解迎雙，白興斌，寇宗紅，張 歡，王 波

（1. 蘭州海關技術中心，甘肅 蘭州 730010；2. 白銀市食品檢驗檢測中心，甘肅 蘭州 730999）

0 引言

我國人口眾多，畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)達，既是畜產(chǎn)品的消費大國也是畜產(chǎn)品的出口大國。獸藥在畜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中可謂居功甚偉，增加了養(yǎng)殖動物對各種疾病的抵抗力，減少了養(yǎng)殖動物的傷亡，提高了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。但近年來，獸藥也暴露出一些違用、濫用的問題。甲硝唑是最早在1962 年被發(fā)現(xiàn)的第一代硝基咪唑類藥物，屬人畜共用型藥物，在畜牧產(chǎn)業(yè)中，主要用于治療原蟲感染、厭氧菌感染等疾病[1]。恩諾沙星是一種常見的喹諾酮類抗生素，其抗菌活性較強。甲硝唑和恩諾沙星作為硝基咪唑類藥物和喹諾酮類藥物的典型性代表，廣泛應用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中[2-3]。近年來，由于濫用抗生素類藥物及違法使用的現(xiàn)象，導致含有抗生素殘留的肉類在加工進入人體內(nèi)，抗生素類藥物在體中積聚會引起中毒反應、血小板降低、溶血性貧血等各種不良反應，嚴重危害了人類身體健康[4-5]。許多發(fā)達國家和組織為了保證動物肉類的健康均先后制定頒布了關于肉類中抗生素的殘留限量的一系列標準。我國在標準《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量GB 31650—2019》中，明確了對豬肉中甲硝唑不得檢出，恩諾沙星可在限量范圍內(nèi)使用，其限量值為100 μg/kg。

國內(nèi)外關于豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的檢測方法，主要包括酶聯(lián)免疫法[6-7]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-9]，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]以及液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法[13-16]。其中，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法憑借超快速的掃描，精準的定量、定性等優(yōu)勢已成為豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的常用檢測方法。目前，關于豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的檢測難點主要有：①固相萃取的檢測步驟較為繁瑣，難以實現(xiàn)快速高通量的檢測。②QuEChERS[17]方法未實現(xiàn)自動化、凈化效果差、方法的靈敏度不足。試驗建立的Sin-QuEChERS 快速濾技術結(jié)合超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀對豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的測定的方法，Sin-QuEChERS 快速濾技術，是一種基于QuEChERS 法發(fā)展起來的一種凈化方法，可用以去除基質(zhì)樣品中的共提取物。該方法凈化材料除采用了QuEChERS 法的常用凈化材料N -丙基乙二胺和十八烷基硅烷鍵合硅膠外，還使用了多壁碳納米管。能夠有效提高填料的凈化速度。與傳統(tǒng)QuEChERS法相比，該方法無需吸附劑的稱量和提取液的轉(zhuǎn)移，萃取凈化一步完成，大大縮短了凈化時間，提高了前處理速率和效率。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 設備設施

ACQUITY UPLC I-Class 型高效液相色譜儀、Quattro Premier XE 型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀；BSA822 型電子天平；BCE224i-1CCN 型電子天平；BC-1000 型渦旋振蕩器；3K30 型低溫冷凍高速離心機；N-EVAP112 型氮吹儀；ZABN2000 型氮氣發(fā)生器；移液槍。

1.1.2 試劑耗材

甲硝唑標準品（98%）、恩諾沙星標準品（98%）迪馬科技提供；甲醇為色譜純、乙腈為色譜純、乙酸乙酯為色譜純、正己烷為色譜純、甲酸為色譜純，德國默克公司提供；無水硫酸鎂、氯化鈉，國藥提供；LM806-FC-724 型Sin-QuEChERS 快速濾過柱，北京綠綿提供；MCX 固相萃取柱，美國沃特世公司提供；石墨化碳黑、PSA，美國安捷倫公司提供；C18色譜柱，美國安捷倫公司提供；0.22 μm 微孔濾膜，天津艾杰爾公司提供；超純水由實驗室純水儀制備，其他試劑均為分析純。

