黃桂珍 汪慶祥 陳金美 詹峰萍 魏 嵐 鄭婉榕

(1.閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 龍巖 364021；2.閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，福建 漳州 363000)

靈芝是一種具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、防艾滋病病毒、抗氧化、延緩衰老等多種作用的藥用真菌[1-3]，其藥理作用主要歸因于靈芝中含有的多種三萜類化學(xué)成分和多糖等。靈芝酸A(GAA)作為靈芝的主要活性成分之一，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤、護(hù)肝及抗癌作用[4]，GAA含量直接影響靈芝的藥用價值，因此建立一種簡單、快速的GAA分析方法對評價靈芝品質(zhì)具有重要意義。

目前，GAA的檢測方法有分光光度法[5-7]、離子色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]等。但上述方法存在操作繁瑣、成本高昂及分析時間長等問題。相比之下，分子印跡聚合物(MIP)基傳感技術(shù)具有選擇性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、對環(huán)境的耐受性好和制備簡單、造價低廉等優(yōu)點。與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合得到分子印跡電化學(xué)傳感器不僅操作簡單、成本低廉、選擇性較好，而且能獲得高的靈敏度[13-15]。MIP基電化學(xué)傳感器目前已被廣泛用于藥物分子[16]、環(huán)境污染物[17]、生物分子[18]的檢測。然而，截至目前，關(guān)于GAA的分子印跡電化學(xué)傳感器的研究尚未見報道。鄰苯二胺(OPD)易發(fā)生聚合反應(yīng)，適用于一步電合成聚鄰苯二胺超薄膜，并且在不添加交聯(lián)劑和致孔劑的情況下即可與模板分子產(chǎn)生作用，是電化學(xué)傳感器中實現(xiàn)非共價分子印跡最常用的單體之一，且具有選擇性高和響應(yīng)時間短的特點[19-21]。

研究擬以O(shè)PD作為功能單體，采用一步電化學(xué)聚合法在玻碳電極表面制備一層能特異性識別GAA的MIP膜，用于GAA的快速、靈敏檢測，為靈芝粉浸出液中GAA檢測及靈芝粉品質(zhì)評價提供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OPD和GAA：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

木犀草素：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

綠原酸、鹽酸多巴胺、冰醋酸和醋酸鈉：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

試驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

掃描電子顯微鏡(SEM)：S-4800型，日本Hitachi公司；

電化學(xué)工作站：CHI-650D型，上海辰華儀器有限公司；

超聲波清洗器：KQ52200E型，上海超聲儀器有限公司；

電子天平：AL224CN型，奧豪斯儀器有限公司；

恒溫培養(yǎng)搖床：20140639型，上海蘇坤實業(yè)有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)：NICOLETiS10型，美國賽默飛世爾科技公司；

三電極系統(tǒng)：玻碳電極(GCE，直徑3 mm)為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑柱電極為對電極，上海辰華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 前驅(qū)溶液的制備 稱取1.0 mg(0.2 mmol)GAA和1.3 mg(1.2 mmol)OPD，加入到2 mL HAc-NaAc(pH 5.2)緩沖液中，配制成含有0.1 mmol/L GAA和0.6 mmol/L OPD的混合溶液。攪拌2 min后得到均勻溶液后，將混合溶液超聲反應(yīng)1 h，隨后通入氮氣10 min以除去溶液中的氧氣，得到MIP電聚合制備前驅(qū)液，密封備用。上述過程中不加入GAA模板分子，得到非印跡聚合物(NIP)制備前驅(qū)液，用于對照試驗。

1.3.2 MIP/GCE的電化學(xué)制備 首先，將玻碳電極(GCE)依次在0.05 μm和0.3 μm Al2O3粉漿中打磨，再用去離子水沖洗電極表面吸附的Al2O3顆粒，隨后置于超純水中超聲5 min除去電極表面雜質(zhì)，通氮氣吹干，得到干凈的基底GCE。將GCE置于MIP前驅(qū)液中，采用循環(huán)伏安法(CV)在0～0.8 V電位范圍內(nèi)掃描30圈。隨后，將其轉(zhuǎn)移到0.1 mol/L NaOH中，在-1～1 V電位窗口條件下掃描50圈，將電極上的模板分子、未聚合的物質(zhì)以及其他雜質(zhì)洗脫出來，最后用超純水沖去MIP電極表面的NaOH以及剩余雜質(zhì)，即制得MIP/GCE，烘干備用。相似地，將不含GAA的NIP前驅(qū)液替換MIP前驅(qū)液，采用相同電聚合和洗滌步驟制備NIP修飾電極(NIP/GCE)。

