吳芳杉馬科鋒崔 博*

(1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所,天津 300050;2.濰坊醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院,山東 濰坊 261053)

谷氨酸是一種神經系統(tǒng)興奮性神經遞質,它可以啟動快速信號轉導,參與學習、記憶以及突觸可塑性[1-2]。然而若細胞外谷氨酸異常堆積,過度刺激谷氨酸受體,可導致Ca2+和Na+持續(xù)內流,細胞內鈣超載,水分增加,進而造成細胞毒性水腫,神經元變性死亡等[3]。這會造成一系列的神經系統(tǒng)疾病,如:帕金森病、阿爾茨海默病、癲癇等[4]。顯然,維持谷氨酸穩(wěn)態(tài)是抵抗谷氨酸興奮性毒性的有效途徑。

Na+依賴的興奮性氨基酸轉運蛋白(excitatory amino acid transporters,EAAT)是細胞外谷氨酸轉運的重要蛋白,起到谷氨酸再攝取的作用,維持細胞外間隙谷氨酸水平的穩(wěn)定。目前,EAAT已被克隆出Na+依賴的5種亞型:EAAT1(GLAST)、EAAT2(glutamate transporter-1,GLT-1) 、EAAT3(excitatory amino acid carrier,EAAC1)、EAAT4和EAAT5[5-6]。在中樞神經系統(tǒng)中GLAST和GLT-1主要在星形膠質細胞中表達,EAAC1、EAAT4和EAAT5主要在神經元中表達[7]。在神經系統(tǒng)中,一些谷氨酸轉運蛋白的定位與表達在不同腦區(qū)可能是不同的,調控谷氨酸傳遞的作用也是不同的[8]。其中,星形膠質細胞通過GLT-1和GLAST攝取突觸間隙中高達80%的谷氨酸[3]。生理情況下,GLAST再攝取谷氨酸的能力略次于GLT-1,但是當GLT-1再攝取能力被阻斷時,GLAST再攝取谷氨酸的能力卻增加了[9]。對于谷氨酸的調控是預防興奮性毒性的關鍵,而谷氨酸轉運蛋白如GLAST的調節(jié)恰恰是其中的關鍵一環(huán)。

1 GLAST結構與功能

早期研究發(fā)現,GLAST在分子學層面是一種膜拓撲學結構,可能由6個跨膜的α-螺旋和4個較短的跨膜結構域形成1個β-折疊結構[10]。GLAST的人類同源物為EAAT1,人類基因根據SLC家族命名,SLC1A3編碼EAAT1[11]。其在小腦中表達最高,定位于星形膠質細胞膜表面[12]。

GLAST是一種膜溶質載體蛋白,它通過轉運三個鈉離子(Na+)和一個質子(H+)以及反向轉運一個鉀離子(K+)來介導細胞對谷氨酸的再攝取,以參與神經元興奮性毒性損傷的調節(jié)[13-14]。GLAST與GLT-1重攝取胞外谷氨酸,在谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)的作用下轉變?yōu)闊o毒的谷氨酰胺。而目前發(fā)現似乎GS只定位在星形膠質細胞上。在細胞外沒有發(fā)現專門用于分解谷氨酸的酶。細胞外谷氨酸可以維持在正常水平完全依賴于Na+依賴的谷氨酸轉運蛋白[3]。在外周神經系統(tǒng)中則主要是GLAST的再攝取作用。GLAST作為調節(jié)胞外谷氨酸濃度的主要轉運蛋白之一,其在谷氨酸興奮性毒性的調節(jié)方面,作用不容小覷。

2 GLAST與神經系統(tǒng)疾病

在神經系統(tǒng)中,興奮性神經元與抑制性神經元維持平衡,才可以使神經系統(tǒng)維持正常功能。平衡被打破,然后造成一系列的神經系統(tǒng)病變。正常情況下,膠質細胞中谷氨酸轉運蛋白可以維持谷氨酸穩(wěn)態(tài),阻止谷氨酸興奮性毒性損傷[15]。若膠質細胞對谷氨酸的再攝取和反應能力受損,會產生相應神經系統(tǒng)疾病[16]。

