李建揮，李柏海 *，吳思政，柏文富，禹 霖，聶東伶，嚴(yán)佳文，熊 穎，向祖恒，彭先鳳

(1.湖南省植物園，湖南 長(zhǎng)沙 410116；2.龍山縣林業(yè)局，湖南 龍山 416800)

核桃(Juglansregia)和泡核桃(J.sigillata)是胡桃科核桃屬中廣泛栽培的干果和油料樹種。我國(guó)是核桃生產(chǎn)大國(guó)，核桃產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的一半以上，有20個(gè)省(區(qū)、市)的1 000多個(gè)縣栽培核桃，主要產(chǎn)區(qū)為云南、新疆、陜西、四川、山西、河北、北京、天津、遼寧、山東等地。核桃種質(zhì)資源是核桃產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)和保障，其主要包括核桃的栽培種、野生資源以及利用二者再創(chuàng)造的遺傳材料。我國(guó)最早培育的遼寧系列、中林系列、‘香玲’等核桃良種，就是以新疆早實(shí)核桃為親本與當(dāng)?shù)貙?shí)生農(nóng)家類型雜交選育而來(lái)。近年來(lái)，隨著核桃產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，實(shí)生農(nóng)家類型和自然群體不斷流失和破壞，各地紛紛開展了核桃種質(zhì)資源調(diào)查、收集和評(píng)價(jià)研究，以期摸清核桃種質(zhì)資源的多樣性，為科學(xué)保護(hù)和開發(fā)利用提供依據(jù)[1-2]。

以表型性狀來(lái)檢測(cè)植物變異是一種直觀便捷的方法，能在一定程度上揭示物種遺傳多樣性[3]。核桃堅(jiān)果表型特征是其表型性狀的直觀體現(xiàn)，直接反映區(qū)域內(nèi)核桃資源的多樣性[4-5]。湖南省是核桃的天然分布區(qū)，核桃栽培有上百年的歷史[6]。該地區(qū)長(zhǎng)期采用實(shí)生播種繁殖，樹體常為半野生狀態(tài)，使得核桃資源積累了較豐富的變異，形成了一定數(shù)量的實(shí)生類型群體，是核桃開發(fā)利用的寶貴材料。20世紀(jì)80年代末，何方等[6]對(duì)湖南省的核桃資源進(jìn)行了調(diào)查研究，初步摸清了湖南省核桃資源、優(yōu)良類型以及栽培歷史與現(xiàn)狀。之后，呂芳德團(tuán)隊(duì)在湘西地區(qū)開展了核桃資源調(diào)查、經(jīng)濟(jì)性狀測(cè)定以及堅(jiān)果品質(zhì)分析，選育出了一批優(yōu)良單株[7-8]。王容等[9]比較了湘西北地區(qū)13個(gè)核桃樣品的堅(jiān)果綜合品質(zhì)，但由于采集的資源數(shù)量有限，鮮少涉及堅(jiān)果表型特征研究，未能展現(xiàn)出該地區(qū)核桃資源的多樣性情況。本研究在湖南省核桃遺傳資源調(diào)查的基礎(chǔ)上，以湘西地區(qū)的223份種質(zhì)資源為試材，測(cè)定了堅(jiān)果表型的質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀，分析了該地區(qū)核桃資源的多樣性狀況，以期為湖南省開發(fā)利用核桃種質(zhì)資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

湖南省西部是依據(jù)武陵山脈、雪峰山脈和云貴高原東側(cè)，沅水、澧水中上游及其支流匯聚的地理形勢(shì)自然形成的廣大地區(qū)(108°47′～112°10′E，26°38′～30°08′N)，常被統(tǒng)稱為湘西地區(qū)、湘西或大湘西，主要包括張家界市、湘西土家族苗族自治州、懷化市、邵陽(yáng)市、常德市等[10-12]。該地區(qū)屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，氣候溫暖，降水充沛，光熱偏少，年均氣溫16～17 ℃，年降水量1 300～1 390 mm，年日照1 563.3 h[7]，地貌以山地、丘陵為主，土壤以紅壤、黃壤、石灰土為主，是核桃的自然分布區(qū)和適宜種植區(qū)[13]。

