王志強，東帥，李夢龍，梁銳

0 引言

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）可以解除免疫檢查點的“免疫剎車”作用，使免疫系統(tǒng)能夠識別并殺傷腫瘤細(xì)胞。根據(jù)作用位點的不同，常用的ICIs可分為PD-1單抗、PD-L1單抗和CTLA-4單抗三類。ICIs對存在錯配修復(fù)基因缺陷（deficient mismatch repair,dMMR）或微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability high,MSI-H）的結(jié)直腸癌患者治療效果確切。也有研究發(fā)現(xiàn)，部分錯配修復(fù)基因無缺陷（proficient mismatch repair,pMMR）或微衛(wèi)星穩(wěn)定型（microsatellite stability,MSS）結(jié)直腸癌患者也能從ICIs的治療中獲益[1-2]，如何篩選出能夠從ICIs治療獲益的MSS結(jié)直腸癌患者成為當(dāng)前研究的熱點。

通過預(yù)測標(biāo)志物的檢測可以發(fā)現(xiàn)潛在的對ICIs治療有效的微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌患者，擴(kuò)大免疫治療獲益人群。在MSS結(jié)直腸癌患者ICIs療效預(yù)測方面，部分標(biāo)志物已經(jīng)顯示出較好的潛能和價值。本文將對微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌ICIs療效預(yù)測標(biāo)志物的相關(guān)研究進(jìn)行全面梳理和總結(jié)，為MSS結(jié)直腸癌患者免疫治療提供參考。

1 基因水平預(yù)測標(biāo)志物

1.1 腫瘤突變負(fù)荷

腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden,TMB）是指基因組每百萬個堿基發(fā)生的體細(xì)胞基因突變個數(shù)。

KEYNOTE158研究采用帕博利珠單抗治療非結(jié)直腸癌患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高TMB患者客觀緩解率顯著高于低TMB患者（29%vs.6%）[3]。因此，美國FDA批準(zhǔn)了帕博利珠單抗用于腫瘤組織存在高TMB（≥10 mut/Mb）的難治性進(jìn)展期實體瘤的治療。MSS結(jié)直腸癌是實體瘤的一種，其腫瘤組織中的TMB同樣能夠?qū)ε敛├閱慰沟寞熜нM(jìn)行預(yù)測。

在結(jié)直腸癌中，高TMB結(jié)直腸癌患者中僅有16%的患者為MSI-H型，其余84%的結(jié)直腸癌患者為MSS型，這些高TMB MSS結(jié)直腸癌患者可以從ICIs治療中獲益[4-5]。Fabrizio等[6]研究發(fā)現(xiàn)TMB對ICIs治療結(jié)直腸癌療效預(yù)測方面優(yōu)于MSI狀態(tài)檢測，以上這些研究均表明TMB是預(yù)測ICIs治療MSS結(jié)直腸癌患者的療效標(biāo)志物。目前，研究者對TMB臨界值的設(shè)定并未達(dá)成共識，常用的臨界值有10、16、20 mut/Mb。

1.2 POLE/POLD1基因突變

DNA聚合酶ε（DNA polymerase epsilon,POLE）和δ（DNA polymerase delta 1,POLD1）基因編碼DNA聚合酶的核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，參與DNA的復(fù)制和校對，當(dāng)POLE/POLD1基因發(fā)生突變時，DNA復(fù)制受到直接影響。皮膚癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤均可發(fā)生該基因突變，在結(jié)直腸癌中約有1%的患者存在POLE/POLD1突變，且多見于年輕的右半結(jié)腸癌患者，POLE/POLD1突變與MSI突變相互排斥，因此主要存在于MSS結(jié)直腸癌患者中[7]。POLE/POLD1突變的腫瘤組織中存在大量細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8+）和記憶T細(xì)胞（CD45RO+），并且存在較高水平的突變新抗原[8]。

相關(guān)研究表明，在非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌和其他實體瘤治療中POLE/POLD1突變能夠?qū)CIs療效進(jìn)行預(yù)測[9-11]。在MSS mCRC治療中，POLE/POLD1突變對ICIs療效的預(yù)測價值也已經(jīng)得到證實，多個研究結(jié)果顯示使用帕博利珠單抗治療存在POLE/POLD1突變的MSS轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌效果顯著[12-13]，表明POLE/POLD1突變是預(yù)測ICIs治療MSS結(jié)直腸癌患者的療效標(biāo)志物。

