趙度賓 李月紅 來琦芳 覃欽博

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118; 2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090; 3 湖南師范大學(xué)省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081)

近年來，隨著我國人口的增長以及淡水資源的減少，我國人均可利用水資源不足且遠(yuǎn)低于世界水平，在此形勢下，有效開發(fā)和利用內(nèi)陸、濱海地區(qū)蘊(yùn)藏著的大量鹽堿水資源已經(jīng)成為鹽堿水域地區(qū)解決淡水資源短缺、保證水產(chǎn)養(yǎng)殖健康可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要途徑[1-2]。益生菌能調(diào)節(jié)pH、均衡藻相、改良鹽堿和抑制有害病菌，可用于全方位水質(zhì)改良，在改良鹽堿養(yǎng)殖水體中具有重要作用。目前，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已得到廣泛應(yīng)用，且已有較多相關(guān)報(bào)道，但其在鹽堿水體中應(yīng)用較少[3]。本文綜述了能夠改良鹽堿水域水質(zhì)的益生菌——光合細(xì)菌、乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等在鹽堿養(yǎng)殖水體調(diào)控作用方面的研究進(jìn)展，旨在為鹽堿養(yǎng)殖水體的水質(zhì)改良提供參考資料。

1 鹽堿養(yǎng)殖水體水質(zhì)改良益生菌種類

在水質(zhì)改良方面使用的益生菌主要有光合細(xì)菌、乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌等。

1.1 光合細(xì)菌

光合細(xì)菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一類光合色素為菌綠素，能進(jìn)行不產(chǎn)氧光合作用的原核生物，主要分為紫色硫細(xì)菌(PB)、紫色非硫細(xì)菌(PNSB)、綠色絲狀菌(GFB)和綠色硫細(xì)菌(GSB)四大類。光合細(xì)菌富含生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、色素、輔酶Q 10(CoQ10)、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、聚羥基脂肪酸酯(PHA)，此外還含有80多種較高濃度的類胡蘿卜素[4-5]。在養(yǎng)殖水體中，光合細(xì)菌能夠提高溶解氧(DO)水平，去除氨氮、亞硝酸鹽(NO2--N)，高效降解水中的污染物，具有較強(qiáng)的凈水功能。劉福軍等[6]發(fā)現(xiàn)，PSB可提高水體中溶解氧、硝態(tài)氮(NO3--N)的質(zhì)量濃度，降低亞硝態(tài)氮、銨態(tài)氮(NH4+-N)的質(zhì)量濃度，對浮游動(dòng)物無明顯影響。鄭耀通等[7]研究發(fā)現(xiàn)，固定化光合細(xì)菌對模擬池水中化學(xué)耗氧量(COD)的去除率為60%，對氨氮的去除率高達(dá)90%，DO增加約38%。張明磊等[8]發(fā)現(xiàn)，在重碳酸鹽水體中施用PSB后，NO2--N、NH4+-N質(zhì)量濃度顯著降低，pH和總堿度(Alk)無明顯變化。

1.2 乳酸菌

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類可利用碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生大量乙酸、乳酸等有機(jī)酸的無芽孢革蘭氏陽性菌。在代謝過程中，LAB利用有機(jī)碳的氮源發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、乳酸等有機(jī)酸和亞硝酸鹽還原酶，可有效降低水體的pH、亞硝酸鹽含量和氨氮含量，增加溶解氧和透明度[9-11]?，F(xiàn)已證明，施用適量的乳酸菌對調(diào)節(jié)水質(zhì)、健康養(yǎng)殖有重要意義。夏巖石等[12]研究發(fā)現(xiàn)，人工接種乳酸菌Lact.1純培養(yǎng)液能有效降解亞硝酸鹽，乳酸菌培養(yǎng)液的pH隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移呈下降趨勢。宋蓉等[13-14]的研究表明，在添加碳氮營養(yǎng)源的情況下施用干酪乳桿菌L821a，能在4 d內(nèi)將水體中的亞硝酸鹽質(zhì)量濃度由8.0 mg/L降至3.35 mg/L，此外，投加乳酸可促進(jìn)水體的反硝化作用。

1.3 芽孢桿菌

芽孢桿菌(bacillus)是一類產(chǎn)生芽孢、無莢膜、大多數(shù)有運(yùn)動(dòng)能力、革蘭氏染色為陽性的需氧或兼性厭氧菌。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)和蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)等[15-16]。將適量芽孢桿菌添加到飼料中進(jìn)行投喂，可促進(jìn)養(yǎng)殖對象生長，增強(qiáng)其免疫力。沈斌乾等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加(2～5)×108cfu/g的枯草芽孢桿菌B115，能促進(jìn)青魚魚種生長，降低飼料系數(shù)(從1.7降至1.5)。飼料中添加枯草芽孢桿菌E221，能緩解尼羅羅非魚因高鹽脅迫產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)[18]。芽孢桿菌又能用作水質(zhì)調(diào)節(jié)劑，抑制有害菌群增長繁殖，改良水質(zhì)，凈化環(huán)境。羅毅志等[19]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌分離株DSY002-2011在室外池塘的用量為1.35×105cfu/L時(shí)，池塘水體氨氮質(zhì)量濃度較對照組降低了36%。

