李剛龍 馬洪 林金鳳 陳進(jìn) 張中嚴(yán) 趙鵬 劉紅

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院小兒外科，貴州 遵義 563003；2.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

睪丸扭轉(zhuǎn)系泌尿外科常見(jiàn)陰囊急癥，以小兒和青少年多見(jiàn)[1]。睪丸扭轉(zhuǎn)后精索動(dòng)靜脈血液循環(huán)障礙，發(fā)生睪丸缺血、細(xì)胞凋亡壞死等病理改變[2-3]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)兒童睪丸扭轉(zhuǎn)研究，主要集中于短期患側(cè)睪丸方面如扭轉(zhuǎn)睪丸分子生物學(xué)變化。兒童期睪丸扭轉(zhuǎn)后，對(duì)健側(cè)睪丸生殖功能影響鮮有報(bào)道。目前一側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)、對(duì)側(cè)睪丸受損仍存爭(zhēng)議。本研究采用Turner法制作鼠性成熟前期睪丸扭轉(zhuǎn)模型(扭轉(zhuǎn)未壞死睪丸、扭轉(zhuǎn)疑似壞死睪丸、扭轉(zhuǎn)壞死睪丸)，分別采用復(fù)位和切除兩種術(shù)式，待性成熟期檢查健側(cè)睪丸組織結(jié)構(gòu)和性激素(FSH、LH、T)水平，以了解健側(cè)睪丸功能。從而為臨床上兒童期睪丸扭轉(zhuǎn)正確處理，提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及飼養(yǎng)環(huán)境：選用SPF級(jí)3周齡雄性SD鼠，體重(85±15)g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物56只，隨機(jī)分成7組，每組8只。飼養(yǎng)環(huán)境：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在帶有氣溫控制和光線調(diào)節(jié)的環(huán)境[溫度：(21±2℃)；濕度(50±20)%]內(nèi)飼養(yǎng)，并可以自由覓食、飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型制作 采用Turner法制作鼠性成熟前期睪丸扭轉(zhuǎn)模型：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予濃度為2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，建立模型如下：假手術(shù)對(duì)照組(CG)：在無(wú)菌條件下切開(kāi)陰囊左側(cè)，游離并牽出左睪丸，不做任何處理后放回；4 h后再打開(kāi)切口將睪丸用絲線固定，避免扭轉(zhuǎn)，縫合切口。扭轉(zhuǎn)未壞死睪丸復(fù)位組(NNTR)：左睪丸逆時(shí)針扭轉(zhuǎn)90°固定4 h復(fù)位睪丸(圖1A)；扭轉(zhuǎn)未壞死睪丸切除組(NNTO)：左睪丸逆時(shí)針扭轉(zhuǎn)90°固定4 h切除睪丸。扭轉(zhuǎn)疑似壞死睪丸復(fù)位組(SNTR)：左睪丸逆時(shí)針扭轉(zhuǎn)360°固定4 h復(fù)位睪丸；扭轉(zhuǎn)疑似壞死睪丸切除組(SNTO)：左睪丸逆時(shí)針扭轉(zhuǎn)360°固定4 h切除睪丸。扭轉(zhuǎn)壞死睪丸復(fù)位組(NTR)：左睪丸逆時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°固定4 h復(fù)位睪丸(圖1B)；扭轉(zhuǎn)壞死睪丸切除組(NTO)：左睪丸逆時(shí)針扭轉(zhuǎn)720°固定4 h切除睪丸。扭轉(zhuǎn)睪丸處于不同狀態(tài)判定標(biāo)準(zhǔn)如下。扭轉(zhuǎn)未壞死睪丸：睪丸扭轉(zhuǎn)90°固定4 h復(fù)位，睪丸色澤正常、稍水腫，針刺睪丸即刻出血；扭轉(zhuǎn)疑似壞死睪丸：睪丸扭轉(zhuǎn)360°固定4 h復(fù)位，睪丸呈暗褐色、水腫等表現(xiàn)，針刺睪丸10 min內(nèi)出血；扭轉(zhuǎn)壞死睪丸：睪丸扭轉(zhuǎn)720°固定4 h復(fù)位，睪丸呈發(fā)黑、壞死等表現(xiàn)，針刺睪丸10 min后未出血。上述全部SD鼠每天注射青霉素3萬(wàn)U，連續(xù)1周。術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)6周，即進(jìn)入鼠性成熟期。采取快速脫頸法處死SD大鼠，切取健側(cè)睪丸并包埋制作石蠟塊；同時(shí)留置心臟血液離心取血清、ELISA法檢測(cè)性激素水平(卵泡刺激素FSH、黃體生成素LH及睪酮T)。

