何東賢，莫紅芳，侯小露，熊曉妍，覃振斌，孫 琪，陳孟姣，劉 平，李軍成

(1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530007；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430000；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

【研究意義】近年來(lái)我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展趨勢(shì)明顯，但養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的糞便也給我國(guó)生態(tài)環(huán)境保護(hù)帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。2020年我國(guó)生態(tài)環(huán)境部、國(guó)家統(tǒng)計(jì)局和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等多個(gè)部門(mén)聯(lián)合發(fā)布的《第二次全國(guó)農(nóng)業(yè)污染源普查公報(bào)》顯示，相較于2010年第一次普查的結(jié)果，畜禽養(yǎng)殖業(yè)排放的化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)含量和總磷(TP)含量均明顯下降[1]，但畜牧養(yǎng)殖的糞污仍是農(nóng)業(yè)污染源的主要來(lái)源和成因[2-3]。好氧堆肥是目前常用的畜禽糞污無(wú)害化處理及資源再利用手段，其實(shí)質(zhì)是微生物分解和轉(zhuǎn)化有機(jī)物的生化代謝過(guò)程，微生物群落的代謝能力和菌群結(jié)構(gòu)是影響堆肥效果的關(guān)鍵因素[4-5]。因此，探究雞糞堆肥過(guò)程中細(xì)菌群落的構(gòu)成及演變規(guī)律，對(duì)深入了解細(xì)菌在雞糞堆肥過(guò)程中的作用、提高堆肥效果和防治畜禽養(yǎng)殖污染具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】王秀紅等[6]研究證實(shí)，不同時(shí)間堆肥的微生物群落在碳源代謝能力、細(xì)菌菌群種類(lèi)和豐度上均存在差異。于靜等[7]研究表明，溫度和pH是影響堆肥菌群變化的主要因素，且厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)在氮素轉(zhuǎn)化和釋放過(guò)程中發(fā)揮重要作用。敖靜等[8]的研究進(jìn)一步表明，堆肥中菌群數(shù)量與堆體溫度、纖維素酶活性和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性呈正相關(guān)，與脲酶和蛋白酶活性無(wú)顯著相關(guān)性。Chen等[9]研究表明，在豬糞便堆肥中厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)是占據(jù)主導(dǎo)地位的菌門(mén)且厚壁菌門(mén)中的乳桿菌屬(Lactobacillus)細(xì)菌能有效降解3-羥基-5-甲基異惡唑(3-MI)，從而有效緩解豬糞便中的異味。已有研究表明，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)等均為雞、牛和豬等畜禽動(dòng)物堆肥中菌群分布的主要菌門(mén)[10-11]。鄧雯文等[12]探索雞糞堆肥中重金屬的殘留、耐藥基因與菌群變化情況，發(fā)現(xiàn)病原菌屬和耐藥基因的相對(duì)豐度均隨著堆肥發(fā)酵時(shí)間的延續(xù)而降低。Cui等[13]研究不同生物炭對(duì)雞糞堆肥過(guò)程中細(xì)菌菌群變化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是否加入生物炭，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)均為占比較高的菌門(mén)，但生物炭的加入能有效降低厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，這與抗性基因的清除作用密切相關(guān)。岳世林等[14]研究表明，細(xì)菌和真菌的多樣性隨著牛糞堆肥過(guò)程溫度的動(dòng)態(tài)變化而變化，且堆肥過(guò)程每個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌群各有不同。蘇鵬偉等[15]、岳松濤等[16]的研究也表明，厚壁菌門(mén)在堆肥各階段均為主要類(lèi)群，而從屬水平來(lái)看堆肥前期和后期的優(yōu)勢(shì)菌群存在明顯差異?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣西屬于熱帶季風(fēng)氣候，高溫多雨，是全國(guó)畜禽養(yǎng)殖大省和華南地區(qū)重要畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)供給地，推進(jìn)畜禽糞便發(fā)酵制成有機(jī)肥是廣西實(shí)施污染防治和促進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重大課題。但目前針對(duì)廣西地區(qū)規(guī)?；u場(chǎng)雞糞堆肥中菌群變化情況的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采用高通量測(cè)序方法分析廣西某規(guī)?；u場(chǎng)糞便堆肥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，了解在當(dāng)?shù)貤l件下不同發(fā)酵階段堆肥的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落，為進(jìn)一步篩選雞糞強(qiáng)降解菌種改善堆肥工藝及提高雞糞堆肥效率以完全清除其潛在病原菌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要堆肥原料為新鮮蛋雞雞糞和木糠，均采集于廣西某規(guī)?；半u養(yǎng)殖場(chǎng)及其堆肥場(chǎng)。將新鮮雞糞(不含墊料)與木糠按質(zhì)量比1∶1混勻后采用條垛方式(長(zhǎng)×寬×高=3.00 m×1.50 m×1.35 m)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵物料初期含水量約為70%，堆肥過(guò)程持續(xù)約1個(gè)月(2021年8—9月)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 取樣時(shí)間為第0天(初始期)(肥堆混勻后馬上采樣)、第4天(升溫期)、第7天、第14天(高溫期)、第21天(降溫期)和第25天(腐熟期)，分別在堆體上層(距離底部105.00 cm)、中層(距離底部65.00 cm)、下層(距離底部30.00 cm)取樣，每個(gè)橫截面隨機(jī)選4個(gè)點(diǎn)，將在同一橫截面收集的樣品均勻混合，每次取樣后翻堆。樣品按照采樣時(shí)間(0～25 d)分為6個(gè)試驗(yàn)組，依次標(biāo)記為A、B、C、D、E和F，堆體上、中和下層取樣分別標(biāo)記為1、2和3，即第0天上層采集的樣品記為A1，中層采集的樣品記為A2，下層采集的樣品記為A3，依次類(lèi)推，直至發(fā)酵第25天取上層樣品記為F1，中層樣品記為F2，下層樣品記為F3，共計(jì)18份樣品(表1)。為比對(duì)效果，同期采集該規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)加入有機(jī)物料腐熟劑并完成發(fā)酵(>30 d)的成品肥料樣品(記為G)和有機(jī)物料腐熟劑[主要成分為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和放線(xiàn)菌(Actinomycetes)]樣品(記為H)。將采集的8個(gè)分組(A～H)共計(jì)20份樣品立即置于液氮罐中儲(chǔ)存，用于細(xì)菌群落分析。