1.4 酵母菌

酵母菌(yeast)是一種結(jié)構(gòu)簡單、能發(fā)酵糖類的兼性厭氧型單細(xì)胞真菌。在水產(chǎn)上應(yīng)用的主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、假絲酵母(Candidaalbicans)等[20]。酵母菌菌體中蛋白質(zhì)含量高，用作飼料時(shí)可部分替代魚粉，同時(shí)富含多種必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和各種消化酶[21]。酵母菌可有效提高飼料原料的營養(yǎng)價(jià)值并降低其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，如植酸、抗性淀粉等。經(jīng)過加工的酵母培養(yǎng)物能增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的機(jī)體免疫力、抗氧化能力[22-23]。酵母菌發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的有機(jī)酸可降低水體pH，可用于處理高濃度有機(jī)廢水，還可同化硝酸鹽，分解亞硝酸鹽，吸附重金屬離子。辛博等[24]研究發(fā)現(xiàn)，從漿水中分離出的酵母菌不但不產(chǎn)生亞硝酸鹽，還可降解亞硝酸鹽，在漿水發(fā)酵過程中接種酵母菌可使亞硝酸鹽含量明顯降低。此外，酵母菌可維持池塘生物群落多樣性和穩(wěn)定性。

2 益生菌對鹽堿水體的改良作用

高pH、高鹽、高堿、主要離子比例失調(diào)以及水質(zhì)類型繁多等是鹽堿水體的主要特點(diǎn)。與淡水不同，在鹽堿水體中，鈉、鉀離子含量遠(yuǎn)高于鈣、鎂離子，緩沖性能較差。鹽堿水體的水化學(xué)類型呈現(xiàn)多樣化，我國內(nèi)陸型鹽堿水中，碳酸鹽型較多，氯化物型和硫酸鹽型較少，而濱海型鹽堿水氯化物較多[25]。我國內(nèi)陸鹽堿水體的鹽度在1.24～13.00 g/L，堿度在3.0～44.5 mmol/L，pH在8.20～9.45[26]。鹽堿水體水質(zhì)清瘦，物種多樣性低，水化學(xué)指標(biāo)復(fù)雜易變，造成漁業(yè)生產(chǎn)中水質(zhì)不易調(diào)節(jié)和控制。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中合理使用益生菌可有效改良鹽堿水體。

2.1 pH調(diào)節(jié)作用

目前產(chǎn)酸的益生菌主要有乳酸菌類和芽孢桿菌(凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等)[27]。乳酸菌在無氧條件下可將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乳酸，降低pH，進(jìn)而去除亞硝酸鹽。乳酸菌降解亞硝酸鹽的效率會(huì)受到氯化鈉(NaCl)的抑制，可能是氯化鈉影響了乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的生成，或抑制了乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的活性[28]。劉振民等[29]發(fā)現(xiàn)，在12%復(fù)原脫脂乳中，嗜溫菌在28 ℃下發(fā)酵60 h后，測得pH為4.39～4.77，嗜熱菌在37 ℃下發(fā)酵60 h后，測得pH為3.33～3.92。

酵母菌適宜的pH在3.0～7.5，其不耐受高pH，pH太高會(huì)導(dǎo)致其程序性死亡。Metacaspase Yca1是哺乳動(dòng)物caspase蛋白酶垂直同源物，在酵母細(xì)胞凋亡中具有核心作用。在外源因素作用下，酵母菌會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜完整但磷脂酰絲氨酸(PS)外翻、線粒體膜電位下降、細(xì)胞色素c(Cytc)釋放、活性氧物質(zhì)(ROS)釋放、細(xì)胞核染色質(zhì)收縮、DNA片段化等與高等生物細(xì)胞非常相似的凋亡特征。ROS也是酵母細(xì)胞凋亡中的核心調(diào)節(jié)分子。當(dāng)受到外界刺激，胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過多而來不及清除時(shí)，機(jī)體會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，較高濃度的ROS可導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子功能被破壞，使細(xì)胞內(nèi)線粒體膜結(jié)構(gòu)受損，膜電位改變，最終引起細(xì)胞凋亡。因此，在鹽堿水體中，酵母菌需要與其他種類的益生菌相互配合使用。

芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢耐鹽堿可抵御外界不良環(huán)境，適合在鹽堿池塘水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。某些芽孢桿菌酵解葡萄糖可產(chǎn)酸。張建新等[30]發(fā)現(xiàn)了一株耐高溫的副地衣芽孢桿菌，該菌可以產(chǎn)生丙酸、丁酸和乙酸等多種短鏈脂肪酸。黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)微生物研究室分離獲得了一株具有產(chǎn)酸能力的短小芽孢桿菌BY-2037，在以蔗糖為碳源、酵母膏為氮源、乙醇體積濃度為3%的培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下培養(yǎng)時(shí)，其產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵液pH為2.93[31]。周劍等[32]發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖質(zhì)量濃度為100～140 g/L時(shí)，凝結(jié)芽孢桿菌RS12-6的L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)率比較穩(wěn)定，可以達(dá)到90～135 g/L。

2.2 鹽堿調(diào)節(jié)作用

具有鹽堿調(diào)節(jié)作用的益生菌大多是從鹽堿土、鹽堿水體(底泥)、濱海洼地等分離篩選出的耐鹽堿菌株，在非鹽堿的普通土壤中耐鹽堿細(xì)菌相對較少。嗜鹽菌的細(xì)胞膜上存在視紫紅質(zhì)，能夠利用光能轉(zhuǎn)運(yùn)H+形成質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，驅(qū)動(dòng)ATP合酶合成ATP，通過Na+/K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在胞質(zhì)內(nèi)積累高水平K+來抵御所處的高滲環(huán)境[33-35]；嗜堿性細(xì)菌的細(xì)胞膜上存在Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將細(xì)胞內(nèi)的陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外以維持胞內(nèi)pH。耐鹽堿細(xì)菌還可快速攝取、積累大量氨基酸(谷氨酸、脯氨酸等)、四氫嘧啶、甘氨酸甜菜堿等相容性溶質(zhì)，調(diào)節(jié)滲透壓來適應(yīng)外界高滲環(huán)境[36-37]。在滲透脅迫條件下，枯草芽孢桿菌通過proJ-proA-proH途徑迅速合成游離脯氨酸以提高耐受能力[38-39]。

耐鹽堿細(xì)菌中的部分菌株具有很好的降鹽降堿調(diào)節(jié)作用。在代謝過程中，耐鹽堿細(xì)菌分解葡萄糖等有機(jī)物，產(chǎn)生草酸、乙酸和乳酸等多種有機(jī)酸，可以中和鹽堿水體中的CO32-、HCO3-，起到降堿作用。宋建等[40]從強(qiáng)堿性赤泥中分離出一株芽孢桿菌，經(jīng)培養(yǎng)后可產(chǎn)生草酸、酒石酸、乙酸和乳酸，使培養(yǎng)基的pH從11降到6。燕紅等[41]分離獲得1株極端嗜鹽堿菌株，其在pH為13、NaCl質(zhì)量濃度為200 g/L的培養(yǎng)基中仍可生長，以蛋白胨作氮源時(shí)，培養(yǎng)基pH的下降率為12.9%，氯離子(Cl-)的降解率可達(dá)46.9%。芽孢桿菌呼吸作用產(chǎn)生的二氧化碳與水形成碳酸，進(jìn)一步電離出H+、HCO3-、CO32-，H+與OH-生成水，CO32-則被微生物誘導(dǎo)礦化生成碳酸鹽礦物。郭文文等[42]利用賴氨酸芽孢桿菌GW-2菌株在B4培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成了碳酸鹽礦物。pH對離子結(jié)合有很大的影響，pH越高越有利于碳酸鹽礦物沉淀。

嗜鹽菌的蛋白質(zhì)大多數(shù)都含有非極性殘基和過量的酸性氨基酸，過量的酸性物質(zhì)需要結(jié)合鈉離子以屏蔽周圍的負(fù)電荷，適應(yīng)環(huán)境，依賴環(huán)境。在細(xì)菌細(xì)胞表面或其外部有各種有機(jī)大分子和其他低分子量的非聚合成分，組成胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)，EPS的主要成分是核酸、多糖和蛋白質(zhì)，具有聚集細(xì)菌細(xì)胞，凝聚和吸附有機(jī)物、離子的功能[43]。EPS能夠保護(hù)細(xì)菌、藻類細(xì)胞，減輕鹽堿脅迫。Steele等[44]在培養(yǎng)基中添加黃明膠，使得藻細(xì)胞能夠應(yīng)對鹽度脅迫。此外，EPS還參與介導(dǎo)CaCO3的沉淀，與大量游離的鈣離子緊密結(jié)合，并使其以CaCO3晶體的形式沉淀[45-47]。孫雪等[48]從鹽堿地篩選得到1株優(yōu)勢海水鹽單胞菌菌株DB01(HalomonasaquamarineDB01)，胞外聚合物產(chǎn)能為0.21 g/g，降堿能力為8.7%。微生物還可通過改變EPS的產(chǎn)量和組成來改善其周圍環(huán)境，以減輕鹽脅迫的影響。