1.2 試材采集及性狀測(cè)定

在核桃和泡核桃資源分布集中區(qū)域，由當(dāng)?shù)亓謽I(yè)部門工作人員做向?qū)?，?shí)地走訪當(dāng)?shù)厝罕?，確定調(diào)查的核桃單株，記錄核桃樹體信息。9月中旬，核桃成熟時(shí)，每個(gè)單株收集50個(gè)核桃果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，待核桃自然風(fēng)干，測(cè)定堅(jiān)果表型性狀。

堅(jiān)果質(zhì)量性狀參照GB/T 26909—2011《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南：核桃屬》[14]進(jìn)行特征描述和賦值，測(cè)試指南中未描述的特征用“其他”表示，共選擇13個(gè)質(zhì)量性狀。堅(jiān)果數(shù)量性狀有8個(gè)，其中的單果質(zhì)量與核仁質(zhì)量用電子天平測(cè)量(精確度0.01 g)，出仁率=核仁質(zhì)量/單果質(zhì)量×100%；堅(jiān)果大小用游標(biāo)卡尺(精確度0.01 mm)測(cè)量，核殼厚度在切開堅(jiān)果后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其胴部位置(精確度0.01 mm)。堅(jiān)果果形指數(shù)=(側(cè)徑+橫徑)/2倍縱徑，三徑均值=(縱徑+側(cè)徑+橫徑)/3。

1.3 數(shù)據(jù)處理

供試的223份核桃樣品來(lái)自湘西地區(qū)的4個(gè)縣、15個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，采樣地信息和樣本數(shù)見表1，堅(jiān)果表型特征賦值描述見表2。

表1 采樣地基本信息及樣本數(shù)Table 1 The ecological and geographical information and sample size of populations

表2 核桃和泡核桃堅(jiān)果表型特征賦值及描述Table 2 The description and assignment of nut quality character for walnut accessions

運(yùn)用Excel 2007計(jì)算表型性狀的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)和分布頻率等，繪制數(shù)量性狀頻率數(shù)據(jù)分布直方圖。進(jìn)一步計(jì)算Simpson 指數(shù)、Shannon-Wiener 指數(shù)[15]、群體間和群體內(nèi)方差分量及表型分化系數(shù)[16]等。用SPSS 19.0進(jìn)行群體間堅(jiān)果表型性狀變異系數(shù)多重比較，根據(jù)表型性狀平均值，采用組間連接法計(jì)算群體間的歐氏距離并進(jìn)行聚類分析。采用GenAlEx 6.5對(duì)群體間歐氏距離與地理距離進(jìn)行Mantel 檢驗(yàn)[17]評(píng)估其相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 堅(jiān)果表型性狀的多樣性分析

2.1.1 質(zhì)量性狀的變異及分布

核桃表型質(zhì)量性狀頻率分布及多樣性指數(shù)見表3，可以看出：核桃堅(jiān)果表型質(zhì)量性狀的變異系數(shù)為18.71%～79.21%，Simpson指數(shù)為0.171～0.823，Shannon-Wiener指數(shù)為0.450～2.760，說(shuō)明湘西核桃質(zhì)量性狀的多樣性較豐富。沿縫合線縱切面形狀圓形較多(30.94%)，心形最少(1.35%)，除核桃屬DUS測(cè)試指南規(guī)定的8種外，還出現(xiàn)了三角形、扁圓形、倒卵形3種其他類型(2.24%)；垂直縫合線縱切面形狀(種形)以圓形較多(30.04%)，其次是扁圓形(23.77%)和方(梯)形(20.18%)，心形(0.90%)和長(zhǎng)橢圓形(0.90%)最少，出現(xiàn)了倒心形、闊紡錘形、“蘋果型”3種其他類型(8.52%)。堅(jiān)果橫切面形狀大多為扁圓形(84.30)，未發(fā)現(xiàn)有內(nèi)凹扁圓形和橢圓形，但出現(xiàn)了1種其他類型(長(zhǎng)方形，0.45%)。頂尖突出程度以尖最多(58.30%)，果肩形狀以平為主(37.67%)，果底形狀以稍凸為主(43.05%)，核殼表面多為刻窩少(42.60%)、刻紋淺(59.64%)的類型?？p合線以2條居多，占比達(dá)89.24%，2～3條和2～4條的資源分別占比6.73%和3.59%,3條的僅出現(xiàn)1份資源，占0.45%，未出現(xiàn)3～4條和4條的資源?？p合線絕大多數(shù)為凸起(90.58%)，縫合線平的有9.42%，未見縫合線凹的資源。橫膈膜質(zhì)地和內(nèi)褶壁質(zhì)地均以革質(zhì)占多數(shù)，分別為65.47%和52.91%。橫膈膜骨質(zhì)占比為23.77%,內(nèi)褶壁骨質(zhì)占比26.01%，說(shuō)明湘西地區(qū)存在較多核桃的原始類型。橫膈膜膜質(zhì)和紙質(zhì)的占比合計(jì)10.77%，內(nèi)褶壁退化的為21.08%，未見內(nèi)褶壁膜質(zhì)資源。核仁皮色多為淺褐(39.46%)，其次為黃(26.46%)、淺黃(13.90%)、褐(13.45%)、黃白(5.83%)、紫褐(0.45%)、淺藍(lán)(0.45%)。