1.1.3 樣品來源

豬肉樣品購自于大型超市。

1.2 標準溶液配制

（1） 單標準儲備溶液。質(zhì)量濃度100 mg/L，分別準確稱取恩諾沙星標準物質(zhì)0.010 2 g，甲硝唑標準物質(zhì)0.010 2 g，用甲醇定容至100 mL 容量瓶內(nèi)，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的單標準儲備溶液，置于-20 ℃冰箱中保存。

（2） 混合標準儲備溶液。質(zhì)量濃度1 000 μg/L，分別移取2 甲硝唑和恩諾沙星單標準儲備溶液1.00 mL，用甲醇定容至100 mL 容量瓶中，配置成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L 的混合標準儲備溶液。

（3） 混合標準工作溶液。質(zhì)量濃度100 μg/L，分別移取甲硝唑和恩諾沙星的混合標準儲備溶液1.00 mL，用甲醇定容至100 mL 容量瓶中，配置成質(zhì)量濃度為100 μg/L 的混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取粉碎后的豬肉樣品5.00 g（精確至±0.01 g）于50 mL 離心管中，加入5 mL 后水渦旋3 min，再加入質(zhì)量分數(shù)為1%乙酸的乙腈溶液（體積比）10 mL，渦旋3 min，于常溫超聲15 min。加入6 g無水硫酸鎂（預先烘干），1.5 g 氯化鈉（預先烘干）后立刻劇烈渦旋3 min，并以轉(zhuǎn)速13 000 r/min 離心5 min。取上清液置于帶有刻度的15 mL 離心管中，于45 ℃氮氣吹至1 mL，將濃縮液加載至LM806-FC-724 型Sin-QuEChERS 快速濾過凈化柱內(nèi)，在該柱下方，連接1 個0.22 μm 的有機相濾膜。下壓柱塞桿，使?jié)饪s液通過快速過濾柱和有機相濾膜后，收集于一進樣小瓶內(nèi)，供UPLC-MS/MS 測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

ZORBAXEclipsePlus C18色譜柱（100 mm，2.1 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積2 μL；流量0.3 mL/min；流動相A 為1%甲酸溶液，B 為乙腈。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

ESI 離子源；毛細管電壓4 000 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量10 L/min；霧化器壓力14 kPa；正離子源，多反應監(jiān)測（MRM） 模式。

質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

通過對質(zhì)量濃度為10 μg/L 的甲硝唑和恩諾沙星的混合標準溶液進行測定，對儀器工作條件進行優(yōu)化。選擇多反應監(jiān)測（MRM） 模式，采用1 個母離子和與之相對應的2 個子離子組成的離子對的方式，對恩諾沙星和甲硝唑進行了二次定性，增加了定性的準確性。以10 μg/L 單標準溶液分別重復進樣12次，按照國際對離子豐度比最大偏差允許值的范圍要求，計算甲硝唑和恩諾沙星的2 個定性離子之間的豐度比平均值作為該化合物的抗干擾指標。結(jié)果表明，甲硝唑和恩諾沙星的離子豐度比均在要求范圍內(nèi)。

甲硝唑和恩諾沙星總離子色譜圖見圖1，甲硝唑10 μg/L 與恩諾沙星10 μg/L 標準品色譜圖（MRM）見圖2。

圖1 甲硝唑和恩諾沙星總離子色譜圖

圖2 甲硝唑10 μg/L 與恩諾沙星10 μg/L 標準品色譜圖（MRM）

2.2 提取溶劑的選擇

分別以1%乙酸乙腈（體積比）、乙腈溶液、乙酸乙酯溶液作為提取溶劑提取樣品中的甲硝唑和恩諾沙星。試驗結(jié)果表明，乙酸乙酯作為提取溶劑時，對樣品中的脂肪和蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)有較大的溶解度，在后續(xù)的濃縮試驗過程中易產(chǎn)生油狀物，凈化過程中易造成快速濾過柱的堵塞且上機檢測過程中有較強的基質(zhì)效應。乙腈作為提取溶劑，在提取過程中對蛋白有較好的沉淀作用，可以部分去除肉類樣品中的蛋白質(zhì)，降低了基質(zhì)對恩諾沙星和甲硝唑的吸附并提高其回收率[18-20]，但采用乙腈作為提取溶劑時，甲硝唑的回收率較低為60%~80%。使用含1%乙酸的乙腈溶液為提取劑時，甲硝唑的回收率明顯提高，回收率可達96%以上。因此，選擇含1%乙酸的乙腈溶液作為豬肉中甲硝唑和恩諾殺星的提取溶劑。