注：A.正常睪丸：顏色紅潤(rùn)、無(wú)水腫；B.扭轉(zhuǎn)壞死睪丸：顏色發(fā)黑，水腫。圖1 正常睪丸與扭轉(zhuǎn)壞死睪丸

1.2.2性成熟期健側(cè)睪丸組織結(jié)構(gòu)變化檢測(cè) 睪丸石蠟塊標(biāo)本連續(xù)切取厚度為3～5 μm組織切片，平鋪在70℃烘片機(jī)上烘干、放入70℃恒溫箱烘烤4 h；再將切片常規(guī)二甲苯脫蠟至水、梯度酒精脫水、自來(lái)水沖洗；然后蘇木素染色、1%鹽酸酒精分化；最后伊紅染液復(fù)染、中性樹(shù)脂封片，置光學(xué)顯微鏡觀察。睪丸組織損害判定標(biāo)準(zhǔn)：睪丸生精上皮完整，各級(jí)生精細(xì)胞排列有序，無(wú)生精小管萎縮為正常；睪丸生精上皮層減少，少量生殖細(xì)胞脫落管腔中為輕度損害；生精上皮層明顯減少，部分生殖細(xì)胞脫落管腔，生殖細(xì)胞排列紊亂、生精小管萎縮為睪丸組織結(jié)構(gòu)損害。

1.2.3ELISA法檢測(cè)性成熟期性激素(FSH、LH及T)水平變化 采用ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，即通過(guò)可溶性抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體，應(yīng)用抗原抗體特異性結(jié)合特性、進(jìn)行免疫反應(yīng)定量和定性檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1性成熟期健側(cè)睪丸組織病理學(xué)變化 CG組健側(cè)睪丸曲細(xì)精管生精上皮完整、各級(jí)生精細(xì)胞排列有序，無(wú)生精小管萎縮(圖2A)。NNTR和NNTO組：健側(cè)睪丸曲細(xì)精管未出現(xiàn)病理改變，各層結(jié)構(gòu)排列整齊(圖2B、2C)。SNTR和SNTO組：生精上皮層減少、少量生殖細(xì)胞脫落管腔(圖2D、2E)。NTR和NTO組：前者生精上皮層明顯減少、排列紊亂，生精小管萎縮(圖2F)；后者未出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)改變(圖2G)，提示性成熟前期切除扭轉(zhuǎn)壞死睪丸能減輕成年期健側(cè)睪丸損傷。

注：A.曲細(xì)精管生精上皮完整、無(wú)脫落，生精細(xì)胞排列有序，層次分明(由外至內(nèi)依次為精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子)，無(wú)生精小管萎縮。B、C.睪丸曲細(xì)精管未出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)改變，各層結(jié)構(gòu)排列整齊。D、E.生精上皮層減少、排列不清，細(xì)胞腫脹、成熟精子少。F、G.前者生精上皮明顯減少、排列紊亂，成熟精子極少；后者未出現(xiàn)明顯的組織結(jié)構(gòu)改變。圖2 各組大鼠健側(cè)睪丸組織組織結(jié)構(gòu)變化(HE×400)

2.2性成熟期性激素水平變化 采用ELISA法檢測(cè)性激素(FSH、LH、T)水平見(jiàn)表1。FSH、LH在各組升高，T降低，但各性激素在NNTR與NNTO組間比較、以及SNTR與SNTO組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；性激素在NTR與NTO組間比較，NTR組FSH、LH明顯高于NTO組，T顯著低于NTO組(P<0.05)。假手術(shù)對(duì)照CG組性激素分別與NNTR、NNTO以及NTO組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與CG組比較，SNTR、SNTO以及NTR組LH、FSH顯著升高，T顯著降低(P<0.05)。

表1 不同處理方式對(duì)鼠性成熟期血清中性激素FSH、LH、T水平

3 討 論

睪丸扭轉(zhuǎn)是小兒泌尿外科多發(fā)陰囊急癥、常需手術(shù)探查，且依據(jù)術(shù)中情況決定睪丸取舍，但在臨床實(shí)踐中，一些疑似壞死睪丸在未進(jìn)行病理活檢情況下，很難判斷睪丸活力，而且患兒家屬大多不能接受切除睪丸[4-5]。對(duì)一側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)后，成年期對(duì)側(cè)睪丸生精功能是否受影響，以及切除扭轉(zhuǎn)睪丸還是保留扭轉(zhuǎn)睪丸、何者對(duì)生精功能影響最??？目前無(wú)統(tǒng)一意見(jiàn)。

