劉曉蕾姜樹原邵 國謝雅彬賈小娥謝 偉*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 包頭 014040;3.泰國格樂大學(xué)國際學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)系,泰國 曼谷 10220;4.深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科,廣東 深圳 518112)

N-甲 基-D-天 冬 氨 酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的離子型谷氨酸受體,介導(dǎo)廣泛的腦過程,例如突觸可塑性和興奮性毒性[1-2]。NMDA受體存在于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中,由不同亞基組成的異聚體組裝而成的,包含結(jié)構(gòu)亞基NR1,調(diào)控亞基NR2(NR2A、NR2B、NR2C和NR2D),以及NR3亞基(NR3A和NR3B)[3]。其中NR2B的C端區(qū)域,有多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基,是敏感的磷酸化位點(diǎn)。此外,NR2B磷酸化的變化可能是缺血/低氧神經(jīng)保護(hù)的重要表現(xiàn)形式,NR2B通過磷酸化影響與其相互作用的蛋白活性,進(jìn)而調(diào)控的下游分子來實(shí)現(xiàn)對抗低氧/缺血腦損傷,并可能成為治療低氧/缺血疾病的潛在靶點(diǎn)。但由于NR2B的磷酸化位點(diǎn)眾多,其磷酸化與低氧/缺血神經(jīng)保護(hù)間的關(guān)系復(fù)雜,還需要更多的研究來闡明。本文綜述了NR2B的磷酸化及信號(hào)通路在缺血/低氧神經(jīng)保護(hù)中作用,以期為將NR2B亞基作為調(diào)控靶點(diǎn)進(jìn)行低氧/缺血腦疾病的防治工作奠定理論基礎(chǔ)。

1 NR2B亞基結(jié)構(gòu)、分布

NR2B亞基是NMDA受體的調(diào)節(jié)亞單位,由1456個(gè)氨基酸組成,分子量約為170～180 kDa,包含4個(gè)不連續(xù)的結(jié)構(gòu):(1)胞外N-末端結(jié)構(gòu)域(Nterminal domain, NTD),在谷氨酸受體寡聚化和調(diào)節(jié)中起作用;(2)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ligandbinding domain, LBD),結(jié)合激動(dòng)劑;(3)膜區(qū),包括三個(gè)跨膜螺旋(M1、M3和M4)和一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(M2),形成離子通道;(4)參與連接受體的胞內(nèi)C-末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD),參與細(xì)胞運(yùn)輸和耦合到各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路[4-7]。

NR2亞基基因表現(xiàn)出不同的區(qū)域和發(fā)育表達(dá)模式。許多研究者已經(jīng)在不同的大腦區(qū)域(如皮層、海馬、小腦和下丘腦)的不同發(fā)育階段檢測了NR2B的表達(dá)和定位[8]。對嚙齒類動(dòng)物大腦中NR2B亞基基因表達(dá)的進(jìn)一步檢測表明,胚胎第14天,在脊髓和下丘腦NR2B mRNA低水平表達(dá),到胚胎第17天,NR2B轉(zhuǎn)錄本表達(dá)顯著增加,在大腦皮層(特別是第1層)、丘腦和脊髓中表達(dá)量高,而在海馬、丘和下丘腦中表達(dá)量低。出生時(shí),NR2B mRNA的表達(dá)在大腦皮層、海馬、隔、新紋狀體和丘腦核中明顯增加,但在小腦中水平較低。出生后第7～12天,NR2B在大腦皮層和海馬中表達(dá)量高,在新紋狀體、隔、丘腦核和小腦中表達(dá)量中等[3]。NR2B亞基mRNA在3～30月齡時(shí)在大腦皮層大部分區(qū)域和齒狀回顆粒細(xì)胞中顯著降低。在成人大腦中,NR2B在皮層(尤其是II/III層)、海馬、杏仁核、丘腦腹側(cè)核和嗅球中表達(dá)最高[9]。亞細(xì)胞水平,NR2B在突觸,突觸周圍和突觸外位點(diǎn)檢測到。然而,在大多數(shù)神經(jīng)元中,突觸后密度的樹突棘高于樹突軸和體細(xì)胞膜。在未成熟的谷氨酸突觸中NR2B的受體占主導(dǎo)地位并直接介導(dǎo)突觸傳遞[10]。

