雷 艷,蘭 斌,余萬里,戴小華,蔡 鵬,顧偉芳,阿迪萊·艾力,趙紅瓊

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】缺氧(hypoxia)是指因組織的氧氣供應(yīng)不足或用氧障礙而導(dǎo)致組織的代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程。輕度的缺氧應(yīng)激會(huì)降低動(dòng)物的采食量和免疫力,影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能,而嚴(yán)重的缺氧應(yīng)激可能會(huì)造成動(dòng)物死亡[1]。諸多缺氧相關(guān)因子中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)是氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的核心因子。HIF是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體,β亞基是結(jié)構(gòu)亞基,在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá);而α亞基是功能亞基,在不同的狀態(tài)下表達(dá)存在顯著差異,對(duì)低氧適應(yīng)性起激活作用的HIF主要有HIF-1α、HIF-2α[2,3]。人體中HIF-1α和HIF-2α的氨基酸序列僅有48%的同源性[4]。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)是一種活性糖蛋白,能促進(jìn)骨髓中紅系造血祖細(xì)胞的增殖和分化,對(duì)機(jī)體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用[5]。EPO是HIF的下游靶基因之一,當(dāng)機(jī)體受到缺氧應(yīng)激時(shí),HIF會(huì)激活EPO的轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)EPO的表達(dá)。EPO主要通過與靶細(xì)胞膜表面的促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor, EPOR)結(jié)合,發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Befani等[7]使用化學(xué)物質(zhì)氯化鈷模擬缺氧,蛋白表達(dá)量在48 h內(nèi)隨著缺氧暴露時(shí)間遞增。米曉鈺等[8]對(duì)牦牛腦部HIF-1α的表達(dá)與定位進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因和蛋白在腦垂體表達(dá)量最高,垂體可能對(duì)缺氧具有較強(qiáng)的易感性。商鵬等[9]將飼養(yǎng)到平原地區(qū)的豬移居到高原,發(fā)現(xiàn)EPOR基因表達(dá)量增加,EPOR基因可能對(duì)高原適應(yīng)性有重要作用。【本研究切入點(diǎn)】檢測(cè)缺氧相關(guān)因子及其受體在動(dòng)物各組織的基因表達(dá)情況有利于探究機(jī)體缺氧耐受或不耐受可能的靶組織或器官。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法探新疆地方品種綿羊新疆細(xì)毛羊缺氧相關(guān)因子HIF和EPO及其受體的表達(dá),為該品種綿羊引入高原缺氧地區(qū)研究提供組織學(xué)依據(jù),為靶向緩解或調(diào)控缺氧應(yīng)激提供組織學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

4只健康新疆細(xì)毛羊,公羊,體重26.1 kg±0.2 kg,3～4月齡,來源于新疆畜牧科學(xué)院綿羊繁育試驗(yàn)基地。采樣前1周,圈舍飼養(yǎng),一天飼喂兩次,飼喂量為600 g/只/d,精料,秸稈青貯和苜蓿干草的比例為1∶1∶2,飲水自由。

1.1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒,HiFiScript cDNA Synthesis Kit(CW2569M,康為世紀(jì)生物科技有限公司);2 ×TaqMastreMix(CW0682M,康為世紀(jì)生物科技有限公司);50 × TAE(biosharp);核酸染料(博邁德生物);瓊脂糖(BIOWEST);熒光定量PCR試劑盒,PerfectStart Green qPCR SuperMix(AQ601,北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器

熒光定量PCR儀(7500 fast,Applied Biosystems);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-6C,北京六一生物科技有限公司);微型電泳槽(DYCP-31DN,北京六一生物科技有限公司);單滴分光光度計(jì)(SMA400,Merinton)。

1.2 方 法

1.2.1 綿羊組織樣品的采集與處理

采樣前一晚綿羊禁食不禁水,次日早晨頸部放血處死,共采集4只綿羊的樣品,每只綿羊采14種組織。每種組織樣品采樣點(diǎn)保持一致。采集的組織用無菌生理鹽水沖洗干凈,濾紙蘸干后放入無菌無酶凍存管,立即置于液氮中速凍,之后保存于-80℃冰箱,用于RNA的提取。表1