1.3.3 GAA在MIP/GCE的吸附和電化學(xué)測試 將MIP/GCE浸入不同濃度的GAA溶液中，在77 r/min轉(zhuǎn)速下吸附50 min，隨后用去離子水淋洗，去除電極表面非特異性吸附的GAA分子，從而得到GAA吸附電極(GAA/MIP/GCE)。將GAA/MIP/GCE置于0.1 mmol/L 的[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(CV)和電化學(xué)阻抗法(EIS)表征。CV掃描范圍-0.2～0.6 V，掃描速率100 mV/s。EIS頻率范圍0.1 Hz～100 kHz，振幅5 mV。同樣以[Fe(CN)6]3-/4-為指示探針，采用微分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行定量分析，DPV參數(shù)：電位區(qū)間-0.1～0.5 V、脈沖幅度0.05 V、脈沖寬度0.05 V。采用同樣方法考察NIP/GCE對GAA的識別性能。基于OPD聚合膜的GAA分子印跡電化學(xué)傳感器構(gòu)建如圖1所示的示意圖。

圖1 GAA分子印跡電化學(xué)傳感器構(gòu)建示意圖

1.3.4 試驗條件優(yōu)化 為達(dá)到傳感器對GAA最佳的分析性能，從OPD電化學(xué)聚合掃描圈數(shù)、模板分子GAA洗脫圈數(shù)和GAA吸附時間進(jìn)行試驗條件優(yōu)化。具體方法：將GCE置于OPD和GAA混合溶液中進(jìn)行電化學(xué)聚合，直至所得的CV曲線趨于穩(wěn)定，考察OPD在GCE表面聚合是否達(dá)到飽和；將聚合后的電極在0.1 mol/L NaOH空白液中進(jìn)行不同圈數(shù)CV掃描用于GAA洗脫，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行電化學(xué)檢測，當(dāng)[Fe(CN)6]3-/4-峰電流達(dá)到最大穩(wěn)定值，驗證GAA已洗脫完全；進(jìn)一步將洗脫后的電極在GAA溶液中吸附不同時間，考察其在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的電化學(xué)響應(yīng)，當(dāng)信號降到最低，驗證GAA與MIP吸附達(dá)到平衡。

2 結(jié)果與分析

2.1 電聚合過程

圖2(a)為GCE在含NIP前驅(qū)液中連續(xù)電聚合30圈的CV圖。聚合第一圈時，0.48 V處出現(xiàn)一個不可逆的氧化峰，對應(yīng)于OPD上的氨基被氧化成帶正電荷的自由基的不可逆過程[22-23]。隨著掃描圈數(shù)的增加，該氧化峰強(qiáng)度逐漸下降，說明有不導(dǎo)電產(chǎn)物吸附在GCE表面，抑制了后續(xù)聚合吸附過程。當(dāng)聚合至30圈時，該氧化峰趨于消失，表明GCE表面已完全被OPD聚合膜覆蓋。而當(dāng)電解液為MIP前驅(qū)液時[圖2(b)]，同樣觀察到0.48 V附近有一不可逆氧化峰，證實了該峰來自于OPD的氧化。隨著掃描圈數(shù)的增加，該峰逐漸降低，說明不導(dǎo)電聚合產(chǎn)物吸附在電極表面。該結(jié)果也表明GAA的存在不會影響OPD的電化學(xué)聚合過程。值得注意的是，在相同的電聚合掃描圈數(shù)下，NIP前驅(qū)液的峰信號強(qiáng)度均低于MIP的峰信號強(qiáng)度。這可能是因為在電聚合成膜的過程中，由于MIP前驅(qū)液中的GAA與OPD通過氫鍵作用摻入聚合膜中，降低了OPD聚合膜的致密度，從而有利于后續(xù)的OPD在電極表面的擴(kuò)散和氧化。

圖2 GCE在NIP和MIP前驅(qū)液中連續(xù)掃描的CV曲線

2.2 MIP物化表征

2.2.1 SEM表征 由圖3可知，經(jīng)電化學(xué)聚合的NIP和MIP在電極表面均呈無規(guī)則顆粒狀材料，且覆蓋了整個電極表面。NIP表面光滑，而MIP材料表面具有大量孔洞。該差異表明，印跡模板分子GAA可有效從MIP中洗脫出來，并在MIP膜上留下與GAA分子匹配的“孔穴”。

