曾夢清，董蘭芳，許明珠，劉海娟，游出超，龍子揚，林立蔚，李世才，彭慧婧

(1.廣西海洋研究所有限責(zé)任公司/廣西海水養(yǎng)殖新品種繁育工程技術(shù)研究中心，廣西 北海 536000；2.廣西科學(xué)院，南寧 530007)

【研究意義】裸體方格星蟲(Sipunculusnudus)俗稱沙蟲，又稱沙腸子、方格星蟲，主要棲息在沙質(zhì)底的沿海灘涂中，在我國廣東、廣西、海南、福建和山東等沿海地區(qū)均有分布，尤其以北部灣海域資源最豐富[1-2]。據(jù)報道，方格星蟲含有豐富的氨基酸、脂肪酸、多糖及多種礦物質(zhì)元素，同時含有多種活性物質(zhì)，具有提高免疫力、抗疲勞和抗血栓等醫(yī)學(xué)功效[3-6]。近年來，野生方格星蟲數(shù)量銳減，廣東和廣西兩地順應(yīng)市場需求，積極開展方格星蟲灘涂養(yǎng)殖。為擺脫苗種限制，擴大養(yǎng)殖規(guī)模，廣西海洋研究所開發(fā)了規(guī)?；斯び缂夹g(shù)，經(jīng)過室內(nèi)繁育和室外池塘中培，生產(chǎn)了大量苗種。但目前市場上尚無高效的方格星蟲專用配合飼料，養(yǎng)殖戶多使用各種魚料或蝦料進行池塘中培，不僅成本較高，苗種存活率也受到影響。因此，研發(fā)高效的專用人工配合飼料已成為推動方格星蟲苗種產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要內(nèi)容。【前人研究進展】廣西海洋研究所研發(fā)團隊在三大營養(yǎng)元素(糖、蛋白和脂肪)[7-9]及單一微量元素(銅和鐵)[10-11]的最適量研究中取得一定進展，已明確方格星蟲專用飼料中銅的最適添加量為11.2 mg/kg及鐵的最適添加量為115.6 mg/kg時，方格星蟲的增重率最大。但各微量元素間存在復(fù)雜的相互作用，當飼料中同時添加多種微量元素時，微量元素間可能產(chǎn)生拮抗或促進作用，因此飼料中單一微量元素的最適添加量不能作為多元素飼料中微量元素的最適添加量，需進行多因素互作效應(yīng)下的最適量探討。銅和鐵均屬于生物體內(nèi)的必須微量元素[12-13]，分析其在飼料中互作效應(yīng)下方格星蟲稚蟲生長和生理機能的變化情況，對推動方格星蟲稚蟲人工配合飼料的研發(fā)進程具有重要意義。銅與生物體的抗氧化功能緊密相關(guān)，是細胞色素氧化酶(CO)、超氧化物歧化酶(SOD)和賴氨酸氧化酶(LOX)等的主要構(gòu)成成分，通過影響上述氧化酶、拮抗鐵和鋅等微量元素或有害物質(zhì)的毒性而參與機體免疫和代謝活動[14-16]。已有研究發(fā)現(xiàn)，適量銅對水生動物的生長具有明顯促進作用，郭志勛等[17]在基礎(chǔ)飼料中添加0～45.0 mg/kg銅飼喂凡納濱白對蝦(Litopenaeusvannamei)，結(jié)果表明銅添加水平為30.0 mg/kg的對蝦生長速度顯著高于其他添加水平。但過量銅會抑制動物生長，甚至?xí)箼C體產(chǎn)生中毒癥狀，導(dǎo)致死亡[18]。葉超霞等[19]對斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的研究發(fā)現(xiàn)，飼料銅含量升高到1127.51 mg/kg時，斜帶石斑魚的增重率、飼料效率顯著降低。Lee等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼料銅含量超過80.0 mg/kg時，斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)的存活率顯著降低，當飼料銅含量為160.0 mg/kg時，存活率降低至22.22%。銅與鐵的轉(zhuǎn)運與吸收關(guān)系密切[12]，因為鐵被吸收后以二價鐵離子形式進入血漿，而血漿銅藍蛋白參與鐵的氧化還原過程，因此機體缺銅時血漿銅藍蛋白不足，可引起對鐵元素的吸收和利用障礙。鐵在方格星蟲體腔液中含量較高[13]，是細胞色素酶(CYP)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)的重要組成部分，在氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮傳遞氫的作用，主要參與體內(nèi)氧的轉(zhuǎn)換、變換和組織呼吸過程，維持生物體的生命活動[21]。由于鐵是一種造血元素，因此缺鐵時動物體的血紅蛋白數(shù)量減少，造成各器官供氧減少，導(dǎo)致機體出現(xiàn)缺氧癥狀[22]，如河鯰(Silurusasotus)在缺鐵時呈現(xiàn)血球容積比、血紅素和紅細胞比例下降的現(xiàn)象[23]。不同生物對各種微量元素的需求量不同，且微量元素間存在拮抗或促進的相互作用[12]。劉寶娟[24]研究了鐵和銅對皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)生長的影響，結(jié)果表明，在鐵含量為1300.0 mg/kg和銅含量為80.0 mg/kg時皺紋盤鮑的生長率最高，銅和鐵含量對皺紋盤鮑的增重率具有顯著交互作用。【本研究切入點】銅和鐵元素屬于微量元素中占比較高的元素，且對動物的生理生化功能具有重要作用，但目前關(guān)于飼料多因素效應(yīng)對水生動物影響的研究報道僅見于魚類和貝類[24-27]，有關(guān)多種微量元素互作效應(yīng)對方格星蟲生長和生理機能影響的研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】在方格星蟲稚蟲飼料的銅元素最適添加量為11.2 mg/kg[10]、鐵元素最適添加量為115.6 mg/kg[11]基礎(chǔ)上以低量、適量、過量的銅和鐵飼料飼喂方格星蟲稚蟲，探究銅與鐵互作效應(yīng)對方格星蟲稚蟲生長、存活、體成分及相關(guān)酶活性的影響，確定飼料中有機銅和鐵的適宜添加量，以期為開發(fā)出經(jīng)濟、環(huán)保、高效的方格星蟲人工配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