表1 雞糞樣品標(biāo)記信息

1.2.2 高通量測(cè)序 將1.1中采集的20份堆肥樣品送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行基于Illumina NovaSeq平臺(tái)的細(xì)菌16S rDNA V3+V4可變區(qū)高通量測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序完成后采用Trimmomatic version 0.33對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾[17]，然后以 Cutadapt version 1.9.1進(jìn)行引物序列識(shí)別與去除[18]，再以FLASH version 1.2.11對(duì)雙端Reads進(jìn)行拼接[19]，以UCHIME version 8.1去除嵌合體[20]，最終得到高質(zhì)量的序列用于后續(xù)分析。采用USEARCH version 10.0在相似度97%水平對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi)[21]。以Silva為參考數(shù)據(jù)庫(kù)使用樸素貝葉斯分類(lèi)器對(duì)特征序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋[22]，得到每個(gè)特征對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，進(jìn)而在門(mén)、綱、目、科、屬、種(phylum，class，order，family，genus，species)水平統(tǒng)計(jì)各樣品的群落組成，利用QIIME生成不同分類(lèi)水平的物種豐度表[23]，再利用R語(yǔ)言工具繪制樣品在各分類(lèi)學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。對(duì)不同組樣品的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估[24]，包括度量細(xì)菌群落豐度的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)及度量細(xì)菌群落多樣性的Shannon指數(shù)等。最后以L(fǎng)EfSe(LDA effect size)分析堆肥過(guò)程中不同發(fā)酵時(shí)間的組間物種差異，默認(rèn)設(shè)置顯著差異的Logarithmic LDA score為4.0[25]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行整理，以SPSSAU平臺(tái)中獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間樣品的Ace指數(shù)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種分類(lèi)和相對(duì)豐度分析

