王玉杭，王煦程，王迪，楊婧，曾慶賀，袁文華，童培建，金紅婷

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310053；4.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞所必需的轉(zhuǎn)錄因子[1]。Osterix陽(yáng)性細(xì)胞主要靶標(biāo)于干骺端和骨干處[2]。髓為奇恒之腑，是維持人體生命活動(dòng)的基本物質(zhì)[3]。受科技水平的限制，古人未能探明髓的本質(zhì)?！罢闩芍嗅t(yī)”骨傷團(tuán)隊(duì)開(kāi)創(chuàng)了“髓系骨病”理論[4]，總結(jié)性地提出了“諸骨病萎，皆屬于髓”的理念。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞共同的前體細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能與髓的功能高度相似，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其微環(huán)境可滋養(yǎng)骨骼，維持骨穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮“髓以養(yǎng)骨”的功效[5-6]。因此，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能是髓的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[7-8]。我們基于“髓系骨病”理論，探索了Osterix陽(yáng)性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞維持骨穩(wěn)態(tài)的作用，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Osterix-CreERT2小鼠(Osterix基因靶標(biāo)小鼠)和Rosa26-DTA小鼠(白喉毒素A片段報(bào)告小鼠)購(gòu)自Jackson Laboratory，Rosa26-tdTomato小鼠(番茄紅熒光報(bào)告小鼠)為饋贈(zèng)所得。Osterix-CreERT2小鼠與Rosa26-tdTomato小鼠交配獲得子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠，Osterix-CreERT2小鼠與Rosa26-DTA小鼠交配獲得子代Rosa26-DTA小鼠和Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(浙)2021-0012。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑4%多聚甲醛、14%乙二胺四乙酸二鈉(disodium ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)、他莫昔芬、阿爾新藍(lán)8GX、碘酸鈉、硫酸鈉、硫酸鋁銨、二氨基聯(lián)苯胺、蘇木精(美國(guó)Sigma公司)，胃蛋白酶抗原修復(fù)液(北京中杉金橋生物科技有限公司)，鼠源堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)抗體(Arigo生物科技公司)，鼠源脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP4)抗體、鼠源熒光CD73抗體、山羊抗小鼠IgG熒光二抗(英國(guó)Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器VIP 5Jr組織脫水機(jī)(日本櫻花公司)，AP280-2組織包埋機(jī)、HM355S石蠟切片機(jī)(德國(guó)Microm公司)，顯微鏡和顯微拍攝系統(tǒng)(德國(guó)蔡司公司)，SkyScan1176 Micro-CT(比利時(shí)Bruker公司)。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及干預(yù)選取3只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-tdTomato小鼠納入示蹤組，6只子代Rosa26-DTA小鼠納入空白組，6只子代Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠納入Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組。各組小鼠均于1月齡時(shí)按0.1 mg·g-1體質(zhì)量腹腔注射他莫昔芬，每天1次，連續(xù)注射5 d，以誘導(dǎo)白喉毒素表達(dá)，特異性剔除Osterix陽(yáng)性細(xì)胞。

2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)觀察

2.2.1Osterix陽(yáng)性細(xì)胞在小鼠股骨中的分布情況觀察 他莫昔芬干預(yù)結(jié)束后2周，脫頸處死示蹤組小鼠，切取左側(cè)股骨，置于4%多聚甲醛中固定3 d，14%EDTA脫鈣14 d，流水沖洗24 h后常規(guī)冰凍切片，厚度3 μm。切片用胃蛋白酶抗原修復(fù)液在37 ℃處理15 min，加入鼠源熒光CD73抗體(用PBS按1∶1000稀釋)在4 ℃孵育過(guò)夜，山羊抗小鼠IgG熒光二抗(用PBS按1∶200稀釋)中孵育20 min，DAPI染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察Osterix陽(yáng)性細(xì)胞分布情況。

2.2.2小鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)觀察 他莫昔芬干預(yù)結(jié)束后6個(gè)月，脫頸處死Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組和空白組小鼠，切取左側(cè)股骨。將股骨標(biāo)本用保鮮膜包好，置于Micro-CT載物臺(tái)上，以股骨遠(yuǎn)端生長(zhǎng)板為中心選擇感興趣區(qū)，對(duì)其中的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)測(cè)量規(guī)劃和收集后，利用NRECON1.6.10軟件將2D投影圖轉(zhuǎn)化為3D容積圖，經(jīng)CTAn1.10軟件分析后利用CTVOX3.0.0軟件構(gòu)建3D圖像，觀察小鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)，并測(cè)量骨松質(zhì)和骨皮質(zhì)的骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量及骨小梁分離度。