圖3 NIP和MIP的SEM圖

2.2.2 FT-IR表征 采用FT-IR對NIP和MIP的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果(如圖4所示)顯示NIP和MIP的特征吸收帶完全一致，表明二者的化學(xué)結(jié)構(gòu)相同。在3 430 cm-1附近的寬吸收帶和1 650 cm-1處的吸收峰歸屬于N—H收縮振動和彎曲振動[24]。2 947 cm-1和2 882 cm-1歸屬于飽和的C—H振動吸收峰[25]。1 430 cm-1的吸收峰歸因于苯環(huán)上C═C骨架的伸縮振動[26]。1 043 cm-1處的吸收峰對應(yīng)于聚合物中的C—N收縮振動。851 cm-1處的吸收峰表明存在吩嗪結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果證實電化學(xué)合成的MIP為在吩嗪的主鏈上具有苯環(huán)和喹環(huán)結(jié)構(gòu)頭尾相連的聚合物。

圖4 NIP和MIP的FT-IR圖

2.3 不同修飾電極的電化學(xué)表征

使用CV法和EIS法，在0.1 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-溶液中對不同修飾電極進(jìn)行電化學(xué)表征，結(jié)果如圖5所示。由圖5(a)可以看出，[Fe(CN)6]3-/4-在裸GCE上有一對可逆的氧化還原峰(曲線a)，表明[Fe(CN)6]3-/4-在裸GCE表面發(fā)生很好的電子轉(zhuǎn)移過程。而[Fe(CN)6]3-/4-在電聚合后的GAA/MIP復(fù)合修飾電極上的氧化還原峰完全消失(曲線b)，是因為電極上覆蓋了一層致密且不導(dǎo)電的絕緣聚合膜，阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-與基底電極的接觸。當(dāng)去除GAA模板分子后，[Fe(CN)6]3-/4-在電極上又重新出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰(曲線c)，表明GAA分子可以有效地從MIP膜中洗脫，并留下空腔，成為[Fe(CN)6]3-/4-擴(kuò)散到GCE表面的通道。對OPD-MIP重新吸附GAA的電極，發(fā)現(xiàn)[Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原信號相比吸附前有明顯減弱(曲線d)。該試驗表明，GAA洗脫后的空腔構(gòu)象與GAA功能基團(tuán)相匹配，可用于GAA的吸附識別，重新占據(jù)MIP膜上空腔位點，導(dǎo)致[Fe(CN)6]3-/4-的CV信號減弱。

由圖5(b)可知，裸GCE上只有很小的電荷轉(zhuǎn)電阻(Rct)(曲線a)，表明GCE具有很好的導(dǎo)電能力。聚合后的GAA/MIP修飾電極Rct值最大(曲線b)，電極表面覆蓋了一層致密不導(dǎo)電的聚合物。在洗脫后的MIP/GCE上Rct值降低(曲線c)，是因為GAA模板分子被去除形成空腔，導(dǎo)電性增強(qiáng)。當(dāng)在GAA溶液中重新結(jié)合后，形成復(fù)合物，阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-靠近電極表面，所對應(yīng)的Rct值有所升高(曲線d)，說明MIP電極對GAA具有識別能力。

a.裸GCE b.GAA/MIP/GCE c.MIP/GCE d.沖洗吸附后的GAA/MIP/GCE

2.4 模板洗脫圈數(shù)和GAA吸附時間優(yōu)化

2.4.1 洗脫掃描圈數(shù)優(yōu)化 在0.1 mol/L NaOH中進(jìn)行GAA洗脫的CV掃描圈數(shù)直接影響傳感器MIP膜的空腔數(shù)量，洗脫圈數(shù)太少會導(dǎo)致大量GAA模板分子殘留在膜內(nèi)，降低傳感器對GAA檢測的識別能力。由圖6可知，洗脫圈數(shù)為10～50圈時，峰電流值隨洗脫圈數(shù)的增加而增加，說明印跡孔穴逐漸增多。當(dāng)洗脫圈數(shù)達(dá)到50圈后，峰電流值達(dá)到最大值，之后峰電流值不再有明顯的變化，說明GAA模板分子已從MIP膜中洗脫干凈。因此，選擇50圈為最優(yōu)的CV洗脫圈數(shù)。

圖6 峰電流與CV掃描洗脫圈數(shù)關(guān)系曲線圖

2.4.2 GAA吸附時間優(yōu)化 將GAA洗脫完全的傳感器浸入0.1 μmol/L GAA溶液不同時間，然后取出，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行掃描，考察不同吸附時間對傳感器峰電流的影響。由圖7可知，峰電流值隨吸附時間的增加而減小，當(dāng)吸附時間增加到50 min時電流峰值基本趨于穩(wěn)定，說明GAA在MIP膜上的吸附達(dá)到平衡，因此50 min為傳感器吸附GAA的最佳時間。

