洪占梅，熊曉莉，肖俊萍，高慧，章芳琴，葉喜德*（.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院藥劑科，合肥 00；.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 0004；.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，南昌 0006）

遠志為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠志Polygala sibiricaL. 的干燥根[1]，主產(chǎn)于山西和陜西，性溫，味苦。傳統(tǒng)用藥常以遠志根皮入藥，具有鎮(zhèn)靜安神、祛痰消腫等功效，多用于治療失眠多夢、健忘等證?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)遠志中寡糖酯、酮和皂苷類等成分對遠志鎮(zhèn)靜安神及神經(jīng)保護等藥效產(chǎn)生影響[2]。而不同產(chǎn)地遠志藥材所含化學(xué)成分的含量存在差異[3-4]，其中山西產(chǎn)遠志藥材中寡糖酯和酮類成分含量高且品質(zhì)優(yōu)。而當(dāng)前對不同產(chǎn)地遠志成分的含量研究多集中于采用HPLC法測定寡糖酯、酮和皂苷類等成分的含量[5]。2020年版《中國藥典》以遠志酮Ⅲ、3，6'-二芥子?；崽呛图毴~遠志皂苷為目標成分，應(yīng)用反相色譜ODS柱及甲醇-0.05%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，并按照HPLC法進行含量測定。另一方面，遠志質(zhì)量優(yōu)劣，常與抽芯程度有關(guān)。所謂抽芯程度是指同一批遠志抽芯所占比率，在一定程度上代表遠志等級，這與遠志傳統(tǒng)用藥習(xí)慣“去芯”有關(guān)，認為遠志芯是遠志的主要毒性部位。由于遠志抽芯困難，故遠志的抽芯程度越高，商品等級越高[6]。但現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，遠志可不去芯，遠志芯中的化學(xué)成分與遠志筒相近，只是含量較低，且去芯可能更易導(dǎo)致遠志發(fā)霉，從而導(dǎo)致黃曲霉毒素超標[7]。基于此，本文研究遠志不同產(chǎn)地、不同抽芯程度對其所含西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮和3，6’-二芥子?；崽堑?種成分含量的影響，并比較它們之間的差異，為深入研究遠志提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1100型高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫公司），DFY-400型400克搖擺式高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），TGL-16B高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），十萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），娃哈哈純凈水。對照品西伯利亞遠志糖A5（批號：MUST-21052704）、西伯利亞遠志糖A6（批號：MUST-20082523）、遠志酮（批號：MUST-19092310）（純度＞94.0%）（成都曼斯特生物科技有限公司）；3，6'-二芥子酰基蔗糖（批號：wkq 21031112）（純度＞99.0%，四川省維克奇生物科技有限公司）；除乙腈為色譜純外，其他試劑均為分析純。

本研究所用遠志藥材來源于陜西和山西兩地，詳見表1，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室劉應(yīng)蛟副教授鑒定為遠志（Polygala tenuifoliaWilld）的干燥根。

表1 12批遠志來源信息Tab 1 12 batches of Polygala tenuifolia source information

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取不同產(chǎn)地遠志藥材20 g，粉碎，過60目篩，各取0.5 g粉末，精密稱定，置于錐形瓶中，加入60%甲醇25 mL，稱定重量，超聲45 min。靜置冷卻后，再稱定重量，用60%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取濾液，置于25 mL量瓶中，定容至刻度。轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，5000 r·min-1下離心5 min，取上清液，微孔濾膜過濾后，得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

取西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮各1 mg，3，6'-二芥子?；崽? mg，于5 mL量瓶中用純甲醇定容，制成對照品儲備液。分別從各對照品儲備液中精密吸取適量配制成西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮質(zhì)量濃度均為0.05 mg·mL-1，3，6'-二芥子?；崽琴|(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的混合對照品溶液，逐級稀釋，得混合對照品系列溶液。

2.3 色譜條件[8]

采用Syncronis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫35℃，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL，檢測波長320 nm，流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，8%～15.5%A；8～22 min，15.5%～18%A；22～30 min，18%～20%A；30～50 min，20%～24%A；50～73 min，24%～33%A；73～85 min，33%～42%A）。在上述色譜條件下，各成分間分離度良好，分離度均大于1.5，見圖1。

