杜江 梁國標(biāo)△ 彭顯月 付梓峰 樂俊鈞 李泰 李浩 梁天才 杜洋 趙法亮 王遠(yuǎn)亮

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563000)

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是腎癌最主要的病理類型，手術(shù)切除腫瘤是ccRCC現(xiàn)今最主要的治療手段。目前尚無公認(rèn)的腫瘤標(biāo)記物以供臨床早癌篩查，約25%～30%的患者在確診時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，其5年生存率顯著下降[1]。2019年NCCN(美國國家癌癥綜合網(wǎng)絡(luò))發(fā)布了最新的腎癌臨床診療指南中，阿西替尼等靶向藥物已被納入晚期腎癌的一線治療方案。在晚期腎癌靶向治療的新時代背景下，深入腎癌的發(fā)病機(jī)制研究，尋找更優(yōu)的治療靶點(diǎn)對推進(jìn)靶向治療有著重要意義。在我們的前期研究中，發(fā)現(xiàn)SPRED2(Sprouty related proteins with an EVH 1 domain 2)在ccRCC發(fā)展過程中可能發(fā)揮抑癌作用，并具備成為新腫瘤標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)的潛在可能。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本的收集與處理 本課題中的前期實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，選取于我院于2010年2月至2017年10月期間施行手術(shù)的患者；近期實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取材于手術(shù)后的新鮮組織，其中包括正常腎組織、ccRCC癌組織及癌旁組織各9例。新鮮標(biāo)本組織放置于液氮保存液中，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱內(nèi)保存。實(shí)驗(yàn)中所納入的樣本在術(shù)后病理明確診斷為腎透明細(xì)胞癌，在近期均未接受過任何藥物及放射治療；癌旁組織取自于癌組織周圍2 cm以內(nèi)，且未發(fā)生壞死或癌變的組織；相對正常腎組織標(biāo)本取自正常腎臟在外傷后進(jìn)行腎臟切除或腎臟良性病變的患者。

1.2主要試劑 SPRED2及LC3抗體購自英國Abcam公司；SPRED2及LC3II抗體購自北京博奧公司；GAPDH抗體及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒等購自碧云天公司；全蛋白提取及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自凱基公司；免疫組化相關(guān)試劑購自北京中杉金橋公司。

1.3免疫組化檢測 組織切片制備：制備4 μm厚石蠟組織切片。脫蠟、脫水：室溫下，將石蠟切片置于二甲苯中浸泡，再經(jīng)梯度酒精脫水后漂洗；封閉：滴加3% H2O2進(jìn)行封閉處理；抗原修復(fù)：用檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)；顯色及染色：先后滴加5%BSA及滴加稀釋好的一抗，4℃冰箱過夜。取出恢復(fù)室溫后進(jìn)行漂洗，并滴加二抗后再次孵育；DAB顯色；封片：脫水后用樹脂進(jìn)行封片，用于顯微鏡觀察。

1.4Western-blot檢測 將樣本組織研磨成粉末后加入蛋白裂解液，震蕩使其充分裂解后離心，收集上清液；BCA法測上清蛋白的濃度按比例混合蛋白樣品與上樣緩沖液后，加熱使蛋白變性后冷卻至室溫；配膠：根據(jù)SPRED2及LC3蛋白的分子量配置10 % SDS-PAGE凝膠；電泳、切膠體及轉(zhuǎn)膜：待電泳結(jié)束后，切下待檢測蛋白條帶，將凝膠帶的PVDF膜放入甲醇中浸泡后，與濾紙層一同放入轉(zhuǎn)膜液中浸泡，以恒定電流轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜浸入封閉液中30 min，再用PBST洗膜，并加入稀釋后的一抗，4℃冰箱過夜。加入二抗后，37℃孵育；顯色、曝光后，采集圖像，并對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用GraphPad Prism 7.0，對所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析；P<0.01或P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在前期實(shí)驗(yàn)中，通過免疫組織化學(xué)法檢測SPRED2及LC3在各組織中的基本表達(dá)情況，SPRED2及LC3蛋白主要定位于細(xì)胞膜和胞漿，以細(xì)胞膜為主(見圖1、2)。進(jìn)一步通過Western-blot檢測SPRED2在各組織中的表達(dá)含量，SPRED2在癌組織、癌旁組織及正常腎組織中的表達(dá)水平分別為(0.52±0.24)、(0.86±0.30)及(1.47±0.55)。SPRED2在正常腎組織中的表達(dá)含量顯著高于ccRCC癌旁組織及癌組織，在癌旁組織中的表達(dá)水平明顯高于癌組織(見圖3)；LC3在癌組織、癌旁組織及正常腎組織中的表達(dá)水平分別為(1.34±0.40)、(0.72±0.32)及(0.33±0.12)。LC3在正常腎組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織及癌組織，在癌旁組織中的表達(dá)水平明顯低于癌組織(見圖3)。

注：a.陰性對照;b.正常腎組織;c.癌組織;d.癌旁組織。圖1 SPRED2在正常腎組織、ccRCC癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況(IHC，×400)

注：a.陰性對照;b.正常腎組織;c.癌組織;d.癌旁組織。圖2 LC3II在正常腎組織、ccRCC癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況(IHC，×400)

圖3 圖a、c是通過Western-blot檢測SPRED2在正常腎組織、ccRCC癌旁組織及癌組織中的表達(dá)情況(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)；圖b、d 是通過Western-blot檢測LC3II在正常腎組織、ccRCC癌旁組織及癌組織中的表達(dá)情況(*P<0.05；**P<0.01；****P<0.001)。