2.3 調(diào)節(jié)藻類

藻類作為水體環(huán)境的初級生產(chǎn)者，與益生菌有著密切關(guān)系，二者相互影響。菌藻共生的基礎(chǔ)是營養(yǎng)物質(zhì)交換，養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物可被益生菌加速分解為無機(jī)物，從而加快物質(zhì)循環(huán)，促進(jìn)微藻生長。藻類利用光合作用合成有機(jī)物，為異養(yǎng)益生菌提供營養(yǎng)物質(zhì)[49-50]。Kim等[51]在研究菌藻相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，根瘤菌屬(Rhizobiumsp)與小球藻(Chlorellavulgaris)共同培養(yǎng)，二者的生長速率分別提高了110%和11%。Amin等[52]發(fā)現(xiàn)，一種促生硫菌可通過分泌吲哚乙酸(IAA)來促進(jìn)硅藻細(xì)胞分裂。一些菌對藻類有抑制作用，通過直接或間接的途徑最終導(dǎo)致藻細(xì)胞溶解，或產(chǎn)生毒素和釋放溶藻酶致藻細(xì)胞死亡，可用來防止藍(lán)藻等有害藻類過度生長，阻止微藻的優(yōu)勢種群演替為藍(lán)藻[53-54]。Lukwambe等[55]在南美白對蝦養(yǎng)殖場中施用商業(yè)益生菌，在終末期階段具競爭力的藍(lán)藻(顫藻和魚腥藻)的演替受到了顯著限制。益生菌對綠藻門小球藻、硅藻門舟形藻的生長有積極影響，同時(shí)能改善水質(zhì)，有利于對蝦健康。

2.4 抑制有害病菌

益生菌對致病菌具有一定的抑制作用，可以替代抗生素應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。益生菌能分泌表面蛋白粘附定植在水產(chǎn)動(dòng)物腸壁上，合成大量的有機(jī)酸和細(xì)菌素等物質(zhì)，降低腸道pH，競爭性地利用腸道中的營養(yǎng)物質(zhì)，從而成為優(yōu)勢菌群。酵母菌是兼性厭氧菌，能消耗腸道中的氧，抑制有害需氧菌的繁殖，起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，還能為乳酸菌提供無氧環(huán)境和營養(yǎng)因子。竇曉明等[56]從酸奶中篩選出3株乳酸菌，其胞外產(chǎn)物(細(xì)菌素)能較好地抑制副溶血弧菌。楊勇[57]的試驗(yàn)表明，乳酸菌胞外產(chǎn)物的抑菌活性依賴于酸性環(huán)境，在酸性條件下，乳酸菌對鰻弧菌的抑制效率在90%以上。益生菌在生長代謝過程中能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如抗菌蛋白、脂肽類抗生素等。夏京津等[58]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)HE發(fā)酵液中的活性成分——脂肽類抗生素明脂肽可以改變菌體細(xì)胞膜的通透性，使胞漿內(nèi)物質(zhì)外漏，對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)均為137.97 μg/L。

3 結(jié)語

我國鹽堿水域面積較廣且仍在增多，發(fā)展以漁業(yè)利用為基礎(chǔ)的鹽堿水體養(yǎng)殖已成為開發(fā)鹽堿水資源的重要方法之一[59]。但是，鹽堿水質(zhì)問題限制了鹽堿水域水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展。用益生菌改良鹽堿養(yǎng)殖水質(zhì)作為修復(fù)鹽堿水體的一種生物方法，高效、成本低、無污染，是解決問題的重要途徑之一。鹽堿水體類型多樣，益生菌的選擇和使用還應(yīng)根據(jù)水質(zhì)理化指標(biāo)給出針對性的方案。已有學(xué)者在耐鹽堿益生菌的篩選方面取得重要進(jìn)展，耐鹽堿機(jī)制也有了系統(tǒng)的闡述。目前關(guān)于益生菌降鹽堿的效果已有報(bào)道，如趙媛等[60]從青海湖耐鹽堿微生物中篩選出1株降鹽率為17.30%的芽孢桿菌RM3和1株降堿率為7.60%的嗜鹽單胞菌RM25，但去除鹽堿的作用機(jī)理尚未得到明確解釋，有待于進(jìn)一步深入研究。