圖1 遠志中4種成分HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of 4 components in Polygala tenuifolia

2.4 線性關(guān)系考察

取混合對照品系列溶液，西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮質(zhì)量濃度分別為5、10、15、25、40、50 μg·mL-1，3，6’-二芥子?；崽琴|(zhì)量濃度分別為20、40、60、100、160、200 μg·mL-1，按“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄各成分峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，以信噪比（S/N）為10時計算定量限，結(jié)果見表2。

表2 遠志中4種成分的標準曲線和線性范圍Tab 2 Standard curve and linearity of 4 components in Polygala tenuifolia

2.5 精密度試驗

精密吸取遠志混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣10 μL，重復(fù)6次，記錄并計算對照品中西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮、3，6'-二芥子酰基蔗糖成分峰面積RSD值，其結(jié)果分別為1.9%、1.9%、1.1%、1.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批遠志藥材粉末6份，精密稱定，按照“2.1”項方法制備，按照“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮、3，6'-二芥子?；崽欠迕娣eRSD值，其結(jié)果分別為2.1%、2.2%、2.3%、1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批遠志供試品溶液適量，于室溫下分別在0、2、4、8、12 h，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，計算峰面積RSD值。結(jié)果西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮、3，6'-二芥子?；崽欠迕娣eRSD分別為1.1%、2.0%、1.7%、1.6%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗

精密量取已知成分含量的遠志供試品溶液（批號：S1）1 mL，加入低、中、高濃度的混合對照品溶液1 mL，每個濃度取3份，置于5 mL量瓶中，定容，在“2.3”項色譜條件下進樣，測定西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮、3，6'-二芥子酰基蔗糖的平均回收率。結(jié)果4種成分的低、中、高濃度的平均回收率在94.8%～106.8%，RSD在0.47%～2.0%。

2.9 樣品含量測定

取各批次樣品，按“2.1”項下方法進行制備，按照“2.3”項下色譜條件進行檢測，記錄峰面積，計算供試品中各成分含量，結(jié)果見表3。

表3 不同遠志中4種成分含量測定結(jié)果(mg·g-1)Tab 3 Determination of 4 components in different Polygala tenuifolia (mg·g-1)

2.10 統(tǒng)計分析

采用 SPSS 23.0 軟件分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗進行組間比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.10.1 4種不同成分含量聚類分析 將12份不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠志藥材中西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮和3，6'-二芥子酰基蔗糖4種成分含量數(shù)據(jù)輸入SPSS 23.0統(tǒng)計軟件中進行聚類分析。在分析過程中主要以遠志藥材中各成分含量的相似度進行分類。結(jié)果表明，12批遠志樣品首先可聚為兩個大類，S5、S9、S10聚為一大類，其他可聚為另一大類，見圖2。在第一大類中，S5單獨為一小類，S9、S10聚為一小類；在第二大類中，可分為4個小類，S1、S2、S7、S8聚為一小類，S3、S11、S6聚為一小類，S12與S4單獨各為一小類。

圖2 12批遠志的聚類分析樹狀圖Fig 2 Cluster analysis of 12 batches Polygala tenuifolia

2.10.2 4種成分含量差異分析 由表3可知，不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠志藥材4種成分含量存在顯著差異。西伯利亞遠志糖A5含量為0.787～2.193 mg·g-1，以山西未抽芯大筒遠志含量最高，為2.193 mg·g-1，其次為陜西未抽芯大筒遠志，含量為2.129 mg·g-1，與其他不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠志藥材存在顯著性差異（P＜0.05）。相同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠志中西伯利亞遠志糖A5含量無顯著差異，以山西抽芯98%中筒遠志與抽芯90%大筒遠志含量最為接近。

西伯利亞遠志糖A6含量為0.627～1.574 mg·g-1，以陜西未抽芯大筒遠志含量最高，為1.574 mg·g-1，其次為山西未抽芯大筒遠志，含量為1.195 mg·g-1，與其他不同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠志存在顯著差異（P＜0.05）。相同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠志中西伯利亞遠志糖A6含量無顯著差異，以山西抽芯95%與抽芯98%中筒遠志中西伯利亞遠志糖A6含量最為接近。