根據(jù)方格星蟲銅和鐵單因素試驗結(jié)果[10-11]，分別選擇7.8(低量)、13.2(適量)和23.5 mg/kg(過量)銅含量梯度及61.5(低量)、120.6(適量)和243.7 mg/kg(過量)鐵含量梯度制作方格星蟲稚蟲飼料并開展養(yǎng)殖試驗。預(yù)先制作基礎(chǔ)飼料，再用蛋氨酸銅和蛋氨酸鐵調(diào)節(jié)試驗飼料中的銅和鐵元素含量。基礎(chǔ)飼料配方參考許明珠等[28]的方法進行配制，主要由酪蛋白(40%)、糊精(20%)、微晶纖維素(14%)、明膠(10%)、魚油(8%)、褐藻酸鈉(3%)、卵磷脂(2%)組成，再添加1.5%維生素預(yù)混料和1.5%復(fù)合礦物鹽。采用3×3完全隨機試驗設(shè)計，將基礎(chǔ)飼料分為9組，3個水平(7.8、13.2和23.5 mg/kg)銅(以蛋氨酸銅形式)和3個水平(61.5、120.6和243.7 mg/kg)鐵(以蛋氨酸鐵形式)隨機組合后添加于基礎(chǔ)飼料中，制成9種飼料飼喂方格星蟲稚蟲。詳細添加量如表1所示。試驗用方格星蟲稚蟲為廣西海洋研究所有限責(zé)任公司自主繁育的苗種。

表1 各處理飼料的銅和鐵含量

飼料制作方法：先將主要原料粉碎后過100目篩網(wǎng)，然后按照配方逐步稱重，使用混合機將原料混合均勻，再與魚油和水充分混勻，用機器制成過100目篩網(wǎng)的微顆粒飼料并烘干至恒重，冷卻后裝入密封袋標號冷藏備用。