2.1 GLAST與中樞神經系統(tǒng)疾病

2.1.1 GLAST與帕金森病(Parkinson’s disease,PD)

PD是一種常見的神經系統(tǒng)變性疾病,中腦黑質多巴胺(Dopamine,DA)能神經元的變性死亡是其典型的病理改變[17]。而多巴胺缺乏會導致丘腦底核的去抑制,丘腦底核神經元為黑質致密部中含有谷氨酸受體的DA能神經元提供興奮性神經支配,其中谷氨酸作為興奮性遞質的角色存在。這又加重了DA能神經元的變性[18]。說明谷氨酸穩(wěn)態(tài)失衡與帕金森病發(fā)病機制相關。谷氨酸被釋放到細胞外,作用于突觸后受體發(fā)揮作用。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA) 受體是最有代表性的介導興奮性毒性的離子型受體之一,過度活化的NMDA受體引起大量Ca2+流入神經元,最終引起DA能神經元損傷。臨床上NMDA受體拮抗劑藥物的應用,表明抑制谷氨酸能過度活化是治療帕金森病的有效策略[19]。Salvatore等[9]發(fā)現,在PD模型中,黑質紋狀體神經元丟失,谷氨酸濃度增加,GLT-1介導的主要的谷氨酸再攝取途徑被阻斷,然而卻發(fā)現GLAST的再攝取能力出現短暫增強,也增加了整體谷氨酸攝取能力。這可以抵抗發(fā)病初期谷氨酸濃度的增加,使神經元損傷得到緩解,這為GLAST介導的谷氨酸再攝取提供了新思路。

2.1.2 GLAST與阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)

AD是一種以認知功能下降為主的神經系統(tǒng)退行性疾病,一般起病時不易被察覺。AD發(fā)病時,病理上表現為神經元變性丟失和淀粉樣蛋白斑塊的形成[20]。中樞神經系統(tǒng)的興奮性調節(jié)主要靠星形膠質細胞調節(jié)Na+依賴的興奮性氨基酸轉運蛋白GLT-1和GLAST來實現的[21]。Schallier等[22]研究發(fā)現8月齡APP23小鼠皮層和海馬中,GLAST和GLT-1表達降低,而皮層中囊泡谷氨酸轉運蛋白1(the vesicular glutamate transporters,vGLUT1)表達顯著增加。谷氨酸釋放增多、轉運蛋白表達減少,理論上細胞外谷氨酸濃度是增加的。但是與野生型小鼠相比,其細胞外谷氨酸水平是降低的,說明谷氨酸轉運蛋白的活性可能并不只受到表達變化這一種調控。而18月齡APP23小鼠皮層和海馬中GLT-1表達與野生型小鼠相比是降低的,但是GLAST的表達基本不變,這表明AD中谷氨酸改變可能主要通過GLT-1實現,但是顯然在AD發(fā)病初期,GLAST也是參與其中的。Han[23]等研究發(fā)現Aβ1-42的低聚物可以降低EAAT1的表達,而胰島素可以恢復這一趨勢,提高EAAT1的表達。而目前人們已認可淀粉樣蛋白β1-42(Aβ1-42)是AD的潛在生物學標志物之一[24]。AD因與糖尿病具有許多共同的病理特征,被稱為“3型糖尿病”,胰島素信號傳導受損出現在AD早期階段,胰島素對于AD有一定的保護作用[25]。由此可見,EAAT1在AD的預防與治療方面都有潛在作用[26]。