2 缺氧/缺血神經(jīng)保護(hù)與NR2B關(guān)系

缺氧是指細(xì)胞維持內(nèi)在生命活動(dòng)的氧氣濃度的下降。由于限制組織的血液供應(yīng)而導(dǎo)致的缺氧被稱為缺血。腦缺血的主要特征之一是興奮性毒性,當(dāng)缺氧/缺血發(fā)生時(shí),導(dǎo)致谷氨酸大量釋放,過度激活NMDA受體,并導(dǎo)致大量鈣離子流入離子受體。然后,鈣依賴的死亡信號(hào)蛋白的激活引發(fā)了大量的興奮毒性信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),并誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡[11]。NR2B主要分布于突觸外NMDA受體位點(diǎn),NR2B亞基的CTD在促進(jìn)腦缺血中的神經(jīng)元死亡方面至關(guān)重要[12]。有研究證明,在缺氧缺血6 h后,腦室下區(qū)(subventricular zone, SVZ)NR2B的表達(dá)量升高,在缺氧缺血24 h時(shí)達(dá)到最大值[13],表明缺氧缺血促進(jìn)了NR2B表達(dá),導(dǎo)致了腦損傷。Zhang等[14]使用四血管閉塞缺血模型評估了嚴(yán)重缺血后大鼠受體基因表達(dá)、蛋白水平和功能。缺血后12 h和24 h,CA1和海馬其他亞區(qū)NR2A、NR2B mRNA表達(dá)下降,與對照組相比,NR2A/B蛋白(海馬總)在缺血后6 h和24 h均顯著降低。然而缺氧1 h后,額葉皮質(zhì)、海馬、丘腦、基底節(jié)或小腦區(qū)域的NR2B的表達(dá)沒有變化[15]。缺血再灌注(ischemiareperfusion, IR)后,CA1區(qū)NR2B的mRNA表達(dá)在12 h時(shí)下降到最低水平,然后開始恢復(fù),到48 h達(dá)到峰值,然后持續(xù)下降到第7天。在CA3區(qū)和齒狀回中,mRNA表達(dá)的變異范圍逐漸顯著減小。TUNEL染色顯示IR 24 h時(shí),凋亡陽性細(xì)胞主要分布在CA1區(qū)。隨后凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增長,在IR 48 h時(shí)急劇增加,72 h時(shí)達(dá)到峰值,隨后凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量開始減少,到第7天時(shí)凋亡陽性細(xì)胞仍然存在。表明腦缺血大鼠海馬中NR2B mRNA的表達(dá)與凋亡之間存在特定的關(guān)系[16]?？赡苡捎诘脱?缺血過度刺激了突觸外NMDA受體,導(dǎo)致鈣超載和線粒體功能障礙,從而觸發(fā)一系列下游神經(jīng)毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng),損害神經(jīng)元功能或引起谷氨酸興奮毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。其中,NR2B-PSD95-nNOS通路是缺血性卒中特征明確的死亡信號(hào)通路,在這個(gè)通路中,腳手架蛋白突觸后密度-95(g protein postsynaptic density-95, PSD95)將NMDA受體連接到下游分子,包括一氧化氮合酶(nNOS)。PSD95包含3個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域,PSD95的PDZ1和PDZ2結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合在NR2 NMDA受體亞基的胞內(nèi)C端蘇氨酸/絲氨酸-X-纈氨酸-COOH(threonine/serine-X-valine-COOH, T/SXV)基序上[18]。PSD95的PDZ2結(jié)構(gòu)域也與nNOS的N端結(jié)合[19]。這種分子結(jié)構(gòu)允許過度激活的NMDA受體的Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致nNOS的過度激活,然后產(chǎn)生一氧化氮(NO),這是一種已知的興奮毒性效應(yīng)[20]。nNOS促進(jìn)一氧化氮的產(chǎn)生,進(jìn)而誘導(dǎo) s-亞硝基化和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein-9, MMP-9)的激活,最終誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。干擾NR2B-PSD95-nNOS復(fù)合物可抑制NMDA介導(dǎo)的NO生成,保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性毒性[21]。

