文俊仁，盧靜靜，文 靜，孫煒煒

（1. 武漢設(shè)計工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205；2. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北武漢 430050）

0 引言

美拉德反應(yīng)是一種自然發(fā)生于食品加工和儲存過程中的非酶促褐變反應(yīng)，是食品香味和色澤產(chǎn)生的方式之一，該反應(yīng)可以使食物得到誘人的色澤、濃郁的芳香和特有的滋味。美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的還原酮、類黑精等雜環(huán)化合物會影響食品的顏色、風(fēng)味及營養(yǎng)價值[1]，研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard Reaction Products，MRPs） 還具有抗氧化性、抑菌性等生物活性[2]，同時還能夠延緩機體衰老、幫助清除自由基、抑制癌細(xì)胞增殖[3]，對于人體健康和防治疾病有重要意義，可作為新型天然抗氧化劑取代化學(xué)合成類抗氧化劑應(yīng)用于食品中，防止食物變質(zhì)。

殼寡糖是一種含有游離氨基的堿性多糖，天然無毒副作用，有良好的溶解性、抗氧化性和抗菌活性，還可以降低人體血脂水平，增強免疫力[4-5]；分子中存在大量活性基團(tuán)，不僅可以和蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，也可以與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，優(yōu)化其生物活性，在食品藥品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，以賴氨酸和殼寡糖為原料制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，探究反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH 值和賴氨酸與殼寡糖摩爾質(zhì)量比等反應(yīng)條件對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度和抗氧化性的影響，并對優(yōu)化產(chǎn)物的抑菌性進(jìn)行研究，旨在為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在食品防腐劑中的應(yīng)用提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼寡糖，山東奧康生物科技有限公司提供；賴氨酸，南京都萊生物技術(shù)有限公司提供；冰乙酸、無水醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、硫酸、TPTZ 等，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

722 型紫外可見分光光度計，天津冠澤科技有限公司產(chǎn)品；AL104 型分析天平，梅特勒—托利多儀器（上海） 有限公司產(chǎn)品；LX-B75L 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，成都宜恒實驗儀器有限公司產(chǎn)品；HHS2 型恒溫水浴鍋，鄭州市亞榮儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

（1） 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度和抗氧化性的影響。將賴氨酸與殼寡糖以摩爾質(zhì)量比1∶1稱取，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL，用緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值為8，取10 mL 反應(yīng)液置于試管中，分別于80，90，100，110，120 ℃條件下恒溫反應(yīng)90 min，考查反應(yīng)溫度對美拉德產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響。

（2） 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度和抗氧化性的影響。將賴氨酸與殼寡糖以摩爾質(zhì)量比1∶1稱取，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL，用緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值為8，取10 mL 反應(yīng)液到試管中，于100 ℃下分別反應(yīng)30，60，90，120，150 min，考查反應(yīng)時間對美拉德產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響。

（3） 反應(yīng)pH 值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度和抗氧化性的影響。將賴氨酸與殼寡糖以摩爾質(zhì)量比1∶1稱取，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL，用緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值分別為6，7，8，9，10，取10 mL反應(yīng)液置于試管中，于100 ℃下反應(yīng)120 min，考查反應(yīng)pH 值對美拉德產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響。

（4） 賴氨酸與殼寡糖摩爾質(zhì)量比對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度和抗氧化性的影響。將賴氨酸與殼寡糖分別以摩爾質(zhì)量比2.0∶1.0，1.5∶1.0，1.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0 稱取適量，用蒸餾水溶解后，定容至100 mL，用緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值為8，取10 mL 反應(yīng)液到試管中，在100 ℃下反應(yīng)120 min，考查反應(yīng)物質(zhì)量比對美拉德產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響。

1.3.2 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，探討不同反應(yīng)條件對賴氨酸-殼寡糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性的影響，并篩選出最佳反應(yīng)條件。

1.3.3 FRAP 測定

參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行測定。

1.3.4 褐變程度

將反應(yīng)得到的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物于波長420 nm 處測定吸光度，吸光度越大表示美拉德反應(yīng)褐變程度越深。

1.3.5 抑菌性

將制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋，得到不同濃度的稀釋液。采用牛津杯法通過測定抑菌圈大小，研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 賴氨酸與殼寡糖美拉德反應(yīng)條件對抗氧化性的影響

2.1.1 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)的影響

反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響見圖1。

圖1 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響

由圖1 可知，隨著反應(yīng)溫度由80 ℃升高至110 ℃，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變吸光度由0.082 升至0.356，F(xiàn)RAP 值由2.22 升至3.38，溫度升高能夠提高美拉德反應(yīng)的速率，使體系快速生成大量的還原酮和類黑色素等化合物，使反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度加深，該類物質(zhì)具有還原力和金屬離子螯合力[7]，因此FRAP 值增大，抗氧化活性增強；繼續(xù)升高反應(yīng)溫度至130 ℃，產(chǎn)物的褐變程度及抗氧化活性均呈現(xiàn)下降趨勢，可能由于還原酮及類黑素等化合物在過高的溫度下會發(fā)生分解，造成抗氧化活性降低。因此，在110 ℃時制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，褐變程度和抗氧化活性最強。