表3 核桃表型質(zhì)量性狀頻率分布及多樣性指數(shù)Table 3 The distributive frequency and diversity index for phenotypic quality traits of walnut

2.1.2 數(shù)量性狀的變異及分布

堅(jiān)果表型數(shù)量性狀的變異情況見表4。由表4可見，以單果質(zhì)量的變異系數(shù)最大，為27.49%；其次為殼厚，變異系數(shù)為26.48%；果形性狀的變異系數(shù)較小，變異范圍在8.37%～11.17%。單果質(zhì)量為5.28～31.70 g，平均13.07 g；殼厚為0.56～2.91 mm，平均1.51 mm；出仁率為29.60%～67.32%，平均37.32%；三徑均值為23.58～40.97 mm，平均30.98 mm；果形指數(shù)為0.74～1.25，平均0.97。各個(gè)堅(jiān)果表型數(shù)量性狀分布直方圖及其偏度系數(shù)(Skewness)和峰度系數(shù)(Kurtosis)見圖2，表明8個(gè)數(shù)量性狀均符合近似正態(tài)分布。單果質(zhì)量以10～14 g居多，占比為49.33%；出仁率多在46%～55%之間，占比為48.88%；殼厚1.0～1.6 mm的比例達(dá)到56.95%，說(shuō)明湘西地區(qū)薄殼核桃占比較大，1.6 mm以上的中厚殼資源占比34.98%，1 mm以下的紙皮核桃占比較少，為8.07%；三徑均值集中在30～34 mm，占比達(dá)50.22%；果形指數(shù)0.97～1.07的占比42.15%。

表4 核桃表型數(shù)量性狀的變異情況Table 4 The variations of phenotypic quantitative traits of walnut

圖1 核桃表型數(shù)量性狀分布Fig.1 The distribution of phenotypic quantitative traits for walnut

2.2 堅(jiān)果表型的變異和分化情況

21個(gè)供試堅(jiān)果表型性狀在15個(gè)群體間的平均變異系數(shù)為7.47%～78.24%，平均為26.47%，各個(gè)表型性狀的變異系數(shù)間有顯著性差異(P<0.05)(表5)，其中變異程度最大的為種形，變異系數(shù)為78.27%，說(shuō)明此性狀變異最豐富。變異程度較小的為堅(jiān)果大小和果形相關(guān)性狀，變異系數(shù)范圍為7.47%～10.39%。群體內(nèi)21個(gè)性狀變異系數(shù)的平均值為20.31%～31.54%，群體間差異不顯著(P>0.05)。

表5(續(xù))

對(duì)核桃堅(jiān)果表型性狀的方差分量進(jìn)行進(jìn)一步分析表明(表6)：21個(gè)堅(jiān)果表型性狀在群體間和群體內(nèi)平均方差分量百分比為64.03%和35.97%，說(shuō)明湘西地區(qū)核桃群體間變異大于群體內(nèi)的變異。其中，果底形狀、刻紋、縫合線突出程度、橫膈膜質(zhì)地、內(nèi)褶壁等5個(gè)質(zhì)量性狀的群體間方差分量顯著大于群體內(nèi)方差分量。數(shù)量性狀除側(cè)徑外，其他性狀的群體間方差分量均顯著大于群體內(nèi)方差分量。堅(jiān)果性狀的表型分化系數(shù)為40.44%～76.15%，平均為64.03%，表型分化系數(shù)最大的是縱徑，最小的是種形。