將20份樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得1490 847條有效序列，其中H組樣品測(cè)得的有效序列最多。對(duì)得到的有效序列數(shù)(Reads)在97%相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)，共得到18 869個(gè)分類(lèi)操作單元(OTU)，其中F2樣品(第25天中層)測(cè)得的OTUs最多，其次為F1樣品(第25天上層)和G樣品(表2)。8個(gè)分組(A～H)共有的OUTs有524個(gè)，其中6個(gè)試驗(yàn)組(A～F)共有的OUTs分別為535、571、550、604、569和685個(gè)。為了比較各樣品中的物種多樣性，將每個(gè)樣品中測(cè)得的序列數(shù)標(biāo)定在45 000條(20份樣品中最少的序列數(shù))。從OTUs稀釋曲線(xiàn)(圖1-A)可看出，F(xiàn)1樣品(第25天上層)的稀釋曲線(xiàn)最陡峭，物種豐富度最高，H樣品(腐熟劑)的稀釋曲線(xiàn)最平滑，物種豐富度最低；當(dāng)測(cè)得的序列數(shù)>40 000時(shí)，各樣品的OTUs稀釋曲線(xiàn)已趨于平緩；各樣品Shannon指數(shù)的稀釋曲線(xiàn)與OTUs稀釋曲線(xiàn)不同，當(dāng)測(cè)得的序列數(shù)<10 000時(shí)已趨于平緩(圖1-B)；各樣品的文庫(kù)覆蓋率(Coverage)均超過(guò)99.50%(表2)，說(shuō)明本次測(cè)序的深度足夠深且數(shù)據(jù)量足夠大，已基本覆蓋樣品中所有的物種信息，可代表本研究堆肥中細(xì)菌菌群分布的真實(shí)情況。

圖1 雞糞樣品的OTUs稀釋曲線(xiàn)和Shannon指數(shù)曲線(xiàn)

表2 不同雞糞樣品中的細(xì)菌豐度和多樣性

對(duì)于在同一位置采集的樣品，隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)，其Ace和Chao1指數(shù)多呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明雞糞堆肥中細(xì)菌菌群的豐富度逐漸提高。采用T檢驗(yàn)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間樣品的Ace指數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)組(第25天采集)的細(xì)菌Ace指數(shù)顯著高于A(yíng)組(第0天采集)、B組(第4天采集)和C組(第7天采集)(P<0.05，下同)，高于D組(第14天采集)、E組(第21天采集)和H組(有機(jī)物料腐熟劑)，低于G組(成品肥料)，但差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明雞糞堆肥能提高其細(xì)菌群落的豐富度，尤其是堆肥后期樣品細(xì)菌群落的豐富度顯著高于堆肥前期，而通過(guò)比較試驗(yàn)組(A～F)與G組的細(xì)菌Ace指數(shù)差異發(fā)現(xiàn)，加入腐熟劑也能提高堆肥中細(xì)菌的豐富度。比較Shannon指數(shù)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落多樣性最高的3份樣品為B1(第4天上層)、E3(第21天下層)和G，最低的3份樣品為H、F3(第25天下層)和E1(第21天上層)；A1～F1樣品(堆肥上層)細(xì)菌群落的相對(duì)豐度隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升再下降最后又略微上升的變化趨勢(shì)，B2～F2樣品(中層)也表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，但A3～F3樣品(下層)的表現(xiàn)與A1～F1樣品相反，其細(xì)菌群落的相對(duì)豐度呈先下降后上升最后急劇下降的變化趨勢(shì)，說(shuō)明不同發(fā)酵時(shí)期堆肥中的細(xì)菌群落多樣性均處于動(dòng)態(tài)變化中；通過(guò)對(duì)比G和H樣品的Shannon指數(shù)得出，腐熟劑(H)作為微生物制劑其多樣性最低屬于正?，F(xiàn)象，而加入腐熟劑并完成發(fā)酵(>30 d)的成品肥料(G)表現(xiàn)出比同時(shí)期的F樣品(第25天采集)更高的細(xì)菌群落多樣性，說(shuō)明腐熟劑能改變并提高堆肥中的細(xì)菌群落多樣性。

*表示樣品間差異顯著(P<0.05)。

2.2 堆肥中細(xì)菌的門(mén)水平分類(lèi)和屬水平分類(lèi)