圖7 峰電流與GAA吸附時間的關(guān)系曲線

2.5 分析性能

在最佳條件下，將MIP/GCE浸入不同濃度(1.0 pmol/L～1.0 μmol/L)的GAA溶液中吸附50 min，再在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行DPV掃描，考察分子印跡傳感器對GAA的分析性能。由圖8(a)可知，隨著GAA濃度的增加，使所測的峰電流值逐漸降低，表明越來越多的GAA目標(biāo)分子占據(jù)了MIP/GCE上空腔位點。峰電流值(Ip)與GAA濃度負(fù)對數(shù)(-lgC)在1.0 pmol/L～1.0 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[圖8(b)]，其線性回歸方程為：Ip=18.2-0.710lgC，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1，檢出限為0.21 pmol/L。

圖8 MIP/GCE與不同濃度GAA吸附后的DPV曲線及其峰電流與GAA濃度負(fù)對數(shù)線性關(guān)系

2.6 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性

平行制備5支MIP/GCE，在相同條件下對1.0 μmol/L GAA目標(biāo)分子進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖9(a)所示。根據(jù)信號變化，求得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.3%，表明所制備的傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

圖9 MIP電化學(xué)傳感器的重復(fù)性和穩(wěn)定性

將制備的MIP/GCE置于4 ℃冰箱中保存，每隔24 h使用DPV法對其進(jìn)行連續(xù)檢測，并在第7天考察其對1.0 μmol/L GAA溶液的分析性能。結(jié)果如圖9(b)所示，MIP/GCE連續(xù)6 d的DPV峰電流變化很??；且第7天仍能用于GAA檢測，說明MIP/GCE具有良好的穩(wěn)定性。

圖10為分子印跡傳感器在不同溶液(濃度均為1.0 μmol/L)中浸泡50 min后，在[Fe(CN)6]3-/4-中的DPV曲線。由圖10可知，MIP/GCE在空白液中的信號(曲線a)與其在綠原酸(曲線b)、木犀草素(曲線c)、多巴胺(曲線d)溶液中浸泡后的信號接近，表明傳感器對上述溶液不產(chǎn)生響應(yīng)。而在GAA溶液中浸泡后，信號降低，且與在混合溶液中浸泡后的DPV峰電流值無明顯差異，表明該電化學(xué)傳感器對GAA有良好的選擇識別性。

a.空白液 b.綠原酸 c.木犀草素 d.多巴胺 e.GAA溶液 f.GAA、綠原酸、木犀草素和多巴胺混合溶液

2.7 實際樣品的檢測

將市場購買的靈芝粉實際樣品用水或乙醇作為溶劑分別配制10 mg/mL的靈芝液，靜置24 h。離心，取100 μL 靈芝液，用MIP/GCE進(jìn)行浸泡吸附，后在[Fe(CN)6]3-/4-中進(jìn)行檢測，根據(jù)峰電流值代入線性回歸方程計算分析得到相應(yīng)的GAA的濃度。隨后在浸出靈芝液中分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)GAA溶液進(jìn)行回收率測定，結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示以乙醇為溶劑的浸出濃度為1.15 nmol/L，而以水為溶劑的浸出濃度僅為3.00 pmol/L，表明乙醇能更有效地使GAA從實際樣品中溶解出來。在兩種溶劑浸出液中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入法，得到的回收率分別為99%～102%和98%～101%，說明該方法所制備的分子印跡電化學(xué)傳感器對GAA的檢測具有較高的準(zhǔn)確度，可用于靈芝粉等實際樣品的檢測。建立靈芝活性成分的快速檢測方法，有助于靈芝藥材的質(zhì)量控制與現(xiàn)代劑型的開發(fā)。

表1 用乙醇或水配制的靈芝液實際樣品中GAA測定結(jié)果

3 結(jié)論

將分子印跡技術(shù)和電化學(xué)傳感器結(jié)合，采用電聚合的方法，以鄰苯二胺為功能單體，靈芝酸A為模板分子，在無需交聯(lián)劑條件下合成分子印跡聚合物，并利用IR和SEM對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和形貌表征。在最佳的試驗條件下，以靈芝酸A為模板分子，以鄰苯二胺為功能單體合成的分子印跡電化學(xué)傳感器具有良好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性，在1.0 pmol/L～1.0 μmol/L 范圍內(nèi)，靈芝酸A的濃度(mol/L)和峰電流(μA)有良好的線性關(guān)系，擬合線性方程為Ip=18.2-0.710lgC，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1，檢出限為0.21 pmol/L，在靈芝實際樣品檢測中其回收率為98%～102%，具有良好的檢測性能。