相反,亞毒性NMDA通過激活促存活的磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)/Akt通路對抗缺血性腦損傷從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。NMDA受體打開后,Ca2+和鈣調(diào)素激活PI3K,使膜磷脂PtdIns(4,5)P2磷酸化至PtdIns(3,4,5)P3[22]。然后,PtdIns(3,4,5)P3相互作用的磷酸肌苷依賴蛋白激酶1(phosphoinositide dependent protein kinase1, PDK1)被招募到細(xì)胞膜上,通過磷酸化激活A(yù)kt[23]。Akt通過磷酸化一些下游靶點(diǎn)來促進(jìn)細(xì)胞存活。突觸NMDA受體的激活也可誘導(dǎo)促生存基因的表達(dá)。突觸NMDA受體活性以及Ca2+內(nèi)流激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, Ras/ERK)信號(hào)和核Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶(Ca2+/calmodulin dependent protein kinase, CAMKs),然后磷酸化并激活環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)。CREB的激活可誘導(dǎo)促生存基因的表達(dá),從而保護(hù)神經(jīng)元免受凋亡的損害[24]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)-酪氨酸受體激酶B(tyrosine kinase receptor B, TrkB)信號(hào)和鈣依賴性鈣調(diào)素級(jí)聯(lián)有助于NMDA誘導(dǎo)的PI3K/Akt通路激活[25]。缺血預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)中,通過下調(diào)NR2B,胞漿Ca2+降低,觸發(fā)PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路,抑制MMPs活性,減少細(xì)胞凋亡[26],從而在體內(nèi)保護(hù)大腦免受損傷,改善新生兒缺氧缺血腦損傷的長期學(xué)習(xí)和記憶能力,同時(shí)在體外也能保護(hù)海馬神經(jīng)元[27]。盡管大多數(shù)研究表明NR2B在缺氧缺血性腦病中具有促死亡作用,但也有證據(jù)表明NR2B在發(fā)育過程中可以促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)生,保護(hù)神經(jīng)元免受凋亡[13,28]。由于含有NR2B的NMDA受體是早期發(fā)育中的主要亞型,因此NR2B是否在缺氧缺血性腦病中起雙重作用仍有待確定。

3 低氧/缺血神經(jīng)保護(hù)與NR2B磷酸化關(guān)系

3.1 絲氨酸/蘇氨酸

蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)NMDAR功能的重要機(jī)制。NR2B的CTD區(qū)域,是磷酸化的關(guān)鍵區(qū)域,包含很多能被磷酸化修飾的氨基酸,如絲氨酸、蘇氨酸等,如:S886、S917、S1303、S1323[29]、S1284[30]。NR2B的磷酸化變化在神經(jīng)保護(hù)中起著重要的作用。

神經(jīng)元缺血時(shí),NR2B亞單位S1284受細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)調(diào)節(jié),培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的氧-葡萄糖剝奪(OGD)和小鼠的短暫全腦缺血都會(huì)導(dǎo)致S1284處NR2B磷酸化水平的顯著下降[30]。再灌注后24 h內(nèi),NR2B的表達(dá)隨著時(shí)間的推移而降低,酪蛋白激酶2α(casein kinase 2α, CK2α)介導(dǎo)的絲氨酸S1480磷酸化逐漸降低,S1480的磷酸化破壞了NR2B與PSD-95之間的相互作用[29]。Tu等[31]發(fā)現(xiàn)激活的死亡相關(guān)蛋白激酶1(death-associated protein kinase 1, DAPK1)通過磷酸化NR2B上的S1303位點(diǎn)來提高NR2B受體通道的電導(dǎo)。在該研究中,研究者發(fā)現(xiàn)缺血損傷后激活DAPK1可使NR2B的S1303磷酸化,并且OGD和缺血處理的小鼠和皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞,都會(huì)引起DAPK1的活性增高并提高NR2B的S1303位點(diǎn)的磷酸化水平,從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。通過S1303位點(diǎn)附近基序的多肽干擾DAPK1和NR2B的相互作用,可以減少腦缺血帶來的損傷。綜上,NR2B上絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化參與調(diào)控了NMDA受體的通道特性,在低氧/缺血類腦病中,不同絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化變化不盡相同,如S1303處NR2B的磷酸化水平會(huì)升高,而S1284處NR2B磷酸化水平會(huì)下降,通過改變這些位點(diǎn)的磷酸化水平,對低氧/缺血類腦病,特別是腦卒中有積極的治療作用。