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)布的HIF-1a、HIF-2a、EPO和EPOR的全基因組序列(NCBI參考序列號(hào)分別為:XM_027971915.1、XM_015094403.2、NM_001024737.1和XM_027970663.1),以GAPDH為內(nèi)參基因,按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)原則,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表2

1.2.3 總RNA的提取

使用Trizol法提取組織中總RNA,置-80℃保存?zhèn)溆?。用單滴分光光度?jì)在波長為230 nm處檢測(cè)RNA的純度和濃度。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)RNA的完整性。

表1 采集的綿羊組織樣品及位點(diǎn)Table 1 The samping site of the tissues

表2 HIF-1α、HIF-2α、EPO和GAPDH 的PCR引物序列Table 2 PCR primer sequences of HIF-1α, HIF-2α, EPO and GAPDH

1.2.4 cDNA的合成

使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將綿羊各組織提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,RNA總量為2 000 ng,反應(yīng)總體系為20 μL。先加入4 μL的dNTP Mix (2.5 mmol/L),2 μL的Primer Mix,模板RNA 2 μg,用RNA無酶水補(bǔ)足到13 μL,70℃水浴10 min,迅速冰浴2 min。然后繼續(xù)加入4 μL 5×RT buffer,2 μL DTT(0.1 mol/L),1 μL HiFiScript反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL),混合均勻,50℃水浴15 min。瞬時(shí)離心,置于冰上冷卻后,將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20℃,備用。

1.2.5 引物的特異性

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為PCR模板,進(jìn)行目的基因擴(kuò)增和引物特異性驗(yàn)證。PCR體系為2 ×TaqMastreMix 7.5 μL,模板0.5 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足到12 .5 μL。PCR條件為:94℃ 10 min,94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,72℃ 10 min,35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳,1×TAE,電壓120 V,電流100 mA,電泳35 min后觀察引物特異性。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行2倍稀釋,作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為:2 × PerfectStart Green qPCR SuperMix 7.5 μL,模板1.5 μL,上下游引物各0.3 μL,Passive Reference Dye 0.3 μL,ddH2O補(bǔ)足到12.5 μL。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件為:94℃ 30 s,94℃ 5 s,60℃ 34 s,72℃ 34 s,40個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用2-△△Ct法比較各基因相對(duì)表達(dá)量,△Ct=(Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)),△△Ct=△Ct(一個(gè)組織目的基因)-△Ct(混樣RNA)。RNA混樣由同一只綿羊的各個(gè)組織RNA經(jīng)稀釋到同一濃度后等量吸取混合而成。SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行2-△△Ct值統(tǒng)計(jì)分析,比較各組織之間目的基因相對(duì)表達(dá)量的差異,結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取結(jié)果

研究表明,RNA電泳條帶清晰,A260/A280比值大于1.9,無蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì)污染,提取的總RNA可進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)。圖1

圖1 綿羊各組織提取的RNA完整性檢驗(yàn)

2.2 目的基因的擴(kuò)增

研究表明,HIF-1α、HIF-2α、EPO及EPOR基因均擴(kuò)增出單一清晰條帶,且無其它非特異性條帶,片段大小與預(yù)期相符(HIF-1α為166 bp,HIF-2α為185 bp,EPO為73 bp,EPOR為139 bp)。圖2

圖2 綿羊組織中HIF-1α、HIF-2α、EPO和EPOR基因的擴(kuò)增

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物的特異性

研究表明,從4種基因的熒光定量PCR熔解曲線均峰形單一,無引物二聚體等雜峰出現(xiàn),4種基因的引物具有很強(qiáng)的擴(kuò)增特異性。擴(kuò)增曲線基線平整,擴(kuò)增期和平臺(tái)期明顯,無特殊趨勢(shì)。圖3,圖4