1.2 養(yǎng)殖方法

養(yǎng)殖試驗于2018年8—10月在廣西海洋研究所有限責(zé)任公司海水增養(yǎng)殖基地進行，為期8周。

挑選自然狀態(tài)下體長1.3～1.8 cm、平均體質(zhì)量(16.12±0.26)mg/條的同批次健康稚蟲8100條，以300條為1個重復(fù)，3個重復(fù)為1組，隨機分成9組，分別飼喂9種不同水平銅和鐵元素的人工微顆粒飼料(處理1～9)。每個重復(fù)均使用65 cm×55 cm×45 cm的長方體整理箱作為方格星蟲稚蟲棲息地，整理箱底部鋪設(shè)一層5 cm的細砂，加滿砂濾海水。每天8：00和17：00換水1/3后投喂飼料，開始時按照放苗總體質(zhì)量的10%投喂，之后根據(jù)飼料殘留情況調(diào)整，以稍過量投喂為宜。養(yǎng)殖整理箱內(nèi)布置1個氣石，24 h連續(xù)充氣，保持溶解氧在5.0 mg/L以上。水溫保持在27～30 ℃，鹽度控制在18‰～25‰，白天光照在3000～8000 lx。

1.3 測定項目及方法

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，用砂濾海水將砂層中的稚蟲翻洗出來，轉(zhuǎn)移至裝有砂濾海水的小整理箱中停食排沙24 h，期間連續(xù)充氣。待稚蟲消化道內(nèi)的沙子完全排出后，稱量各處理稚蟲總重，同時清點并記錄稚蟲存活數(shù)，用以下公式計算各處理方格星蟲稚蟲的增重率、特定生長率和存活率。

增重率(%)=(Mt-M0)/M0×100

特定生長率(%/d)=(lnMt-lnM0)/t×100

存活率(%)=Nt/N0×100

式中，N0為初始稚蟲條數(shù)，Nt為終末稚蟲條數(shù)，M0為初始平均體質(zhì)量，Mt為終末平均體質(zhì)量，t為試驗天數(shù)。

飼料常規(guī)成分和稚蟲體成分采用AOAC[29]的方法進行測定。使用105 ℃烘箱將稚蟲烘干至恒重測定水分含量，以凱氏定氮法(Kjeltec 8400，瑞典)測定粗蛋白含量，以索氏抽提法(Soxtec 2050，瑞士)測定粗脂肪含量，以550 ℃高溫灼燒法測定灰分含量。蟲體銅和鐵元素含量參照GB 13885—2003《動物飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定 原子吸收光譜法》的方法進行測定。方格星蟲稚蟲蟲體(包括體壁和體腔液)勻漿液CAT活性(U/mg)按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明進行測定。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計和方差分析，以Tukey’s進行多重比較，以Excel 2003繪制折線圖，圖中折線平行表示無互作效應(yīng)，相交表示存在互作效應(yīng)[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中銅與鐵互作效應(yīng)對方格星蟲稚蟲生長的影響

由表2可知，至養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，不同銅和鐵含量飼料對各處理稚蟲的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長率和存活率均具有顯著影響(P<0.05，下同)。其中，處理2(銅含量為7.8 mg/kg、鐵含量為120.6 mg/kg)稚蟲的增重率和特定增長率最高；當鐵含量為適量(120.6 mg/kg，處理2、5和8)時，改變銅含量其特定生長率無顯著差異(P>0.05，下同)；當鐵含量為低量(61.5 mg/kg，處理1、4和7)時，適量銅和過量銅處理(處理4和7)稚蟲的增重率和特定生長率均較高，且均高于低量銅處理(處理1)的增重率和特定生長率；當鐵含量為過量(243.7 mg/kg，處理3、6和9)時，方格星蟲稚蟲的增重率和特定生長率均低于適量鐵處理(處理2、5和8)，低銅處理3的增重率、特定生長率比適量銅處理6高，但差異不顯著，處理3稚蟲的存活率與處理6差異顯著。