3.2 酪氨酸

酪氨酸磷酸化在低氧/缺血類疾病中,特別是腦卒中,發(fā)揮著重要作用。Nakazawa等[32]通過一系列方法鑒定出了NR2B上許多酪氨酸磷酸化位點(diǎn),主要包括酪氨酸Y1070、Y1472、Y1252、Y1336等。為了探究酪氨酸磷酸化在腦卒中之中的變化,大量研究通過建立低氧/缺血模型,模擬腦卒中。有研究表明,在成年大鼠中,短暫性缺血會(huì)顯著增加海馬內(nèi)NMDAR亞基NR2A和NR2B的酪氨酸磷酸化(NR2A的酪氨酸磷酸化顯著、快速和持續(xù)增加,而NR2B的酪氨酸磷酸化較小[33])。這種上調(diào)部分是由Src家族酪氨酸激酶Src和Fyn介導(dǎo)的[34]。Fyn在大腦中有許多底物,包括NR2B,它是發(fā)育中大腦中的主要調(diào)節(jié)亞單位。Fyn在其C末端的7個(gè)酪氨酸(Y932、Y1039、Y1070、Y1109、Y1252、Y1336、Y1472)殘基上介導(dǎo)NR2B磷酸化,其中Y1472為主要位點(diǎn)[32]。Fyn優(yōu)先磷酸化新生皮質(zhì)中Y1472和Y1252處的NR2B。此外,Y1472處NR2B的磷酸化(pY1472 NR2B)和Y1252處NR2B的磷酸化(pY1252 NR2B)在Fyn 過表達(dá)小鼠的突觸膜中上調(diào),其中Src家族激酶(SFK)活性也增加。在腦缺血的成年大鼠中,pY1472 NR2B顯著且持續(xù)上調(diào)[35]。出生后第7天(P7)大鼠和小鼠缺氧缺血hypoxia ischemia, HI)后pY1472 NR2B增加[36]。研究表明,再灌注后24 h內(nèi),NR2B的表達(dá)隨著時(shí)間的推移而降低,Fyn介導(dǎo)的Y1472磷酸化增加,而NR2B上另一個(gè)Fyn靶點(diǎn)Y1336的磷酸化保持不變[37]。在WT動(dòng)物中,HI后6 h內(nèi)pY1472 NR2B和pY1252 NR2B增加,但pY1336 NR2B沒有增加[36]。Wu等[38]發(fā)現(xiàn)Fyn對pY1336在體外谷氨酸毒性模型中促進(jìn)NR2B的鈣蛋白酶裂解,然而HI后沒有觀察到pY1336產(chǎn)生的鈣蛋白酶裂解片段[36]。據(jù)報(bào)道,pY1336還介導(dǎo)NR2B與PI3K的相互作用,該相互作用在成年大鼠短暫缺血后增加[39-40]。新生兒低氧/缺血性腦病與NR2B酪氨酸磷酸化的增強(qiáng)有關(guān)。新生兒缺氧缺血后pY1472 NR2B上調(diào)參與了超氧化物介導(dǎo)的氧化應(yīng)激,并促進(jìn)了腦損傷。HI后,pY1472 NR2B的上調(diào),可能啟動(dòng)了下游細(xì)胞死亡信號(hào)通路,促進(jìn)了腦損傷的形成,而pY1336可能參與鈣剪切酶對NR2B胞內(nèi)端剪切的調(diào)控。綜上,在腦卒中和新生兒低氧/缺血性腦病中,NR2B上酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平的變化不同,但是NR2B主要的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的磷酸化水平是升高的,通過改變這些位點(diǎn)的磷酸化水平,可以為治療缺血缺氧性腦病奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)語

總之,NR2B的磷酸化影響了NMDA受體的功能,酪氨酸的磷酸化改變很可能影響NR2B復(fù)合體在初始狀態(tài)和損傷后的蛋白質(zhì)招募[41],絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化調(diào)控NMDA受體通道特性和膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程,這為以NR2B的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行低氧神經(jīng)保護(hù)提供了思路,若進(jìn)一步研究NR2B的磷酸化位點(diǎn)氧/缺血神經(jīng)保護(hù)間的關(guān)系,能為缺血性卒中等疾病的診斷、治療開辟更廣闊的的天地。