3，6'-二芥子?；崽呛繛?.976～8.465 mg·g-1，以陜西未抽芯大筒遠志含量最高，為8.465 mg·g-1，其次為陜西抽芯98%大筒遠志，含量為6.807 mg·g-1，與其他不同產(chǎn)地、不同抽芯程度的遠志存在顯著差異（P＜0.05）。相同產(chǎn)地、不同抽芯程度遠志中3，6'-二芥子酰基蔗糖含量無顯著差異，以陜西抽芯98%大筒遠志與抽芯95%小筒遠志含量最為接近。

3 總結(jié)與討論

3.1 遠志藥材及測定指標的選擇

目前，我國的遠志藥材主要分布于山西、陜西、河北和山東等地，以山西和陜西為主要產(chǎn)地。在遠志多指標成分含量研究中，對山西、內(nèi)蒙、陜西等地的糖酯類指標成分進行研究，結(jié)果表明山西遠志藥材成分含量較高，整體品質(zhì)較好[9]。因此，本研究選用山西和陜西兩地不同抽芯程度的遠志藥材進行成分含量研究。在選擇測定指標方面，大量研究表明，遠志中寡糖酯類和酮類成分與遠志藥效相關(guān)，因此對不同產(chǎn)地遠志藥材進行成分含量測定時，常以遠志酮、3，6'-二芥子?；崽菫闇y定指標。另外，參考文獻[10]對遠志藥材中西伯利亞遠志糖A5和西伯利亞遠志糖A6進行含量測定，分析遠志藥材成分含量的差異性。因此，在本研究中選用西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮和3，6'-二芥子?；崽?種成分進行研究。

由含量測定結(jié)果可知，山西未抽芯大筒遠志中西伯利亞遠志糖A5含量比抽芯者高，陜西抽芯98%大筒遠志中西伯利亞遠志糖A6含量最高，山西未抽芯大筒遠志中遠志酮含量最高，陜西未抽芯遠志中3，6'-二芥子?；崽呛孔罡?，表現(xiàn)為整體質(zhì)量優(yōu)、品質(zhì)佳。

3.2 測定條件的篩選

2020年版《中國藥典》遠志的含量測定中，采用70%甲醇對遠志粉末進行超聲提取，殘渣加10%氫氧化鈉加熱回流，鹽酸調(diào)節(jié)pH值，正丁醇振搖提取等方式制備供試品溶液。本研究在設(shè)計供試品的制備方法階段對超聲提取和回流提取方式進行了比較，發(fā)現(xiàn)文獻[11-12]多采用超聲提取進行供試品制備，甲醇濃度在50%～70%，此法提取效率高且用時少，因此，本研究中對遠志藥材采用超聲法提取，提取溶劑為60%的甲醇。對于流動相的選擇，文獻[13-15]對遠志成分含量測定時多采用甲醇-0.05%磷酸溶液（70∶30）為流動相進行梯度洗脫，而在遠志指紋圖譜研究以及遠志質(zhì)量評價研究中多采用乙腈-0.05%磷酸溶液進行洗脫。本文參考文獻并對混合對照品成分進行測定后，采用乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，實現(xiàn)了對西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、遠志酮與3，6'-二芥子?；崽呛糠治鰷y定。

3.3 不同抽芯程度對遠志藥材的影響

根據(jù)遠志傳統(tǒng)藥用經(jīng)驗[16]，遠志以根皮入藥，藥效以“去凈木心者”為佳，其中大筒遠志質(zhì)量最優(yōu)，中筒其次，小筒較次。而在本研究中，對不同抽芯程度遠志藥材含量進行比較，發(fā)現(xiàn)陜西、山西中未抽芯大筒遠志西伯利亞遠志糖A5成分含量較高，西伯利亞遠志糖A6則以陜西98%抽芯大筒遠志最高，遠志酮以山西未抽芯大筒遠志最高，陜西未抽芯大筒遠志中3，6'-二芥子?；崽浅煞趾孔罡?。歷代本草用藥，提倡遠志去芯。但隨著研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)遠志不去芯時，毒性和溶血作用比取芯之后的根皮入藥時更小[17]，且祛痰作用相近。本研究結(jié)果表明，不去芯遠志中化學(xué)成分含量相對較高，說明去芯會影響遠志主要成分含量，這為遠志去芯是否影響其藥效等方面的深入研究提供了基礎(chǔ)。