2.3 凈化條件的選擇

分別選擇MCX 固相萃取柱、QuEChERS、Sin-QuEChERS 快速濾技術對其進行凈化處理。通過回收率、操作步驟的難易程度、試劑消耗量、操作速度等4 個因素對凈化方法進行評價。

凈化條件比對表見表3。

表3 凈化條件比對表

由表3 可知，3 種凈化方法的回收率均能達到方法學考查的要求，但是Sin-QuEChERS 快速濾技術操作步驟簡便、試劑消耗量小更適合于本實驗的要求。

2.4 標準曲線和檢出限

將混合標準儲備溶液（1.2 標準溶液配制） 逐級稀釋，配制恩諾沙星和甲硝唑的質(zhì)量濃度分別為0.50，1.00，10.00，100.00，200.00，500.00 μg/L 6個梯度濃度的混合標準工作溶液。將該標準溶液梯度系列按照1.4 中的儀器條件進行測定，以甲硝唑和恩諾沙星的質(zhì)量濃度作為曲線的橫坐標，以篩選出的甲硝唑和恩諾沙星的定量離子的峰面積作為曲線的縱坐標，分別繪制恩諾沙星和甲硝唑的標準曲線。

將混合標準溶液（1.2 標準溶液配制1 000 μg/L）稀釋至0.50，1.50，5.0 μg/L 質(zhì)量濃度后依次添加至豬肉樣品中，按照1.3-1.4 的試驗方法進行檢測后，以3 倍信噪比（3 S/N） 計算檢出限。

線性參數(shù)和檢出限見表4。

表4 線性參數(shù)和檢出限

由表4 可知，甲硝唑和恩諾沙星的線性范圍較寬，檢出限滿足測定要求。

2.5 精密度試驗

精密度用以表示測定方法的再現(xiàn)性，以保證測定結(jié)果準確[21-23]。按照1.3-1.4 的試驗方法對同一樣品進行測定（n=7）。

精密度試驗結(jié)果（n=7） 見表5。

表5 精密度試驗結(jié)果（n=7）

由表5 可知，甲硝唑和恩諾沙星測定值的RSD為3.1%~3.6%，說明該方法在對甲硝唑和恩諾沙星進行檢測時的精密度較好，符合方法學要求。

2.6 回收試驗

按照（1.3-1.4） 試驗方法對空白豬肉樣品進行加標回收試驗，加標的質(zhì)量濃度為2.00，6.00，20.0 μg/L，每個濃度值平均測定6 次，以6 次平均值計算回收率。

回收試驗結(jié)果見表6。

表6 回收試驗結(jié)果

由表6 可知，甲硝唑和恩諾沙星的回收率為96.0%~107%，可滿足該方法對豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的檢測要求。

2.7 實際樣品分析

對蘭州市的8 家大型超市中所售的豬肉樣品采用試驗優(yōu)選的方法，分別抽取20 批次進行測定，結(jié)果表明，甲硝唑和恩諾沙星化合物均未檢出。

3 結(jié)論

針對豬肉樣品基質(zhì)復雜的特點，采用1%乙酸乙腈直接提取，經(jīng)快速濾過柱凈化，結(jié)合UPLCMS/MS，建立了豬肉中甲硝唑和恩諾沙星的快速定性定量分析的方法，并運用所建立的方法檢測20 批次豬肉樣品。與傳統(tǒng)的樣品預處理方法相比較，該方法具有操作簡單、快速高效、數(shù)據(jù)準確的優(yōu)點，為日常大量茶葉樣品中獸藥殘留的快速篩查提供了一條新的途徑。