2.1.3 GLAST與癲癇(Epilepsy)

癲癇發(fā)作代表著整個興奮性神經元群的同步放電失控,會導致大量谷氨酸釋放和興奮性神經毒性[27]。早在1993年,During等[28]通過微透析探針的方法檢測發(fā)現癲癇患者發(fā)病時透析液中谷氨酸鹽濃度持續(xù)增加,從而指出谷氨酸濃度過高與癲癇發(fā)病機制相關。Watanabe等[29]發(fā)現,誘導谷氨酸轉運蛋白GLAST缺陷小鼠模型會導致癲癇發(fā)作。Doi等[30]發(fā)現點燃癲癇模型中,完全點燃的SD大鼠在最后一次癲癇發(fā)作1 d和30 d分別檢測海馬GLAST、GLT-1等的表達,發(fā)現在1 d它們表達均顯著升高,而30 d谷氨酸轉運蛋白與對照組相比沒有變化。這些結果表明GLAST、GLT-1等可能參與了癲癇的發(fā)生,但是與癲癇的維持狀態(tài)無關。Sun等[31]發(fā)現,Neo1(neogenin)在癲癇患者海馬中表達是降低的,動物模型中顯示Neo1條件性敲除(Neo1KO)會增加小鼠癲癇易感性,而Neo1KO鼠海馬星形膠質細胞中GLAST也是降低的。免疫共沉淀顯示Neo1KO與GLAST形成了復合物。過表達Neo1 GLAST恢復;過表達GLAST可以恢復谷氨酸攝取和谷氨酰胺合成,并且降低了癲癇反應。由此可見,GLAST表達的變化與癲癇發(fā)作密切相關,很有可能是癲癇的易感因素之一。Taspinar等[32]研究發(fā)現點燃癲癇模型中,GLAST等表達在前期增加,但再攝取谷氨酸時間延長,說明增加的谷氨酸轉運蛋白的表達已不足以清除多余的谷氨酸。而丙戊酸或頭孢曲松治療組,GLAST蛋白表達是增加的,并將再攝取時間縮短到幾乎和對照組相當,說明丙戊酸或頭孢曲松可能是通過增加GLAST等谷氨酸轉運蛋白的表達,來調節(jié)谷氨酸,進而治療癲癇的。

2.2 GLAST與外周神經系統(tǒng)疾病

2.2.1 GLAST與視網膜病變

研究發(fā)現視覺、聽覺感受器的突觸功能是有調節(jié)性的,需要感受細胞持續(xù)、分級釋放囊泡,由此進化出帶狀突觸結構[33]。光感受器的帶狀突觸結構持續(xù)性釋放谷氨酸,使突觸間隙谷氨酸持續(xù)升高,持續(xù)有效的谷氨酸攝取顯得尤為重要,因此在視網膜中EAAT是高度表達的。Müller細胞是調節(jié)細胞外遞質、保持突觸正常傳遞的重要細胞,視網膜的谷氨酸攝取主要是通過Müller細胞上的GLAST實現的[34]。研究表明GLAST缺陷小鼠出現了正常眼壓青光眼樣表型,表明GLAST功能障礙可能是青光眼患者視網膜神經節(jié)細胞(retinal ganglion cell,RGC)丟失的原因[35]。Ma等[36]發(fā)現高糖環(huán)境,活性氧產生增加,降低了GLAST的表達,降低了Müller細胞對谷氨酸的攝取。于是通過繼續(xù)下調TRPC6通道,抑制高糖條件下活性氧的產生,發(fā)現這種情況下促進了GLAST的表達,提高了高糖條件下Müller細胞對谷氨酸的攝取活性,減緩了視網膜損傷,證明GLAST對RGC的保護作用。