表2 飼料中銅和鐵水平對方格星蟲稚蟲生長的影響

從圖1～2可看出，銅含量為7.8 mg/kg、鐵含量為120.6 mg/kg時，方格星蟲稚蟲的增重率和特定生長率最高；當銅含量一定時，增重率和特定生長率隨著鐵含量的增加呈先升后降的變化趨勢。圖1～2中折線相交，說明飼料中的銅和鐵元素對方格星蟲稚蟲的增重率和特定生長率呈現(xiàn)明顯的互作效應(yīng)。

圖1 銅與鐵互作效應(yīng)對方格星蟲稚蟲增重率的影響

圖3結(jié)果表明，當銅含量為7.8 mg/kg時，方格星蟲稚蟲的存活率隨著鐵含量的增加而上升，推測此時存活率主要受鐵含量的影響；當銅含量增加到13.2或23.5 mg/kg時，存活率隨著鐵含量的增加呈先升后降的變化趨勢；當鐵含量偏低(61.5 mg/kg)時，銅含量13.2 mg/kg處理(處理4)的存活率最低，但當鐵含量偏高(243.7 mg/kg)時，銅含量23.5 mg/kg處理(處理9)的存活率最低；圖3中折線相交，說明飼料中銅和鐵元素對方格星蟲稚蟲的存活率呈現(xiàn)明顯的互作效應(yīng)。

圖3 銅與鐵互作效應(yīng)對方格星蟲稚蟲存活率的影響

2.2 飼料銅和鐵水平對方格星蟲稚蟲體成分的交互影響

由表3可知，各處理方格星蟲稚蟲的水分含量為81.45%～82.38%，粗蛋白含量為60.40%～66.58%，粗脂肪含量為1.41%～1.70%，灰分含量為21.04%～24.84%。上述指標在各處理間均無顯著差異，說明飼料中不同銅和鐵含量對方格星蟲稚蟲體成分指標無明顯影響。

表3 銅鐵互作效應(yīng)下的方格星蟲稚蟲體成分比較

圖2 銅與鐵互作效應(yīng)對方格星蟲稚蟲特定生長率的影響

2.3 飼料中銅和鐵水平對方格星蟲稚蟲CAT活性的交互影響

由表4可知，各處理的方格星蟲稚蟲CAT活性在2.24～2.81 U/mg，各處理間均無顯著差異，表明飼料中不同銅和鐵含量對方格星蟲稚蟲CAT活性無明顯影響；當鐵含量為61.5 mg/kg(處理1、4和7)時，方格星蟲稚蟲CAT活性較低；當鐵含量增加到120.6 mg/kg以上(處理2、5、8及處理3、6、9)時，方格星蟲稚蟲CAT活性相對較高但差異不顯著，即當銅含量一定時，蟲體CAT活性隨著鐵含量增加呈先增后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。可見，方格星蟲稚蟲CAT活性主要受飼料鐵含量影響。從圖4可看出，銅含量為7.8 mg/kg的折線與13.2 mg/kg的折線不相交，說明當銅含量在13.2 mg/kg以下時，銅和鐵元素含量對蟲體CAT活性無明顯互作效應(yīng)；銅含量為23.5 mg/kg的折線與另2條折線均相交，說明當銅元素過量(23.5 mg/kg)時，銅和鐵元素含量對蟲體CAT活性呈現(xiàn)出一定的互作效應(yīng)。