本研究共檢測(cè)到26門(mén)57綱133目245科530屬細(xì)菌，但僅將物種相對(duì)豐度排在前10位的菌門(mén)(屬)分開(kāi)展示，而相對(duì)豐度較小的門(mén)(屬)合并為 Others(圖3)。

從門(mén)水平來(lái)看(圖3-A)，各組樣品的細(xì)菌均以厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、鹽厭氧菌門(mén)(Halanaerobiaeota)、擬桿菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)5個(gè)菌門(mén)為主。其中，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)呈先下降后上升變化趨勢(shì)，變形菌門(mén)的相對(duì)豐度從第0天(A樣品)的21.90%下降到第25天(F樣品)時(shí)的8.46%；與變形菌門(mén)的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)相反，鹽厭氧菌門(mén)的相對(duì)豐度呈不斷上升趨勢(shì)(由A樣品的0.02%上升至F樣品的21.84%)；擬桿菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)的相對(duì)豐度均較穩(wěn)定，未觀(guān)察到明顯的變化趨勢(shì)。在堆肥試驗(yàn)組(A～F)中，厚壁菌門(mén)在堆肥每個(gè)發(fā)酵階段的相對(duì)豐度均最高，其中在第7天(C組)中細(xì)菌的相對(duì)豐度最高(68.76%)，其次是在第0天(A組，67.31%)和第4天(B組，62.74%)，該菌門(mén)的相對(duì)豐度隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，但在第21天(E組)后出現(xiàn)微小回升(54.53%，F(xiàn)組)。而在加入腐熟劑并完成發(fā)酵(>30 d)的成品肥料(G組)和腐熟劑(H組)中，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度在各發(fā)酵階段均最高，尤其以腐熟劑(H組)中的相對(duì)豐度(83.79%)更高，說(shuō)明厚壁菌門(mén)在堆肥的各個(gè)發(fā)酵階段均為優(yōu)勢(shì)菌群；變形菌門(mén)在第0天(A組)中的相對(duì)豐度最高(21.90%)，其次是在第4天(B組，15.29%)和第14天(D組，13.96%)，至堆肥的第25天后降至8.47%，說(shuō)明該菌門(mén)為堆肥初期的優(yōu)勢(shì)菌群；鹽厭氧菌門(mén)在第0天(A組)和腐熟劑(H組)中相對(duì)豐度僅為0.02%和0.05%，逐漸升高到第21天(E組)和第25天(F組)中的21.74%和21.84%，成為堆肥后期占比僅次于厚壁菌門(mén)的優(yōu)勢(shì)菌群；厭氧菌門(mén)中的細(xì)菌均為厭氧菌，且在G組僅觀(guān)測(cè)到極低的相對(duì)豐度，推測(cè)原因可能是試驗(yàn)肥堆通風(fēng)不佳和氧氣含量不足所致。

從屬水平來(lái)看(圖3-B)，各樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌變化明顯，主要集中在乳桿菌屬、鹽胞菌屬(Halocella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)和埃希氏-志賀菌屬(Escherichia-shigella)；乳桿菌屬為堆肥起始階段的優(yōu)勢(shì)菌屬，從第0天(A組)時(shí)相對(duì)豐度最高(33.43%)逐漸下降到第25天(F組)時(shí)的1.17%；與乳桿菌屬相反，鹽胞菌屬和芽孢桿菌屬分別從第0天(A組)時(shí)極低的相對(duì)豐度(0.02%和0.08%)逐步上升到第25天(F組)時(shí)的21.84%和17.20%，但在G組中，僅觀(guān)測(cè)到較低豐度的鹽胞菌屬(4.04%)，說(shuō)明添加腐熟劑確實(shí)能改變堆肥細(xì)菌群落的相對(duì)豐度。此外，有2種潛在致病菌屬(腸球菌屬和埃希氏-志賀菌屬)的相對(duì)豐度均從發(fā)酵開(kāi)始時(shí)(A組)的12.43%和9.62%逐漸下降到發(fā)酵結(jié)束時(shí)(F組)的0.25%和0.65%，說(shuō)明堆肥發(fā)酵確實(shí)能有效降低雞糞中潛在致病菌的相對(duì)豐度。