2.2.3小鼠股骨組織形態(tài)觀察 Micro-CT檢查結(jié)束后，將Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組和空白組小鼠股骨標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定3 d，14%EDTA脫鈣14 d，流水沖洗24 h后常規(guī)石蠟包埋切片，厚度3 μm。從Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組和空白組各隨機(jī)選取3只小鼠的股骨切片，進(jìn)行阿爾新藍(lán)-蘇木精染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察股骨組織形態(tài)，并用Image-Pro Plus軟件測(cè)定脂滴面積，測(cè)定結(jié)果以脂滴積分光密度與總光密度的比值表示。

2.2.4小鼠股骨中ALP和FABP4表達(dá)量測(cè)定 從Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組和空白組隨機(jī)選取3只小鼠的股骨切片，在胃蛋白酶抗原修復(fù)液中于37 ℃孵育30 min，加入一抗(鼠源ALP抗體，用PBS按1∶200稀釋；鼠源FABP4抗體，用PBS按1∶500稀釋)，在4 ℃孵育過(guò)夜，加入山羊抗鼠二抗(用PBS按1∶1000稀釋)孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復(fù)染。用Image-Pro Plus軟件測(cè)定ALP和FABP4表達(dá)量，測(cè)定結(jié)果以陽(yáng)性染色物積分光密度與總光密度的比值表示。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，空白組和Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組骨松質(zhì)骨密度、骨松質(zhì)骨小梁厚度、骨松質(zhì)骨小梁分離度、骨松質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)、骨松質(zhì)骨小梁數(shù)量、骨皮質(zhì)骨密度、骨皮質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)、骨皮質(zhì)骨小梁厚度、骨皮質(zhì)骨小梁分離度、骨皮質(zhì)骨小梁數(shù)量、脂滴面積、ALP表達(dá)量、FABP4表達(dá)量的組間比較均采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 Osterix陽(yáng)性細(xì)胞在小鼠股骨中的分布情況Osterix陽(yáng)性細(xì)胞中tdTomato蛋白的紅色熒光與DAPI染色的細(xì)胞核藍(lán)色熒光分布高度重合，均位于髓腔[圖1(1)至圖1(3)]；Osterix陽(yáng)性細(xì)胞中tdTomato蛋白的紅色熒光與CD73染色的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞核綠色熒光分布高度重合，均位于髓腔[圖1(4)至圖1(6)]。

圖1 小鼠股骨組織熒光染色結(jié)果(×5)注:(1)(4)中紅色熒光部分為Osterix陽(yáng)性細(xì)胞中的tdTomato蛋白；(2)中藍(lán)色熒光部分為DAPI染色的細(xì)胞核；(3)為tdTomato蛋白的紅色熒光與DAPI染色的細(xì)胞核藍(lán)色熒光重合顯示結(jié)果；(5)中綠色熒光為CD73染色的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞核；(6)為tdTomato蛋白的紅色熒光與CD73染色的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞核綠色熒光重合顯示結(jié)果。

3.2 小鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組1只小鼠死亡；此外，空白組和Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組各有1只小鼠的數(shù)據(jù)明顯異于其他小鼠，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)予以剔除。Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組的骨松質(zhì)骨密度和骨松質(zhì)骨小梁厚度均低于空白組，骨松質(zhì)骨小梁分離度高于空白組；2組的骨松質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)、骨松質(zhì)骨小梁數(shù)量比較，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2、表1)。Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組的骨皮質(zhì)骨密度、骨皮質(zhì)骨體積分?jǐn)?shù)、骨皮質(zhì)骨小梁厚度均低于空白組；2組的骨皮質(zhì)骨小梁分離度、骨皮質(zhì)骨小梁數(shù)量比較，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2、表2)。

表1 小鼠股骨骨松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)

表2 小鼠股骨骨皮質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖2 小鼠股骨Micro-CT圖像

3.3 小鼠股骨組織形態(tài)觀察結(jié)果與空白組相比，Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組小鼠股骨生長(zhǎng)板軟骨-骨連接處有大量脂滴生成，脂肪空泡堆積(圖3)。Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組的脂滴面積大于空白組[(203.514±0.957)%，(241.061±5.805)%，t=-6.381，P=0.003]。

圖3 小鼠股骨組織阿爾新藍(lán)-蘇木精染色結(jié)果(×10)