2.1.2 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)的影響

反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響見圖2。

圖2 反應(yīng)時間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響

由圖2 可知，隨著反應(yīng)時間的延長，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變吸光度及抗氧化性均呈現(xiàn)先增加后減弱的趨勢，在反應(yīng)時間為120 min 時，褐變及抗氧化活性均達(dá)到最大值?？赡苡捎诜磻?yīng)時間延長，殼寡糖與賴氨酸經(jīng)脫氫、縮合、分子重排生成的還原酮及類黑素等化合物逐漸積累增多，產(chǎn)物褐變及抗氧化活性增強，高溫反應(yīng)時間太長，生成的化合物容易降解減少，造成抗氧化活性降低。因此，反應(yīng)時間為120 min 時，所得美拉德產(chǎn)物具有最強的抗氧化能力。

2.1.3 反應(yīng)pH 值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)的影響

反應(yīng)pH 值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)pH 值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響

由圖3 可知，隨著反應(yīng)pH 值的增大，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性呈先增大后減小的變化趨勢，當(dāng)反應(yīng)pH 值從6.0 上升至8.0 時，產(chǎn)物褐變吸光度由0.078 升至0.371，F(xiàn)RAP 值由2.16 升至3.25，褐變程度和抗氧化活性增強，這可能是由于美拉德反應(yīng)是一種堿催化反應(yīng)，反應(yīng)pH 值增大堿性增強，體系中游離氨基的濃度增大[8]，利于類黑素等化合物的生成，抗氧化活性增強；pH 值繼續(xù)增大至10，產(chǎn)物褐變程度和抗氧化活性減弱，可能由于賴氨酸等電點pI 為9.74，當(dāng)反應(yīng)pH 值大于pI 時，賴氨酸呈陰性，可通過遮蔽正電基團(tuán)間的相互作用減少氨基酸與多糖的相互作用[9]，生成的類黑素等化合物減少。因此，反應(yīng)pH 值為8.0 時，褐變程度和抗氧化活性均最大。

2.1.4 賴氨酸與殼寡糖摩爾比對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)的影響

反應(yīng)物摩爾質(zhì)量比對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)物摩爾質(zhì)量比對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度及抗氧化性的影響

由圖4 可知，當(dāng)增加反應(yīng)體系中殼寡糖含量時，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度及FRAP 值均增大；當(dāng)n賴氨酸∶n殼寡糖為1∶2 時，產(chǎn)物的FRAP 值最高，抗氧化活性最強，這可能是由于賴氨酸的自由氨基含量較高，當(dāng)殼寡糖含量較低時，較多的自由氨基處于游離狀態(tài)而不能發(fā)生反應(yīng)，適當(dāng)增加殼寡糖含量，游離羰基增多，更多的氨基參與美拉德反應(yīng)，生成較多的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，褐變程度增加。因此，賴氨酸與殼寡糖摩爾質(zhì)量比為1∶2 時，所得美拉德產(chǎn)物具有最強的抗氧化能力。

2.1.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果, 選擇反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH 值和賴氨酸與殼寡糖摩爾質(zhì)量比4 個因素的較優(yōu)水平，按L9（34）設(shè)計正交試驗。

正交試驗結(jié)果見表1。

表1 正交試驗結(jié)果

對以上正交試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，4 個反應(yīng)條件對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性影響的主次順序為B＞A＞C=D，即反應(yīng)溫度影響最大，其次為反應(yīng)時間，反應(yīng)pH 值和賴氨酸與殼寡糖質(zhì)量比對產(chǎn)物抗氧化性的影響較小。由表1 的值分析可知美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性最強的制備條件組合為A3B3C2D1，該組合為試驗9，因此無需驗證試驗，說明在A3B3C2D1條件下反應(yīng)得到的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性最強，即反應(yīng)時間150 min，反應(yīng)溫度120 ℃，反應(yīng)pH 值8，賴氨酸與殼寡糖質(zhì)量比= 1∶1，在此條件下反應(yīng)所得的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性最強，其FRAP 值為4.31。

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抑菌性研究

利用上述所得最優(yōu)反應(yīng)條件制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，利用牛津杯法通過測量抑菌圈直徑對其抑菌性進(jìn)行研究。

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋梯度對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑的影響見表2。

表2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋梯度對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑的影響/mm

由表2 可知，賴氨酸與殼寡糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑菌圈，同濃度下其對枯草芽孢桿菌的抑菌圈較大，金黃色葡萄球菌的抑菌圈次之，對大腸桿菌抑菌圈不明顯。3 種供試菌中，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，說明該美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對革蘭氏陽性菌有抑菌作用，對革蘭氏陰性菌基本無抑菌效果。隨著美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋倍數(shù)的增大，其對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力逐漸減弱。當(dāng)產(chǎn)物稀釋至10-4時，產(chǎn)生的抑菌圈直徑均小于抑菌性判斷標(biāo)準(zhǔn)的（7 mm），說明在此梯度下美拉德產(chǎn)物沒有抑菌性，故最小抑菌濃度為10-4。

3 結(jié)論

以賴氨酸和殼寡糖為原料制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，通過單因素試驗及正交試驗考查反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH 值和賴氨酸與殼寡糖摩爾質(zhì)量比等反應(yīng)條件對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變程度和抗氧化性的影響，得到美拉德反應(yīng)的最佳制備條件為反應(yīng)時間150 min，反應(yīng)溫度120 ℃，反應(yīng)pH 值8.0，n賴氨酸∶n殼寡糖=1∶1，在此條件下制備的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性最強，F(xiàn)RAP 值為4.31；該美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對大腸桿菌無抑菌作用，對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，且美拉德反應(yīng)產(chǎn)物溶液的最小抑菌濃度為10-4；說明賴氨酸和殼寡糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較好的抗氧化性，對革蘭氏陽性菌有一定的抑菌效果，為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在食品防腐劑中的應(yīng)用提供一定理論支持。