表6 核桃堅(jiān)果表型性狀的方差分量和表型分化系數(shù)Table 6 The variance component and phenotype differentiation coefficient of nut phenotypic traits of walnut

2.3 堅(jiān)果表型性狀聚類分析

表型性狀數(shù)據(jù)經(jīng)Z-得分轉(zhuǎn)化后，采用組間連接歐氏距離法，對(duì)223份核桃種質(zhì)資源的21個(gè)堅(jiān)果表型性狀平均值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果顯示，在歐氏距離15處，可以將15個(gè)群體劃分為4個(gè)類群(圖2)。

圖2 核桃表型性狀聚類樹狀圖Fig.2 Cluster tree diagram based on phenotypic traits of walnut

龍山縣各個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)和瀘溪縣白羊溪(BYX)資源聚為一大類，渠陽(yáng)(QY)、新關(guān)(XG)以及壺瓶山(HPS)均單獨(dú)為一類。其中，第1大類資源在歐氏距離10處進(jìn)一步分為4個(gè)亞類，農(nóng)車(NC)、洛塔(LT)、召市(ZS)、靛房(DF)、洗車(XC)、茨巖(CY)、茅坪(MP)聚為一類，包含154份樣品，來(lái)源于龍山縣中東大部分地區(qū)，占采集樣品的69.06%；石牌(SP)、洗洛(XL)聚為一類，包括22份樣品，來(lái)源于龍山縣西北地區(qū)；紅巖溪(HYX)聚為一類，含5個(gè)樣品，來(lái)源于龍山縣中部；咱果(ZG)和BYX聚為一類，含14樣品，來(lái)源于龍山縣西南部及瀘溪縣白羊溪鄉(xiāng)，且表型遺傳距離(歐氏距離)與地理距離呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢(shì)(圖3)。

圖3 群體間歐氏距離與地理距離的相關(guān)關(guān)系Fig.3 Geographic distance and Euclidean distance relationship

2.4 堅(jiān)果表型遺傳距離與地理距離的相關(guān)性分析

種群的地理距離和遺傳距離相關(guān)性常用Mantel檢驗(yàn)評(píng)估，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為地理距離和遺傳距離具有顯著相關(guān)性[18]。用SPSS相關(guān)性分析計(jì)算出群體間的歐氏距離，群體間地理距離為采樣點(diǎn)間的直線距離。Mantel檢驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，群體間的歐氏距離與地理距離存在顯著正相關(guān)性(R=0.502，P=0.023)。

3 討 論

表型多樣性是了解遺傳變異的重要線索，也是生物多樣性的重要內(nèi)容[19]，植物資源的開發(fā)利用往往離不開對(duì)表型性狀的測(cè)定和分析[20-23]。本研究首次對(duì)湘西地區(qū)的223份核桃資源的21個(gè)堅(jiān)果表型性狀開展研究，結(jié)果表明該區(qū)域核桃堅(jiān)果表型多樣性豐富，其堅(jiān)果質(zhì)量性狀的變異系數(shù)為18.71%～79.21%，Simpson指數(shù)為0.171～0.823，Shannon-Wiener指數(shù)為0.450～2.760，數(shù)量性狀的變異系數(shù)8.37%～27.49%。除內(nèi)凹扁圓形與橢圓形的堅(jiān)果橫切面形狀，3～4條與4條的縫合線條數(shù)、凹縫合線以及膜質(zhì)內(nèi)褶壁，核桃屬DUS測(cè)試指南中絕大多數(shù)堅(jiān)果表型性狀均有出現(xiàn)。此外，還發(fā)現(xiàn)了3種種形、3種沿縫合線縱切面形狀、1種橫切面形狀和1種新的核仁皮色。