3 討 論

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計，腎癌新增患者例數(shù)超過40萬，死亡例數(shù)超過10萬，發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢[2]。腎癌作為一種多基因相關(guān)腫瘤，至今發(fā)病機(jī)制未明，尚無針對病因的有效救治手段。近年，SPRED2作為的一個被新發(fā)現(xiàn)的抑癌蛋白受到廣泛關(guān)注。它作為一類與Sprouty蛋白相關(guān)的細(xì)胞膜蛋白，能夠降低Ras/ERK信號調(diào)控通路的傳導(dǎo)活性，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用；并且，能夠在不抑制Ras激活的狀態(tài)下，調(diào)低Raf-1的表達(dá)，從而發(fā)揮對生長因子等的負(fù)向調(diào)控功能[3-4]。SPREDs家族蛋白有三個成員，包括：SPRED1、SPRED2及SPRED3；其中，SPRED2在全身多器官中均有表達(dá)。SPRED2蛋白分子結(jié)構(gòu)主要由以下三個部分組成，分別是EVH 1同源結(jié)構(gòu)域，KBD結(jié)構(gòu)域及Sprouty相關(guān)蛋白結(jié)合區(qū)域[3]。

目前，已有多項(xiàng)研究結(jié)果表明，SPRED2表達(dá)水平的高低與多種腫瘤發(fā)展進(jìn)程關(guān)系緊密。例如，在肝細(xì)胞癌發(fā)展過程中，上調(diào)SPRED2表達(dá)能夠提升凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3的表達(dá)水平并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[5]。K.Jiang等[6]在宮頸癌及肺癌的研究中另有新的發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的SPRED2能夠激活自噬標(biāo)志蛋白LC3(microtubule-associated protein light chain 3)活性，并加速其轉(zhuǎn)換，促進(jìn)生成更多自噬溶酶體，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡。在前列腺癌中，SPRED2通過阻斷了ERK調(diào)控通路的磷酸化，從而阻礙前列腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[7]。有研究[8]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在BRAFV600E基因突變的人黑色素瘤細(xì)胞中，SPRED1/2通過調(diào)低Ras/PI3K/AKT通路傳導(dǎo)活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。PI3K/AKT調(diào)控通路的主要作用是，參與血管的生成、凋亡及自噬[9-11]。還有研究[12]表明，SPRED2通過調(diào)節(jié)Rho蛋白的活性，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制。在結(jié)腸癌中，SPRED2的表達(dá)降低，能夠激活MAPK通過活性，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。在最新的研究中，有日本學(xué)者再次證實(shí)SPRED2通過抑制MAPK傳導(dǎo)通路活性，從而影響肺纖維化[14]。有國內(nèi)學(xué)者在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)，SPRED2的表達(dá)水平升高，直接影響了ERK通路活性，導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)受到抑制[15]，眾所周知，EMT與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切[16]。在心肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，SPRED2的缺乏能夠抑制自噬，導(dǎo)致心功能不全及惡性心率失常[17]。綜上可見，SPRED2在不同的細(xì)胞中調(diào)控功能不同，對不同腫瘤的進(jìn)展過程有著不同的負(fù)向調(diào)控分子機(jī)制，尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道其在ccRCC中發(fā)揮的具體作用及分子調(diào)控機(jī)制。并且，近年有學(xué)者提出，SPRED2通過調(diào)控LC3蛋白的活化，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的自噬程序。因此，為進(jìn)一步探討SPRED2在ccRCC中具體發(fā)揮的生物學(xué)作用及與LC3之間存在的何種關(guān)系，我們對SPRED2及LC3在ccRCC中的表達(dá)情況進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)，通過免疫組化及Western blot檢測正常腎組織、ccRCC癌組織及癌旁組織中SPRED2的表達(dá)情況。

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們通過免疫組化對SPRED2及LC3II在各組織中的表達(dá)進(jìn)行定位檢測；在近期，通過Western blot對各組織中SPRED2及LC3的含量進(jìn)行定量后發(fā)現(xiàn)，SPRED2在正常腎組織中的表達(dá)含量明顯高于ccRCC癌旁組織及癌組織，在癌組織中的表達(dá)水平最低；而LC3在正常腎組織中的表達(dá)含量明顯低于癌旁組織及癌組織，在癌旁組織中的表達(dá)含量又明顯低于癌組織。SPRED2在正常腎組織中表達(dá)含量最高，可能代表該抑癌因子在正常腎組織中的基礎(chǔ)表達(dá)含量；隨著腫瘤發(fā)生進(jìn)展，從癌旁組織到癌組織，其表達(dá)含量逐漸降低，隨著這種保護(hù)因子被不斷消耗，機(jī)體對抗癌細(xì)胞侵襲的能力也隨之被削弱。由此推測，在ccRCC進(jìn)展過程中，SPRED2可能發(fā)揮抑癌作用。LC3是細(xì)胞自噬發(fā)生的標(biāo)志蛋白，其正常腎組織中的表達(dá)含量較低，說明在此階段細(xì)胞自噬程序可能處于休眠狀態(tài)；隨著腫瘤不斷進(jìn)展，從癌旁組織向癌組織轉(zhuǎn)變過程中，細(xì)胞內(nèi)壓力不斷蓄積，自噬被激活，故LC3的含量逐漸升高。在ccRCC中，細(xì)胞自噬是否被激活并帶來保護(hù)作用，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，我們發(fā)現(xiàn)，LC3在ccRCC癌組織中的表達(dá)含量最高，而SPRED2在其中的表達(dá)含量最低，兩者的表達(dá)趨勢相反；說明在ccRCC進(jìn)展過程中兩者可能不存在協(xié)同關(guān)系，自噬通路可能并未受到SPRED2表達(dá)的影響，而細(xì)胞凋亡可能是SPRED2影響ccRCC進(jìn)展的主要因素。這為我們下一步實(shí)驗(yàn)指引方向。