2.2.2 GLAST與聽力損失

耳蝸中存在重要的谷氨酸循環(huán)機制:谷氨酸自內毛細胞釋放后,由耳蝸支持細胞上的GLAST再攝取到支持細胞中,在谷氨酰胺合成酶的作用下谷氨酸轉變?yōu)闊o毒的谷氨酰胺。谷氨酰胺被釋放出細胞后,又被內毛細胞攝取,在磷酸化的谷氨酰胺酶的作用下變?yōu)楣劝彼?來填補谷氨酸遞質池,完成谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)[37-38]。谷氨酸過度堆積,產生興奮性毒性,造成耳蝸帶狀突觸損傷[39]。GLAST作為此循環(huán)的重要轉運蛋白可以維持細胞外谷氨酸平衡,避免耳蝸細胞的興奮性毒性損傷[40]。因此,GLAST缺陷小鼠提供了一個體內模型,用于研究聽力損失的興奮性毒性機制。Hakuba等[41]發(fā)現,GLAST缺陷小鼠外淋巴液中谷氨酸的濃度增加,其聽力損失會加重,這與GLAST參與的谷氨酸循環(huán)被抑制有關。Tserga等[42]發(fā)現GLAST敲除小鼠與野生型小鼠相比,聽性腦干反應(auditory brainstem response,ABR)Ⅰ波振幅降低,小鼠突觸對減少。最近研究發(fā)現短時中等強度的噪聲暴露會導致暫時性聽力閾移,損傷耳蝸帶狀突觸,這一般認為是谷氨酸毒性造成的[43]。研究中發(fā)現小鼠在噪聲暴露后先出現GLAST增高趨勢,雖然并無顯著差異,但是在GLAST增高時興奮性毒性是降低的。所以對于隱性聽力損失中GLAST表達的深入研究是有必要的。

3 GLAST作用機制

目前對于GLAST調控機制的了解并不十分清楚,以往研究發(fā)現許多GLAST的正性和負性調控因子,也發(fā)現參與調控的相關通路,這表明GLAST是復雜的、多通路共同調節(jié)的。

3.1 JAK-STAT通路

JAK-STAT通路是多種細胞因子和生長因子的主要信號傳導機制。一些研究發(fā)現JAK-STAT通路在神經系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。JAK2和STAT3在神經系統(tǒng)膠質細胞和海馬神經元中有表達,與一些神經退行性疾病的發(fā)展密切相關[44]。在單次延長應激(single-prolonged stress,SPS)干預的創(chuàng)傷后應激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)的大鼠模型中,大鼠腦脊液中谷氨酸濃度升高,GLAST表達降低,JAK/STAT 3通路被抑制。而成纖維細胞生長因子2(Fibroblast growth factor 2,FGF2)可以改善這一現象[45]。說明FGF2可能也是GLAST的正性調控因子,并且可能是通過JAK/STAT通路來調節(jié)GLAST的。在大鼠注射紅藻氨酸(kainic acid,KA)誘發(fā)的癲癇模型中發(fā)現,與未進行任何處理的對照組相比,p-JAK1和p-STAT3的表達有所增加,GLAST的表達也是增加的;而與KA或NC+KA(NC:空白載體)相比,過表達UCA1(一類長鏈非編碼RNA)組抑制了p-JAK1和p-STAT3的表達,也抑制了海馬星形膠質細胞中GLAST的表達[46]。許多研究提示谷氨酸通過激活STAT3(p-STAT3) 在觸發(fā)GLAST表達上調中起作用,JAK/STAT失活抑制星形膠質細胞功能[45-47]。

3.2 DAG-PKC通路

研究發(fā)現,雞的貝格曼膠質細胞谷氨酸暴露培養(yǎng)后,PKC激活劑可顯著降低GLAST轉運蛋白的活性,并降低其mRNA水平;而PKC抑制劑可以阻斷這種變化。且發(fā)現谷氨酸受體激活介導了chglast啟動子的轉錄活性[48]。GLAST長期調節(jié)顯然涉及轉錄調控。Gosselin等[49]發(fā)現PKC的激活導致星形膠質細胞谷氨酸轉運減少,與 EAAT1分布發(fā)生變化有關;并證明PKC控制EAAT1到細胞外微泡的途徑。