湘西地區(qū)核桃堅(jiān)果表型特異性明顯。核桃種形以圓形、扁圓形以及方(梯)形為主，和昭通市[4]、大理州[24]、怒江州[25]、涼山州[5]以及青海[26]等地相比，主要種形和比例均不相同，且方(梯)形占比達(dá)20.18%，遠(yuǎn)多于上述區(qū)域的1.00%～13.94%。橫膈膜骨質(zhì)和內(nèi)褶壁骨質(zhì)占比均超過(guò)20%，遠(yuǎn)高于其他區(qū)域的2.55%～11.21%和 3.18%～14.29%[4-5,24-25,27]；1.6 mm以上的中厚殼資源占比34.98%，說(shuō)明湘西地區(qū)厚殼核桃占比較大，剝殼取仁較難，存在較多核桃的原始類型。核仁皮色多為淺褐或黃色，占65.92%，特異性核仁皮色比例很低，僅出現(xiàn)淺藍(lán)色和紫褐色資源各一份，未見烏仁、紫(淺紫)仁資源。核桃縫合線條數(shù)特征和其他地區(qū)大同小異，大多數(shù)為2條，2條以上的資源不多見?？p合線平的資源在該地區(qū)比較少見，不到10%，稍高于大理州、怒江州的4%左右[24-25]，與昭通市的14.10%[4]比較接近，低于涼山州的26.97%[5]，遠(yuǎn)低于甘肅的40.95%[27]和新疆的55.20%[28]。從這點(diǎn)看，該地區(qū)核桃表型介于西南地區(qū)的深紋核桃和西北地區(qū)的核桃之間,而且更傾向于深紋核桃。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)16個(gè)早實(shí)核桃品種的單果質(zhì)量為9.40～16.40 g[29]，大巴山區(qū)的為4.11～22.87 g[2]，西藏的為6.87～19.97 g[30]，云南的為3.48～31.80 g[4,24-25]，四川涼山州的為3.29～27.56 g[5]，伊朗的為 6.0～15.2 g[31]，印度的為4.85～20.55 g[32-33]，巴爾干半島西部的為2.9～32.1 g[34]。湘西地區(qū)單果質(zhì)量為5.28～31.70 g，和上述區(qū)域相比，變異范圍非常大，其中中果型占比近50%，小于7 g的小果資源和大于22 g的大果資源各有4份。這些特異性的種質(zhì)資源，為品種選育和生產(chǎn)需求提供了豐富的材料。

劉娟等[35]認(rèn)為，變異系數(shù)在10%以上，表型性狀變異分化比較明顯。本區(qū)域堅(jiān)果表型性狀變異系數(shù)大都在10%以上，說(shuō)明該地區(qū)表型性狀的分化明顯。表型分化系數(shù)平均為64.03%，群體間的表型分化大于群體內(nèi)的表型分化，說(shuō)明變異主要來(lái)源于群體間?？赡苁窃搮^(qū)域核桃長(zhǎng)期在一定范圍內(nèi)種植，商品化程度較低，人為傳播較少，從而造成了群體間的分化。聚類結(jié)果顯示龍山縣各個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)和BYX聚為一大類，QY、XG以及HPS均單獨(dú)聚為一類。壺瓶山是湘鄂兩省分界山，地理環(huán)境和自然環(huán)境和新關(guān)鎮(zhèn)有著很大區(qū)別，故而雖同處一縣，但HPS和XG各自單獨(dú)聚為一類，其遺傳距離與其他群體最遠(yuǎn)。第一大類資源又可進(jìn)一步分為4個(gè)亞類：龍山縣中東大部分地區(qū)、中部的HYX、西北部的SP與XL、西南部ZG與瀘溪縣BYX，群體間的歐式距離與地理距離存在顯著正相關(guān)性。由于表型易受環(huán)境的影響，加上本研究采樣未能涵蓋湘西大多數(shù)區(qū)域，考察的表型性狀有限，僅反映出湘西地區(qū)核桃資源多樣性的一部分內(nèi)容。今后可繼續(xù)采集資源，補(bǔ)充完善，以更加系統(tǒng)、全面地反映區(qū)域內(nèi)核桃資源多樣性，為核桃資源的有效開發(fā)利用提供更多詳實(shí)的數(shù)據(jù)參考。