷類成分的生物合成途徑解析提供了一定參考。同時本研究還探討了該基因的原核異源表達體系，構建了重組質粒pCold-PjSE，在大腸桿菌BL21（DE3）中存在可溶性蛋白表達，這為進一步研究基因的分子機制和蛋白功能驗證奠定基礎。此外，在擬南芥等多種植物中SE的功能研究均采用了酵母系統(tǒng)[19]，后續(xù)亦可嘗試在酵母或植物體內驗證PjSE的功能。

近年來，研究人員已經(jīng)從三七、滇重樓、遠志、雷公藤等藥用植物中利用qRT-PCR技術證實了SE基因在不同器官中具有不同表達模式[20]。基于以上研究，本實驗選取竹節(jié)參根、葉和須根3個不同組織作為研究對象，探究了基因的組織特異性表達情況，實驗發(fā)現(xiàn)基因在葉中表達量最高，不同組織中表達量存在較明顯的差異，這為后續(xù)考察基因空間表達情況與對應次生代謝產(chǎn)物含量之間的相關關系研究奠定了一定基礎，為深入揭示竹節(jié)參藥用植物中SE在三萜皂苷生物合成途徑中的時空分布規(guī)律與關鍵作用機制提供有利線索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning and bioinformatics analysis offrom

LI Peng-fei1, 2, HUANG Chao-kang1, 2, YANG Xiao-lin1, 2, 4, Niu Teng-fei1, 2, 4,CHEN Jun-feng1, 2, 4, ZHAO Shu-juan1, 2, 3, 4, WANG Zheng-tao1, 2, 3, 4, WANG Ru-feng1, 2, 3, 4

1. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. The NATCM Key Laboratory for New Resources & Quality Evaluation of Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 3. Shanghai R&D Center for Standardization of Traditional Chinese Medicines, Shanghai 201203, China 4. The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Shanghai 201203, China

To clone the full-length cDNA sequence (squalene epoxidase,) of Zhujieshen (), and perform bioinformatics analysis and prokaryotic expression.Specific primers were designed to clone the cDNA sequence offromUsing thegene sequence as input data, sequence analysis was performed using bioinformatics analysis tools such as multiple sequence homology alignment. The prokaryotic expression vector of pCold-was constructed and transformed inBL21 (DE3) competent cells to express recombinant protein. The relative expression ofin different tissues ofwere further determined by quantitative real-time PCR (qRT-PCR).The open reading frame ofwas 1884 bp, encoding 627 amino acids. The relative molecular mass of PjSE was 68639.49. PjSE was predicted to have a transmembrane domain that was most likely to be located in chloroplast. SDS-PAGE showed the relative molecular mass of induced expression protein was consistent with expected protein size. Furthermore, the expression level ofwas completely different in various parts of. The associated results were as follows: the highest in leaves, the second in fibrous root, and the lowest in root.The cloning, bioinformatics analysis and prokaryotic expression ofwill be helpful to enrich the variety and quantity of related functional proteins from, supplement to the biosynthetic pathways of chikusetsusaponins, and provide useful functional gene modules for heterologous biosynthesis in the future.

C. A. Mey.; squalene epoxidase; gene cloning; bioinformatics analysis; prokaryotic expression

R286.12

A

0253 - 2670(2023)06 - 1917 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.024

2022-08-09

上海市自然科學基金項目（20ZR1458200）；上海市“科技創(chuàng)新行動計劃”啟明星項目（20QA1408800）；上海中醫(yī)藥大學預算內項目（2020LK015）

李鵬飛，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物生物合成與轉化研究。Tel: 18817338926 E-mail: 13984532089@163.com

王如鋒，副研究員，主要從事中藥資源與生物技術研究。Tel: (021)51322495 E-mail: wrffrw0801@163.com

[責任編輯 時圣明]