圖3 雞糞堆肥樣品在門(mén)(A)和屬(B)分類(lèi)水平上的細(xì)菌種類(lèi)和相對(duì)豐度比較

2.3 不同分組間的LEfSe分析結(jié)果

對(duì)各樣品進(jìn)行LEfSe分析(P<0.05，LDA>4.0)，結(jié)果(圖4)顯示，從門(mén)水平到屬水平，共有75個(gè)物種組間存在顯著差異，包括2門(mén)5綱11目16科17屬24種，其中第0天(A組)存在組間顯著差異的物種最多，有19個(gè)，第4天(B組)和第14天(D組)存在組間顯著差異的物種最少，均為2個(gè)；從門(mén)水平(圖4-A)看，鹽厭氧菌門(mén)在第25天(F組)中的相對(duì)豐度顯著高于其他組，軟壁菌門(mén)(Tenericutes)在第7天(C組)中的相對(duì)豐度顯著高于其他組；在屬水平(圖4-B)上，堆肥起始階段第0天(A組)共有4個(gè)菌屬的相對(duì)豐度顯著高于其他組，分別為乳桿菌屬、腸球菌屬、韋榮氏球菌屬(Veillonella)和庫(kù)特氏菌屬(Kurthia)，其中腸球菌屬、韋榮氏球菌屬和庫(kù)特氏菌屬均是潛在的致病菌屬，可見(jiàn)，雞糞發(fā)酵前期堆肥中所含潛在致病菌屬的相對(duì)豐度顯著高于發(fā)酵后期，說(shuō)明堆肥確實(shí)能降低相關(guān)致病菌的相對(duì)豐度。而在堆肥后期的第25天(F組)有3個(gè)菌屬的相對(duì)豐度顯著高于其他組，包括鹽胞菌屬等。

圖4 不同雞糞樣品組中差異物種的進(jìn)化分支圖(A)和LDA分布情況(B)比較

3 討 論

本研究采用Illumina NovaSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)堆肥處理雞糞中的細(xì)菌群落進(jìn)行測(cè)序分析，共獲得1490 847條有效序列，其中作為有機(jī)質(zhì)腐熟劑的H樣品測(cè)得有效序列最多，其物種多樣性最低且以芽孢桿菌屬為主要構(gòu)成，與有機(jī)物料腐熟劑產(chǎn)品的主要成分要求相符，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可靠，能提供可供分析的有效數(shù)據(jù)；OTUs稀釋曲線(xiàn)和Shannon指數(shù)稀釋曲線(xiàn)在序列數(shù)達(dá)到一定量后均趨于平緩，且各樣品的文庫(kù)覆蓋率均超過(guò)99.50%，說(shuō)明測(cè)序的廣度和深度已基本覆蓋樣品中所有的物種信息，能滿(mǎn)足開(kāi)展研究的需求。

Alpha多樣性是指某個(gè)特定區(qū)域的物種豐度或多樣性，Ace和Chao1指數(shù)越大說(shuō)明物種總數(shù)越多，而Shannon指數(shù)越大說(shuō)明物種多樣性越高。本研究發(fā)現(xiàn)，雞糞堆肥不同分層的細(xì)菌Alpha多樣性各不相同，且不同發(fā)酵時(shí)期堆肥中的細(xì)菌群落多樣性一直處于動(dòng)態(tài)變化中，將在同一位置采集的樣品放在一起比較可發(fā)現(xiàn)堆肥上層樣品(A1～F1)中細(xì)菌群落的相對(duì)豐度隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升再下降最后又略微上升的變化趨勢(shì)，中層樣品(B2～F2)也表現(xiàn)出相似的規(guī)律，但下層樣品(A3～F3)細(xì)菌群落的相對(duì)豐度呈先下降后上升最后急劇下降的變化趨勢(shì)，與堆肥上層表現(xiàn)相反，推測(cè)是各部分樣品含氧量不同而引起，與蘇鵬偉等[15]、Hu等[26]的研究結(jié)果略有不同，可能與本研究選擇將上、中和下層樣品分開(kāi)測(cè)序有關(guān)。