圖4 銅與鐵互作效應(yīng)下的方格星蟲稚蟲CAT活性比較

表4 不同銅和鐵含量飼料對方格星蟲稚蟲CAT活性的影響

2.4 飼料中銅和鐵水平對方格星蟲稚蟲蟲體銅和鐵含量的影響

由表5可知，方格星蟲稚蟲蟲體銅含量隨著飼料銅含量的增大而增加。其中，低量銅處理(處理1、2和3)的蟲體銅含量為3.14～3.22 μg/g，顯著低于適量銅處理(處理4、5和6)和過量銅處理(處理7、8和9)；適量銅處理(處理4、5和6)和過量銅含量處理(處理7、8和9)的蟲體銅含量為4.75～5.33 μg/g，二者間無顯著差異?？梢姡阢~含量梯度范圍內(nèi)，蟲體銅含量與飼料銅含量呈正比關(guān)系。從表5還可看出，方格星蟲稚蟲蟲體鐵含量在226.71～244.06 μg/g時，各處理間無顯著差異，其中，當銅含量偏低(處理1、2和3)和過量(處理7、8和9)時，蟲體鐵含量隨著飼料鐵含量的增大而增加，當銅含量為適量(處理4、5和6)時，蟲體鐵含量隨著飼料鐵含量增加呈先升后降的變化趨勢。

表5 銅與鐵互作效應(yīng)下的方格星蟲稚蟲蟲體銅和鐵含量比較

從圖5～6折線的相交和平行情況可看出，飼料銅和鐵含量對方格星蟲稚蟲蟲體銅含量無明顯互作效應(yīng)，但對蟲體鐵含量表現(xiàn)出明顯的互作效應(yīng)。

圖5 銅與鐵互作效應(yīng)下的方格星蟲稚蟲蟲體銅含量

3 討 論

礦物質(zhì)作為多種酶構(gòu)成成分和活性成分的中心，能調(diào)節(jié)或激活酶的活性，從消化、吸收和利用等各層次調(diào)控能量和蛋白在動物體內(nèi)的代謝過程，是動物的必需營養(yǎng)素和機體必需成分，具有不可替代的生理生化作用[30-31]。已有研究表明，微量元素的化學(xué)形式是影響其利用率的主要因素之一[32-33]。本研究選擇利用率較高的氨基酸微量元素螯合物蛋氨酸銅和蛋氨酸鐵添加到方格星蟲基礎(chǔ)飼料中，并根據(jù)方格星蟲銅和鐵單因素試驗結(jié)果[10-11]選取2種元素的低量、適量和過量3個梯度設(shè)計完全隨機組合試驗，結(jié)果表明，不同銅和鐵含量飼料對方格星蟲稚蟲生長和存活均具有顯著影響。其中，銅含量為7.8 mg/kg、鐵含量為120.6 mg/kg處理方格星蟲稚蟲的增重率和特定增長率最高；當鐵含量為適量(120.6 mg/kg)時，改變銅含量的方格星蟲其特定生長率間無顯著差異，因此推測方格星蟲稚蟲的生長率主要受鐵元素影響，或鐵元素的作用大于銅元素，與盧彩霞[34]對花魚骨(HemibarbusmaculatusBleeker)飼料的研究結(jié)果一致。

圖6 銅與鐵互作效應(yīng)下的方格星蟲稚蟲蟲體鐵含量

已有研究表明，銅和鐵元素在機體內(nèi)具有協(xié)同作用[35]，銅作為造血反應(yīng)的促媒催化鐵合成血紅蛋白和生成紅細胞，同時參與鐵的轉(zhuǎn)運。但也有研究指出，過量的銅可抑制鐵的吸收[36]?？梢姡~與鐵的交互作用復(fù)雜多變，且可能與生物體所處生長階段及使用的微量元素是否過量有一定關(guān)系。本研究中，當鐵含量適量時，銅含量高低對方格星蟲稚蟲的生長和成活無顯著影響，而當鐵含量為低量或過量時，銅與鐵產(chǎn)生互作效應(yīng)，使方格星蟲稚蟲的生長和成活指標隨著銅含量的變化而變化。

本研究結(jié)果顯示，飼料中不同銅和鐵添加量對方格星蟲稚蟲體成分無顯著影響，與已報道的單因素銅或單因素鐵對方格星蟲稚蟲體成分影響的研究結(jié)果一致[10-11]，也與單因素銅或鐵對草魚(Ctenopharyngodonidellus)[37]、羅非魚(Oreochromisniloticus)[38]和黃鱔(Monopterusalbus)[39]體成分無顯著影響的研究結(jié)果一致，究其原因可能是生物體自身物質(zhì)合成是復(fù)雜的過程，微量元素雖然是生物體代謝過程中不可或缺的因素，但多數(shù)起著輔助促進作用[29]，會影響體內(nèi)大分子物質(zhì)的代謝速度，但對體組織成分質(zhì)量的影響較小。