1.3 結(jié)直腸癌分子亞型

根據(jù)基因表達(dá)特點國際結(jié)直腸癌分型聯(lián)盟將結(jié)直腸癌分為4種共識分子亞型（consensus molecular subtypes,CMS）：CMS1型：免疫型，以高TMB和突變新抗原、高度免疫細(xì)胞浸潤以及BRAF V600E突變?yōu)樘卣?，MSI狀態(tài)多數(shù)為dMMR/MSI-H。CMS2型：經(jīng)典型，其特征是WNT和MYC通路激活，該亞型中MSI-H的患者比例很低，不超過2%。CMS3型：代謝型，其特征是癌細(xì)胞代謝失調(diào)和KRAS突變。CMS4型：間質(zhì)型，其特征是基質(zhì)浸潤、轉(zhuǎn)化生長因子β激活和血管生成[14]。CMS1和CMS4型腫瘤組織中均存在高度的免疫細(xì)胞浸潤，有可能從免疫療法中獲益，是潛在的免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物。但是CMS1和CMS4型免疫微環(huán)境是截然不同的，CMS1表現(xiàn)為免疫活化狀態(tài)，CMS4表現(xiàn)為免疫抑制狀態(tài)。

CMS1型腫瘤組織中存在CD8+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞浸潤，而且與腫瘤發(fā)生免疫逃避相關(guān)的免疫檢查點分子CTLA-4、PD-1和PD-L1表達(dá)升高[15]。有研究采用恩考芬尼（BRAF抑制劑）、西妥昔單抗（EGFR抑制劑）聯(lián)合納武單抗治療MSS型BRAFV600E突變的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，入組患者分子亞型均為CMS1型，BRAF抑制劑與EGFR抑制劑聯(lián)合誘導(dǎo)出短暫的MSI-H表型，從而提高了PD-1抗體的反應(yīng)率[16]，表明CMS1型MSS結(jié)直腸癌患者采用ICIs與靶向藥物聯(lián)合治療效果較好。

CMS4型的免疫浸潤模式與CMS1型不同，主要是存在抑制性的髓源性抑制細(xì)胞（myeloidderived suppressor cells,MDSCs）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory lymphocytes,Tregs）、單核細(xì)胞源性細(xì)胞和Th17細(xì)胞浸潤。在腫瘤組織中免疫抑制因子TGF-β和CXCL12與趨化因子白細(xì)胞介素17和23表達(dá)上調(diào)[17]。當(dāng)前有多個研究結(jié)果顯示，CMS4型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者采用ICIs治療效果并不理想[18-19]。

1.4 甲基化

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）是烷化劑誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵蛋白，MGMT甲基化的膠質(zhì)瘤患者采用替莫唑胺治療療效較好[20]。約有40%的結(jié)直腸癌患者存在MGMT甲基化，但是單獨采用替莫唑胺治療MGMT甲基化的結(jié)直腸癌患者效果不佳[21]。

MAYA研究采用替莫唑胺序貫ICIs治療MGMT甲基化的MSS轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，結(jié)果顯示在接受替莫唑胺治療2個療程后疾病穩(wěn)定、獲得后續(xù)納武單抗聯(lián)合伊匹單抗治療的33位患者中，客觀緩解率為45%，中位OS和PFS分別為18.4和7個月[22]。提示使用替莫唑胺能夠誘導(dǎo)并獲得超突變表型，具有將冷腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮[瘤的療效。同時也說明ICIs對MGMT甲基化的MSS mCRC具有較好的療效，MGMT甲基化具有作為MSS結(jié)直腸癌ICIs療效預(yù)測標(biāo)志物的潛能。

2 蛋白水平預(yù)測標(biāo)志物

2.1 PD-1和PD-L1的表達(dá)

程序性死亡受體1（PD-1）是一種跨膜蛋白，表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞表面。程序性死亡配體1（PD-L1）是PD-1的配體，通常在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)[23]，此外腫瘤免疫微環(huán)境中的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等也會表達(dá)PD-L1。PD-1與PD-L1結(jié)合能抑制效應(yīng)T細(xì)胞的增殖和功能，促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊[24]。