本研究中，雞糞堆肥不同發(fā)酵時(shí)期的細(xì)菌群落構(gòu)成存在明顯差異，表明在堆肥各發(fā)酵時(shí)期均有適合的細(xì)菌在堆肥中發(fā)揮不同功能，與鄧雯文等[12]、岳壽松等[16]、黃雅楠等[27]的研究結(jié)果相似；從門(mén)水平來(lái)看，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是堆肥中占比最多的細(xì)菌，其中厚壁菌門(mén)在堆肥的每個(gè)發(fā)酵階段均為主要類(lèi)群(占比均超過(guò)50.00%)，這主要得益于其對(duì)惡劣環(huán)境較強(qiáng)的抵抗能力，該菌門(mén)主要來(lái)源于動(dòng)物的排泄物，其主要功能為分解碳水化合物，表明其在堆肥過(guò)程中一直有碳水化合物降解和轉(zhuǎn)化伴隨[26]；變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)屬于嗜中溫并在有機(jī)質(zhì)降解中發(fā)揮重大作用的細(xì)菌，這2個(gè)菌門(mén)在堆肥高溫期的相對(duì)豐度有所降低，之后在降溫期有所升高，與蘇鵬偉等[15]研究得出的結(jié)果相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，鹽厭氧菌門(mén)的相對(duì)豐度隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，其最高占比可達(dá)21.84%，該菌門(mén)屬于厭氧菌[28]，推測(cè)與與廣西地區(qū)8—9月濕度較高、肥堆不易完全攪拌而造成含氧量不足有關(guān)。從屬水平來(lái)看，乳桿菌屬作為堆肥初期的優(yōu)勢(shì)菌屬，隨著堆肥的時(shí)間的延長(zhǎng)其優(yōu)勢(shì)地位逐漸下降，與鄧雯文等[12]、黃雅楠等[27]的研究結(jié)果相似；類(lèi)似鹽胞菌屬和芽孢桿菌屬屬于耐熱、耐鹽菌屬，其優(yōu)勢(shì)地位會(huì)隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)不斷上升，逐漸成為肥堆中的優(yōu)勢(shì)菌屬，而腸球菌屬和埃希氏-志賀菌屬是來(lái)源于動(dòng)物的潛在致病菌屬，其優(yōu)勢(shì)地位下降至極低水平。說(shuō)明堆肥發(fā)酵確實(shí)能有效降低雞糞中的潛在致病菌含量，但未能完全清除。

本研究結(jié)果表明，A組雞糞發(fā)酵開(kāi)始時(shí)其腸球菌屬、韋榮氏球菌屬和庫(kù)特氏菌屬等3個(gè)潛在致病菌屬的相對(duì)豐度均顯著高于其他組，說(shuō)明堆肥發(fā)酵能有效降低雞糞中的潛在致病菌的相對(duì)豐度。韋榮氏球菌屬是分布于人和動(dòng)物的口腔、咽部、呼吸道、消化道中的常在菌群，很少在堆肥發(fā)酵類(lèi)的研究中被提及，但有研究報(bào)道表明其在一些嚴(yán)重感染或混合感染中發(fā)揮不可忽視的作用[29-30]。與韋榮氏球菌屬相似，庫(kù)特氏菌屬也極少在相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)，該菌屬可用于治理環(huán)境污染[如降解多環(huán)芳烴(PAH)和抗生素]，但在我國(guó)也有該菌導(dǎo)致奶牛發(fā)生乳腺炎的報(bào)道[31]。畜禽糞便不僅會(huì)污染生態(tài)環(huán)境，其本身帶有的一些人畜共患菌屬也給公共衛(wèi)生防控帶來(lái)較大的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)展雞糞堆肥相關(guān)研究，探索其中的風(fēng)險(xiǎn)因子并提高堆肥發(fā)酵效率顯得極為重要。

4 結(jié) 論

雞糞在堆肥發(fā)酵過(guò)程中其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生變化，厚壁菌門(mén)為雞糞堆肥各發(fā)酵階段的主要類(lèi)群，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)主要存在溫度較低的發(fā)酵階段；首次發(fā)現(xiàn)鹽厭氧菌門(mén)在雞糞堆肥過(guò)程中的相對(duì)豐度占比較高，并隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高；堆肥發(fā)酵能顯著降低雞糞中潛在病原菌屬的相對(duì)豐度。