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

2.4 HIF-1α基因在綿羊各組織中相對(duì)表達(dá)量

研究表明,HIF-1α基因在綿羊肺組織的相對(duì)表達(dá)量最高(4.2±1.2),且極顯著高于其它組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);脾(1.8±0.3)和睪丸(1.7±0.6)中該基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于肝和心臟組織(P<0.05);其它各組織之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),相對(duì)表達(dá)量均值為(0.8±0.1)。圖5

注:綿羊各組織之間相對(duì)表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用*表示P<0.05水平,用**表示P<0.01水平,下同

2.5 HIF-2α基因在綿羊各組織中相對(duì)表達(dá)量

研究表明,HIF-2α基因在綿羊各組織中相對(duì)表達(dá)量,肺組織中HIF-2α基因的相對(duì)表達(dá)量最高(21.9±4.7),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);脾中HIF-2α基因的相對(duì)表達(dá)量(5.1±3.5)高于盲腸、結(jié)腸、空腸、下丘腦、腎臟、回腸、心臟、腎上腺以及睪丸,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其它各組織之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其均值為(0.7±0.1)。圖6

2.6 HIF-1α和HIF-2α兩種基因在表達(dá)量最高組織中的比較

研究表明,將HIF-1α和HIF-2α基因在表達(dá)量最高的肺組織中進(jìn)行比較,HIF-2α基因的表達(dá)量顯著高于HIF-1α基因,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且約為HIF-1α表達(dá)量的5.2倍。圖7

圖6 HIF-2α基因在綿羊各組織中的相對(duì)表達(dá)量

注:兩種基因相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義用*表示P<0.05水平,用**表示P<0.01水平

2.7 EPO基因在羊各組織中的相對(duì)表達(dá)量

研究表明,該基因在腎臟中的相對(duì)表達(dá)量最高(3.8±3.6),且顯著高于垂體、結(jié)腸、脾臟、盲腸、肝臟、腎上腺、瘤胃、下丘腦以及心臟,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其它各組織之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其均值為(0.7±0.1)。圖8

圖8 EPO基因在綿羊各組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.8 EPOR基因在綿羊各組織中的相對(duì)表達(dá)量

研究表明,該基因在肺(21.1±14.2)和睪丸(18.5±9.0)中相對(duì)表達(dá)量最高,且顯著高于其它組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其它各組織之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其均值為(0.6±0.2)。圖9

圖9 EPOR基因在綿羊各組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)到HIF-1α和HIF-2α基因在綿羊的各組織中都有表達(dá),并有明顯的組織差異性,且均在綿羊肺臟的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是脾臟。生活在高海拔缺氧環(huán)境的藏羚羊,HIF-1α和HIF-2α基因在肺臟、心肌、肝臟、大腦、小腦、骨骼肌等組織中均有表達(dá),其中肺臟的表達(dá)量最高[10,11]。Spencer等[12]提出,在常氧條件下,HIF-2α mRNA在血管豐富組織中表達(dá)量較高,與試驗(yàn)中肺臟高表達(dá)的結(jié)果基本一致,但試驗(yàn)在心臟中檢測(cè)到HIF-2α mRNA的表達(dá)量非常低,究其原因可能是兩個(gè)研究心臟取樣位點(diǎn)不同,研究主要采集的是右心室心肌部的樣品,因而有必要進(jìn)一步研究心臟不同部位HIF表達(dá)是否有差異。常氧環(huán)境下的綿羊和處于高原缺氧氧地區(qū)的藏羚羊,HIF-1α和HIF-2α基因都在肺臟高表達(dá),肺臟可能是HIF的主要來源器官。對(duì)于生活在高海拔缺氧地區(qū)的哺乳動(dòng)物如藏羚羊或牦牛,可高表達(dá)HIF基因的肺臟具有更強(qiáng)大的功能,如肺部氣體擴(kuò)散容量很高,擴(kuò)散能力強(qiáng),血液流速更快,以保證體內(nèi)氧氣的供應(yīng)[13]。高原哺乳動(dòng)物為適應(yīng)低氧環(huán)境,發(fā)生低氧適應(yīng)性進(jìn)化,肺泡發(fā)育時(shí)期更早,肺泡數(shù)目在單位面積內(nèi)增多,肺泡面積也較小[14],而趙曉萌等[15]也發(fā)現(xiàn)HIF-1α在牦牛肺臟中的肺泡、終末細(xì)支氣管環(huán)形平滑肌以及肺泡隔間充質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)。肺臟是機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境,使HIF發(fā)揮缺氧調(diào)控作用的重要器官。