PD-L1表達(dá)水平通常采用綜合陽性評分（combined positive score,CPS）、腫瘤細(xì)胞陽性比例評分（tumor cell proportion score,TPS）或免疫細(xì)胞陽性比例評分（immune cell proportion score,IPS）來評價，在胃癌、非小細(xì)胞肺癌以及食管癌中采用上述評分系統(tǒng)能夠?qū)CIs療效進(jìn)行預(yù)測[25]。但在結(jié)直腸癌中，PD-L1的表達(dá)水平與dMMR/MSI-H并不存在相關(guān)性，采用PD-L1單項指標(biāo)不能預(yù)測ICIs的療效[26]。

Llosa等[27]發(fā)現(xiàn)MSS mCRC患者的腫瘤組織高表達(dá)PD-L1同時腫瘤中存在PD-1高表達(dá)的T細(xì)胞（CD8+）浸潤時，腫瘤免疫微環(huán)境與dMMR/MSI-H患者類似，患者能夠從帕博利珠單抗治療中獲益。提示聯(lián)合檢測腫瘤組織PD-L1表達(dá)水平和PD-1高表達(dá)T細(xì)胞能夠預(yù)測ICIs治療MSS結(jié)直腸癌患者的療效。

2.2 突變新抗原

突變新抗原（mutation-associated neoantigens,MANA）存在于癌細(xì)胞表面，能夠被樹突狀細(xì)胞遞呈給免疫效應(yīng)細(xì)胞，引起腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）細(xì)胞的浸潤[28]，因此，T細(xì)胞對MANA的識別與ICIs的療效相關(guān)。

存在高水平MANA的肺癌和黑色素瘤患者采用ICIs治療的效果較好[9,29-30]。Luksza等[31]為了更好的預(yù)測ICIs的療效建立了突變新抗原模型，通過該模型可以預(yù)測ICIs治療肺癌和黑色素瘤患者的療效。在當(dāng)前的結(jié)直腸癌臨床研究中通常同時檢測MANA、TMB和TILs水平以評價ICIs療效，MANA具有作為ICIs治療MSS結(jié)直腸癌療效預(yù)測標(biāo)志物的潛能。

2.3 T細(xì)胞受體庫

T細(xì)胞受體（T cell receptor,TCR）由4條多肽鏈組成，包括α、β、γ和δ，編碼4條多肽鏈的TCR基因發(fā)生重排使TCR具有多樣性和特異性。因此，研究者根據(jù)TCR基因的特異性建立了T細(xì)胞受體庫。研究表明腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞受體庫呈現(xiàn)多樣化時免疫治療療效更好[32]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)在治療前可以采用液體活檢方法檢測T細(xì)胞受體庫對ICIs的療效進(jìn)行預(yù)測[33]。

Chen等[34]對TCR多樣性在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者療效預(yù)測方面的價值進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)TCR多樣性水平高或化療后TCR多樣性快速下降的患者治療效果更好。另一項采用腫瘤疫苗聯(lián)合奧沙利鉑治療進(jìn)展期結(jié)直腸癌的研究結(jié)果顯示，TCR多樣性評分高的患者具有較好的療效[35]。這些研究提示T細(xì)胞受體庫可能是結(jié)直腸癌ICIs治療療效潛在的預(yù)測標(biāo)志物，確切結(jié)論尚需進(jìn)一步研究證實。

3 腫瘤微環(huán)境預(yù)測標(biāo)志物

腫瘤微環(huán)境（TME）是指腫瘤癌巢和間質(zhì)中存在的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及活性介質(zhì)。TME在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，目前發(fā)現(xiàn)多種免疫治療標(biāo)志物與腫瘤微環(huán)境有關(guān)。

3.1 腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞和免疫評分

在腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)中通常存在多種淋巴細(xì)胞的浸潤，這些淋巴細(xì)胞統(tǒng)稱為TILs，TILs包括T細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多個亞群，是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分。