3.4 小鼠股骨中ALP和FABP4表達(dá)量測(cè)定結(jié)果免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組可見(jiàn)少量ALP和大量FABP4，而空白組ALP較多、FABP4較少(圖4、圖5)。Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組股骨ALP表達(dá)量低于空白組，F(xiàn)ABP4表達(dá)量高于空白組(表3)。

表3 小鼠股骨中堿性磷酸酶和脂肪酸結(jié)合蛋白4表達(dá)量

圖4 小鼠股骨組織中堿性磷酸酶免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×20)

圖5 小鼠股骨組織中脂肪酸結(jié)合蛋白4免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×20)

4 討 論

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腎藏精，精生髓，髓居骨中以養(yǎng)骨，骨骼賴之以生長(zhǎng)?！墩f(shuō)文解字》言：“髓者，骨中脂也?！边@都表明髓是骨骼生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝過(guò)程中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。骨骼得到髓的濡養(yǎng)，則生長(zhǎng)發(fā)育正常，保持其堅(jiān)剛之性；骨骼失去髓的濡養(yǎng)，就會(huì)出現(xiàn)骨骼脆弱、發(fā)育不良等疾病[9]?！端貑?wèn)》中“骨者，髓之府”“髓者，骨之充也”的論述表明，髓是藏于骨內(nèi)的精微物質(zhì)，在維持骨穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。而《素問(wèn)》中“腎者，水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”的論述則表明，骨痿的病機(jī)是腎虛而髓不能滿。因此，“髓萎骨枯”是骨病的一個(gè)重要病機(jī)。中醫(yī)學(xué)理論中的髓與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在功能上具有高度相似性。有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擁有分化為成骨細(xì)胞的潛力[10]和參與造血的功能，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其微環(huán)境還可滋養(yǎng)骨骼，發(fā)揮“髓以養(yǎng)骨”的功效，這都與髓的藏精氣、充骨化血的功能類似。因此越來(lái)越多的研究者認(rèn)為，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可能是髓的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在于成體骨髓中，在一定條件誘導(dǎo)下可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞。Osterix是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞所必需的轉(zhuǎn)錄因子。Ono等[2]的研究證實(shí)，出生3 d的小鼠骨表面大部分成骨細(xì)胞和軟骨膜中的細(xì)胞都呈現(xiàn)出Osterix-CreER標(biāo)記；在隨后1年中，這些Osterix陽(yáng)性細(xì)胞分化為骨干骺端和骨干處的成骨細(xì)胞。Zhun等[11]的研究顯示，Osterix缺失小鼠可表現(xiàn)出成骨細(xì)胞分化和新骨形成停滯的現(xiàn)象。綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞維持著骨的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[12]，這種內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)一旦被打破就會(huì)發(fā)生類似“髓萎骨枯”的髓系病證。

結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞理論[13-14]和中醫(yī)學(xué)理論[4,9,15]，我們認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞很可能是髓的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。在本研究中，注射他莫昔芬可誘導(dǎo)白喉毒素表達(dá)，使Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組子代Osterix-CreERT2/Rosa26-DTA小鼠的Osterix陽(yáng)性細(xì)胞被特異性剔除。免疫熒光染色結(jié)果提示，Osterix陽(yáng)性細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，高效靶標(biāo)于小鼠股骨髓腔內(nèi)。Micro-CT和阿爾新藍(lán)-蘇木精染色結(jié)果顯示，Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除后小鼠股骨出現(xiàn)骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)受損、脂滴形成增多、骨皮質(zhì)厚度降低等骨質(zhì)疏松的特征性表現(xiàn)；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除組股骨ALP表達(dá)量減少、FABP4表達(dá)量增多，提示特異性剔除Osterix陽(yáng)性細(xì)胞可使小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力減弱、向脂肪細(xì)胞分化的能力增強(qiáng)。骨質(zhì)疏松癥屬中醫(yī)學(xué)“骨枯”“骨痿”范疇?！端貑?wèn)·痿論》曰：“腎氣熱則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！边@說(shuō)明Osterix陽(yáng)性細(xì)胞剔除小鼠的表現(xiàn)與“髓減”十分相近。此外，陳光華等[16]的研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可提高骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝水平。鄒振等[17]的研究顯示，基于中醫(yī)“腎主骨生髓”理論的腎髓同治方可在一定程度上防治小鼠骨質(zhì)疏松癥，其機(jī)制主要與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。這些都表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與髓有著相近的特性。

本研究的結(jié)果提示，Osterix陽(yáng)性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮著維持骨穩(wěn)態(tài)的作用。