CAT可清除自由基，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶，1分子酶蛋白中含有4個鐵原子，因而鐵對CAT活性起著不可或缺的作用[30]。單因素鐵營養(yǎng)試驗結(jié)果表明，當鐵水平達115.6 mg/kg時，CAT活性達最大值(3.62 U/mg)，4組高鐵水平飼料組(61.3、l15.6、283.7和482.1 mg/kg)間的CAT活性無顯著差異[11]。本研究中，飼料鐵含量梯度為61.5、120.6和243.7 mg/kg，各處理間的CAT活性無顯著差異，與許明珠等[11]的研究結(jié)果一致，但CAT活性最大值為2.81 U/mg，略低于單因素鐵營養(yǎng)試驗中的方格星蟲蟲體CAT活性最大值，可能是受銅鐵互作效應(yīng)影響；當銅含量在13.2 mg/kg以下時，銅和鐵元素對方格星蟲蟲體CAT活性無明顯互作效應(yīng)；當銅含量過量(23.5 mg/kg)時，銅和鐵對方格星蟲蟲體CAT活性呈現(xiàn)一定的互作效應(yīng)，可能是CAT活性本身主要受鐵元素影響，在銅含量低時，銅與鐵互作效應(yīng)不明顯，而當銅含量過量時，銅元素對CAT活性具有抑制作用[40]，同時與鐵元素產(chǎn)生互作效應(yīng)，使CAT活性出現(xiàn)波動。劉寶娟[41]研究指出，當銅含量一定時，皺紋盤鮑肝胰臟的CAT活性隨著鐵含量的升高而下降，從而推測飼料中過高的鐵含量也會對CAT活性產(chǎn)生抑制作用，本研究結(jié)果與其相似。

李俊偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，方格星蟲蟲體內(nèi)釩、鎘和銅等元素受環(huán)境沉積物影響較明顯，而沉積物中微量元素通過方格星蟲的攝食行為進入體內(nèi)循環(huán)并發(fā)揮生理生化功能。本研究中，蟲體銅含量隨著飼料銅含量的增大而增加，與李俊偉等[13]的研究結(jié)果相似；蟲體鐵含量則相對穩(wěn)定，且各處理間無顯著差異，究其原因可能是：方格星蟲體腔液中的蚯蚓血紅蛋白結(jié)合著大量鐵離子[42]，能維持穩(wěn)定的鐵含量，而蟲體鐵含量需要維持在一個相對恒定的范圍才能維持蟲體的正常生命活動。仲曉麗[43]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中的鋅含量對皺紋盤鮑肝胰臟中鐵元素的積累無顯著影響。本研究中，飼料銅和鐵含量對方格星蟲稚蟲蟲體鐵含量也無顯著影響，與仲曉麗[43]的研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，各處理方格星蟲蟲體的鐵含量間差異不顯著，但會受到飼料銅與鐵含量交互作用的影響而產(chǎn)生波動，與仲曉麗[43]研究發(fā)現(xiàn)皺紋盤鮑肌肉中的鐵含量隨著飼料中鋅含量的升高而顯著增加的結(jié)果不一致，推測是其肌肉組織內(nèi)鋅和鐵元素間產(chǎn)生交互效應(yīng)的結(jié)果。

4 結(jié) 論

飼料中銅和鐵的交互作用可顯著影響方格星蟲稚蟲生長、存活及蟲體銅含量，對方格星蟲稚蟲體成分、CAT活性和蟲體鐵含量無顯著影響。飼料鐵元素對方格星蟲稚蟲生長的影響程度大于飼料銅元素。以增重率為評價標準，方格星蟲稚蟲飼料中最適銅和鐵含量分別為7.8和120.6 mg/kg。