在結(jié)直腸癌組織中出現(xiàn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和Th1細(xì)胞的浸潤以及IFN-γ表達(dá)上調(diào)時提示ICIs的療效較好，表明TILs能夠?qū)γ庖咧委煹寞熜нM(jìn)行預(yù)測[36]。有研究表明，在抗PD-1抗體治療有效的乳腺癌和膀胱癌組織中CD8和PD-L1的表達(dá)水平顯著升高[37-39]。當(dāng)前，PD-L1陽性細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞共同浸潤已經(jīng)用于ICIs治療結(jié)直腸癌等腫瘤療效的預(yù)測[40-41]。以上這些研究表明，TILs具有作為ICIs治療MSS結(jié)直腸癌療效預(yù)測標(biāo)志物的潛能。

為了更精確對ICIs的療效進(jìn)行預(yù)測，研究者提出了根據(jù)TILs的分布進(jìn)行免疫評分的方法，該方法對位于腫瘤核心區(qū)域及交界區(qū)域中的CD8+T細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞和CD45RO+記憶性T細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行分級。將兩個區(qū)域內(nèi)淋巴細(xì)胞群的密度從低到高評為1～4分[42]。目前，有多個研究采用免疫評分系統(tǒng)對ICIs療效進(jìn)行預(yù)測[43-45]。免疫評分能否作為ICIs治療MSS結(jié)直腸癌療效預(yù)測標(biāo)志物尚需更多的證據(jù)加以證實。

3.2 腸道和腫瘤菌群

在宿主免疫系統(tǒng)的維持和發(fā)展過程中腸道菌群起著重要作用，ICIs治療腫瘤的療效與腸道菌群有關(guān)[46-47]。一項研究表明，胃腸腫瘤患者腸道的普氏桿菌與擬桿菌屬的比例與ICIs療效相關(guān)，患者能從免疫治療中獲益很可能與細(xì)菌代謝產(chǎn)物有關(guān)[48-49]。另一項研究顯示，從人腸道微生物群中收集的含有11種細(xì)菌的菌群，在小鼠腸道中能夠誘導(dǎo)出產(chǎn)生干擾素γ的CD8+T細(xì)胞，從而增強了ICIs的抗腫瘤療效[50]。

除了腸道菌群外，結(jié)直腸腫瘤組織內(nèi)也存在菌群。其中關(guān)于具核梭桿菌的研究較多，該菌是結(jié)直腸癌中一種腫瘤駐留菌。相關(guān)研究表明，具核梭桿菌能夠激活干擾素刺激因子信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)并增加IFN-γ+CD8+TILs的浸潤，從而提高腫瘤對ICIs的敏感度，當(dāng)腫瘤組織中存在高水平具核梭桿菌時，患者ICIs的治療效果好，且不需檢測MSI狀態(tài)[51]。提示具核梭桿菌可以對包括MSS在內(nèi)的結(jié)直腸癌ICIs療效進(jìn)行預(yù)測。

4 結(jié)語

免疫檢查點抑制劑在MSI-H結(jié)直腸癌治療中顯示出的良好療效讓研究者認(rèn)識到免疫治療所蘊含的巨大潛力和價值。目前研究者正在試圖通過篩選ICIs預(yù)測標(biāo)志物、開發(fā)新的ICIs藥物以及將ICIs與化療、放療或靶向治療聯(lián)合使用來提高M(jìn)SS結(jié)直腸癌的治療效果，從而獲得最佳的MSS結(jié)直腸癌免疫治療方案。其中，TMB、POLE/POLD1基因已顯示出對MSS結(jié)直腸癌ICIs療效具有較好的預(yù)測作用。除了本文中的標(biāo)志物以外，循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）也能對MSS結(jié)直腸癌ICIs的療效進(jìn)行較好的監(jiān)測，ctDNA水平較低的患者疾病穩(wěn)定，ctDNA升高的患者通常會出現(xiàn)快速進(jìn)展[52]。

然而，現(xiàn)有的ICIs療效預(yù)測標(biāo)志物還存在一些問題：（1）用于MSS結(jié)直腸癌預(yù)測的相關(guān)研究較少，需要更多的臨床研究進(jìn)行驗證。（2）TMB、TILs等預(yù)測標(biāo)志物的臨界值尚未形成共識，需要進(jìn)一步明確。相信隨著對免疫系統(tǒng)及其調(diào)節(jié)機(jī)制的不斷深入了解、免疫治療理念的逐步發(fā)展和完善，免疫檢查點抑制劑在MSS結(jié)直腸癌的應(yīng)用將更加科學(xué)和規(guī)范。