3.3 P38-MAPK通路

Yadav等[50]綜述中指出肌萎縮側索硬化的致病機制有多種,其中包括谷氨酸興奮性毒性。而p38-αMAPK主要調節(jié)p38 MAPK通路激活產生的一些對機體不利影響,其中包括調節(jié)興奮性毒性、活性氧反應和神經元凋亡等?？梢?p38-αMAPK的上調與谷氨酸興奮性毒性之間存在調節(jié)關系。Wu等[51]發(fā)現糖尿病視網膜病變狀態(tài)下GLAST和GS的表達下調。Raf-1激酶抑制蛋白(Raf-1 kinase inhibition protein,RKIP)的表達導致GLAST表達上調,提示RKIP與興奮性毒性調節(jié)有關。而研究中還表明RKIP調節(jié)p38-MAPK信號通路。但是GLAST與MAPK之間是否有直接調節(jié)關系還需進一步研究。

3.4 NF-κB通路

Karki等[52]發(fā)現GLAST啟動子區(qū)域含有兩個NF-κB結合位點,在EGF誘導大鼠和人星形膠質細胞EAAT1(或嚙齒類動物中的GLAST)表達中,NFκB也起關鍵作用。過表達NF-κB p65增加了EAAT1啟動子的活性,也增加了EAAT1mRNA和蛋白質水平。過表達NF-κB抑制劑降低了EAAT1啟動子活性、mRNA和蛋白質水平。且在大鼠星形膠質細胞和人星形膠質細胞H4細胞中效果相同。研究結果表明,NF-κB對于EAAT1(GLAST)起正性調節(jié)作用,通過激活NF-κB途徑,誘導其與EAAT1啟動子結合,來正向調節(jié)表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)對EAAT1表達的促進作用。Karki等[53]首次證明阿倫酸是通過激活NF-κB途徑來增強EAAT1的表達和功能。NF-κB途徑可能是調控EAAT1表達與功能的關鍵之一。

3.5 GLAST的重要調控因子

GLAST的轉錄調控中一些因子發(fā)揮著重要作用。轉化生長因子α(transforming growth factor-α,TGFα)、表 皮 生長 因子(epidermal growth factor, EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、胰島素樣生長因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)和膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)等能增加GLAST的mRNA和蛋白水平,起到正性調控的作用[54]。錳誘導的神經毒性模型[52]中,EAAT1 mRNA和蛋白質水平降低,轉錄因子YY1(Ying Yang 1,YY1)缺失減弱了這一表現,過表達YY1導致這一現象。Karki等[52]發(fā)現YY1是EAAT1的關鍵阻遏因子,錳對EAAT1表達的抑制作用通過YY1介導。此外,YY1還招募組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDAC) 共同抑制EAAT1以阻斷NF-κB與EAAT1啟動子結合引發(fā)正性調控作用。阿倫酸通過抑制錳誘導的YY1表達而解除了YY1對EAAT1的抑制[53]。Pajarillo等[55]研究中發(fā)現17β-雌二醇和他莫昔芬可以逆轉錳對GLAST表達和功能造成的影響,而TGF-α可能是這一保護機制的重要介質。以上眾多因子參與GLAST調控過程,但是參與GLAST調控的遠不止于此,還需進一步探索。

4 結語

谷氨酸毒性的調控是復雜的,多方面相互作用調節(jié)的。谷氨酸轉運蛋白的表達失衡是關鍵之一,它與多種神經系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制密切相關。因此闡明GLAST的作用機制對進一步了解谷氨酸興奮性毒性至關重要。GLAST在嚙齒動物的耳蝸中也有表達,中樞神經系統(tǒng)中的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)與耳蝸中的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)本質上是相似的。因此對GLAST與神經系統(tǒng)疾病的相關進展進行闡明,有望為聽力領域GLAST的研究找到新思路。