眾所周知，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)決定功能的改變[6-8]。在本研究中發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)對(duì)照CG組健側(cè)睪丸曲細(xì)精管生精上皮完整、無(wú)脫落，生精細(xì)胞排列有序，無(wú)生精小管萎縮；NNTR和NNTO組睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)完整、未見(jiàn)生精上皮脫落，未出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)改變，提示扭轉(zhuǎn)未壞死睪丸組，可能血睪屏障未受到破壞，無(wú)抗精子抗體產(chǎn)生，所以無(wú)論切除還是復(fù)位扭轉(zhuǎn)睪丸，對(duì)側(cè)睪丸均未出現(xiàn)損傷；SNTR和SNTO組，均發(fā)生輕度的組織結(jié)構(gòu)變化，即生精上皮減少，少量生殖細(xì)胞脫落于管腔，但未見(jiàn)生精小管萎縮，分析原因可能是扭轉(zhuǎn)疑似壞死睪丸因睪丸血液循環(huán)發(fā)生障礙，出現(xiàn)缺血再灌注損傷，產(chǎn)生抗精子抗體，但又因血流并未完全阻斷，抗精子抗體可以通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)對(duì)側(cè)睪丸，從而引起對(duì)側(cè)睪丸的損傷，故無(wú)論切除抑或復(fù)位扭轉(zhuǎn)睪丸，對(duì)側(cè)睪丸均出現(xiàn)輕微損傷；NTR和NTO組中，前者睪丸形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化，即生精上皮明顯減少，部分生殖細(xì)胞脫落于管腔，并可見(jiàn)生精小管萎縮，后者未出現(xiàn)明顯病理變化。我們推測(cè)可能原因系扭轉(zhuǎn)壞死睪丸因睪丸血流循環(huán)完全阻斷，睪丸出現(xiàn)缺血壞死前產(chǎn)生的抗精子抗體和過(guò)氧化物，當(dāng)復(fù)位扭轉(zhuǎn)睪丸后血流重新灌注，發(fā)生嚴(yán)重的缺血再灌注損傷，抗精子抗體、過(guò)氧化物等通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)對(duì)側(cè)，致使健側(cè)睪丸受損，在性成熟期精子生成的數(shù)量、質(zhì)量受到損害；而切除組因沒(méi)有再灌注這一過(guò)程，抗精子抗體以及產(chǎn)生的過(guò)氧化物不能通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)對(duì)側(cè)，故對(duì)側(cè)睪丸未受到損害。

生殖激素對(duì)雄性生殖功能具有重要作用[9]。睪酮(T)是最重要的雄激素，主要由睪丸Leydig細(xì)胞分泌，通過(guò)Sertoli細(xì)胞完成對(duì)生精過(guò)程的調(diào)控[10-12]。卵泡刺激素(FSH)與黃體生成素(LH)對(duì)T有重要的調(diào)控作用，LH促進(jìn)睪丸Leydig細(xì)胞增殖、合成分泌雄激素；FSH主要作用于睪丸生精細(xì)胞和支持細(xì)胞，與T共同參與維持生精過(guò)程[13-15]。本研究結(jié)果表明，假手術(shù)對(duì)照CG組性激素(FSH、LH、T)分別與NNTR、NNTO以及NTO組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與SNTR、SNTO以及NTR組比較，F(xiàn)SH 、LH顯著升高，T在各組中顯著降低(P<0.05)。這表明性成熟前期扭轉(zhuǎn)未壞死睪丸無(wú)論切除與復(fù)位，以及扭轉(zhuǎn)壞死睪丸的切除，對(duì)性成熟期健側(cè)睪丸的生精功能無(wú)損害。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)各性激素水平(FSH、LH、T)在NNTR與NNTO組間比較、以及SNTR與SNTO間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在NTR與NTO組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且NTR組中FSH、LH明顯高于NTO組，T明顯低于NTO組。不難看出，扭轉(zhuǎn)壞死的睪丸切除，對(duì)健側(cè)睪丸具有保護(hù)作用，分析其原因可能是睪丸扭轉(zhuǎn)后，睪丸血液循環(huán)發(fā)生障礙，血睪屏障受到破壞，睪丸出現(xiàn)缺血、缺氧，NO、氧自由基等增多，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生大量活性氧(ROS)[16]；當(dāng)復(fù)位扭轉(zhuǎn)壞死睪丸后，血液重新灌注，產(chǎn)生的有害物質(zhì)通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)健側(cè)，直接殺傷睪丸Leydig細(xì)胞，使T生成減少，并通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸的反饋調(diào)節(jié)，引起垂體分泌FSH、LH增加；而NTO組無(wú)這一病理過(guò)程，無(wú)Leydig細(xì)胞的損害，性激素分泌可以維持正常。此外，一側(cè)睪丸切除，對(duì)側(cè)睪丸Sertoli細(xì)胞分泌抑制素B等下降，對(duì)FSH負(fù)反饋?zhàn)饔脺p弱，促使垂體前葉分泌FSH增加，通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，刺激睪丸Sertoli細(xì)胞、生精細(xì)胞及Leydig細(xì)胞增殖，合成性激素增加，故性激素水平亦能維持正常水平。

綜上所述，鼠性成熟前期扭轉(zhuǎn)未壞死睪丸的復(fù)位與切除，對(duì)性成熟期健側(cè)睪丸無(wú)損傷；扭轉(zhuǎn)疑似壞死睪丸無(wú)論切除與復(fù)位，對(duì)性成熟期健側(cè)睪丸均有輕微損害，應(yīng)予以保留；扭轉(zhuǎn)壞死睪丸的切除，對(duì)性成熟期健側(cè)睪丸具有保護(hù)作用，應(yīng)盡可能切除。