HIF-1α和HIF-2α基因均在綿羊肺部的相對(duì)表達(dá)量最高,而且HIF-2α的表達(dá)量約為HIF-1α的5.2倍。HIF-1α和HIF-2α基因雖然同屬一個(gè)家族,在基因表達(dá)和低氧調(diào)控中具有一定的相似性,但功能與作用有不同之處。Uchida等[16]在研究肺上皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn),在低氧后6 ～ 12 h內(nèi)HIF-1α的m RNA表達(dá)量快速下降,而在相同時(shí)間點(diǎn)HIF-2α的mRNA的表達(dá)量明顯增加,且在蛋白水平HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)情況與mRNA表達(dá)一致,在缺氧應(yīng)激過程中HIF-2α表達(dá)量的變化可能較HIF-1α更敏感,作用也更明顯。

EPO的表達(dá)會(huì)受到HIF基因的影響。Miao等[17]研究發(fā)現(xiàn)小鼠肝癌組織中EPO和EPOR的表達(dá)與HIF呈正相關(guān),缺氧可使肝癌細(xì)胞中EPO和EPOR的表達(dá)量增加。試驗(yàn)檢測(cè)綿羊各組織中EPO和EPOR基因的表達(dá)量結(jié)果顯示,EPO基因在綿羊腎臟的相對(duì)表達(dá)量最高,這表明腎臟是EPO基因的主要合成部位。Jacobson等[18]發(fā)現(xiàn)大鼠產(chǎn)生EPO的主要器官是腎臟,由腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞合成,僅少部分由肝臟、巨噬細(xì)胞和有核紅細(xì)胞產(chǎn)生。EPO具有促進(jìn)紅細(xì)胞的生成、抗炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)免疫功能等多種生物學(xué)功能。當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí),腎臟中的EPO,會(huì)刺激幼稚紅細(xì)胞的增生,血紅蛋白化和紅細(xì)胞的成熟,通過增加紅細(xì)胞數(shù)量,從而增加組織的供氧量。

EPOR是EPO具有高特異性親和力的受體,EPO需與EPOR特異性結(jié)合而激活相關(guān)信號(hào)通路從而發(fā)揮促進(jìn)紅細(xì)胞增殖等功能。試驗(yàn)通過對(duì)綿羊各組織中EPOR基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),EPOR基因在不同組織中廣泛表達(dá),但表達(dá)量有所不同,肺臟相對(duì)高于其它組織。管春燕[19]研究表明,EPOR基因在牦牛和西藏牛的肺臟、腎臟、臀肌等組織中均有表達(dá),其中肺臟的表達(dá)量最高,與研究結(jié)果一致。EPO主要來源于腎臟,可能在機(jī)體具有廣泛的調(diào)節(jié)作用,但是主要作用部位在肺臟。

4 結(jié) 論

HIF-1α和HIF-2α基因均在綿羊肺組織的相對(duì)表達(dá)量最高;在肺臟HIF-2α基因的表達(dá)量約為HIF-1α表達(dá)量的5.2倍。EPO基因在綿羊腎臟的相對(duì)表達(dá)量最高且高于垂體、結(jié)腸、脾臟、盲腸、肝臟、腎上腺、瘤胃、下丘腦以及心臟。EPOR基因在肺臟的表達(dá)量最高,且肺臟和睪丸的相對(duì)表達(dá)量高于脾臟、下丘腦、腎臟、心臟等組織。肺臟和腎臟可能是綿羊缺氧應(yīng)激感受和調(diào)控的重要器官。