邱祥玉，胡金，吳施國(guó)

云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)是一種起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的85%～90%，是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1-2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2018年，全球有84.1萬(wàn)例新確診肝癌病例，而死亡病例已高達(dá)78.1萬(wàn)例，成為臨床死亡率較高的疾病之一[3]。我國(guó)HCC的發(fā)生主要與慢性肝炎病毒感染、酒精、黃曲霉素的攝入有關(guān)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中存在異常的葡萄糖、脂質(zhì)、氨基酸代謝，如葡萄糖有氧糖酵解增加、脂肪酸合成增強(qiáng)以及谷氨酰胺的消耗等，這些代謝改變構(gòu)成了肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和生存的優(yōu)勢(shì)，推動(dòng)著肝癌的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。

此外，HCC起病隱匿，早期缺乏明顯的臨床癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期肝癌，5年生存率僅為10.1%[6]。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、影像學(xué)檢查被用于肝癌的診斷，但研究發(fā)現(xiàn)AFP在肝癌早期并不敏感，且存在假陽(yáng)性[7]。超聲、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computerized tomography，CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)在區(qū)分小肝癌與肝硬化結(jié)節(jié)時(shí)仍存在困難，而早期診斷和識(shí)別是肝癌能否得到及時(shí)有效治療的關(guān)鍵。

近年來(lái)，隨著生命科學(xué)與分析技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，代謝組學(xué)作為一種通用的系統(tǒng)生物學(xué)方法，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)等代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，可對(duì)生物體血液、尿液、糞便和組織中的代謝物進(jìn)行檢測(cè)以發(fā)現(xiàn)特異性代謝物或代謝組[8-9]。代謝組學(xué)具有無(wú)創(chuàng)性、高靈敏性、高特異性的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)肝癌診斷生物標(biāo)志物、揭示肝癌代謝特征、探索中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)、研究中藥及復(fù)方起效機(jī)制等方面，該技術(shù)對(duì)肝癌的診斷、治療、機(jī)制探索起到了重要的推動(dòng)作用?；诖耍疚耐ㄟ^(guò)分析肝癌的代謝特征，并對(duì)代謝組學(xué)在肝癌診斷標(biāo)志物的篩選以及中醫(yī)證候、單味中藥及復(fù)方中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期對(duì)肝癌代謝有更深刻的認(rèn)識(shí)，為深入探索肝癌代謝提供參考。

1 肝癌的代謝特征

與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞具有快速生長(zhǎng)、增殖的特點(diǎn)，因此肝癌細(xì)胞需要通過(guò)對(duì)糖、脂質(zhì)、氨基酸等代謝途徑進(jìn)行重編程，以滿(mǎn)足其增加的生物能量和生物合成需求，以及減輕肝癌細(xì)胞增殖和生存所需的氧化應(yīng)激[10]。此外，腸道菌群失調(diào)也可通過(guò)影響代謝物水平的方式參與到肝癌的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。深入了解肝癌的代謝特征，能更好地了解肝癌的發(fā)病機(jī)制和可能的治療途徑。

1.1 葡萄糖代謝

1.1.1 有氧糖酵解肝癌代謝最突出的特點(diǎn)之一是對(duì)葡萄糖的高需求，而有氧糖酵解是肝癌細(xì)胞利用葡萄糖產(chǎn)能的主要途徑。有氧糖酵解是指即使在氧氣充足的情況下，癌細(xì)胞也傾向于通過(guò)“酵解”的方式代謝葡萄糖以獲取能量，也稱(chēng)瓦伯格(Warburg)效應(yīng)。在有氧糖酵解過(guò)程中，1分子葡萄分解只能產(chǎn)生2分子三磷酸腺苷(adenosine triphosphate ATP)。由于ATP產(chǎn)量極低，所以在代償機(jī)制中，癌細(xì)胞會(huì)顯著提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)(glucose transporters protein，GLUTs)的水平和己糖激酶(hexokinase，HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)等關(guān)鍵代謝酶的活性，以增加對(duì)葡萄糖的攝取和利用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，GLUT1和HK2的表達(dá)顯著增加[12-13]。在有氧糖酵解過(guò)程中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體將葡萄糖運(yùn)輸?shù)桨麧{，在HK作用下不可逆地生成葡萄糖-6-磷酸(glucose 6-phosphate，G6P)[14]。G6P隨著糖酵解的發(fā)生進(jìn)一步產(chǎn)生大量的二羥丙酮磷酸，用于合成三酰甘油以及磷脂；產(chǎn)生3-磷酸甘油酸可以用于合成氨基酸等中間代謝物。這些物質(zhì)將參與到其他代謝途徑用以合成脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、核苷酸，促使癌細(xì)胞增殖[15]。此外，丙酮酸激酶催化磷酸基從磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移到腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)，產(chǎn)生丙酮酸和ATP。丙酮酸在乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LHD)的作用下產(chǎn)生大量乳酸，造成腫瘤微環(huán)境酸化，而酸化的微環(huán)境將抑制淋巴細(xì)胞、M型巨噬細(xì)胞的免疫功能，促使其發(fā)生免疫逃逸，為肝癌細(xì)胞提供更大的生存空間[16]。

由此可見(jiàn)，有氧糖酵解一方面為肝癌細(xì)胞提供大量能量，一方面為生物大分子合成提供中間體，其終產(chǎn)代謝物乳酸還可以作用于腫瘤微環(huán)境(the tumor microenvironment，TME)，支持癌細(xì)胞增殖。

1.1.2 三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)TCA循環(huán)是細(xì)胞在有氧條件下，發(fā)生在線(xiàn)粒體基質(zhì)中的循環(huán)反應(yīng)過(guò)程，是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵途徑之一，也是葡萄糖、脂質(zhì)和氨基酸代謝的中心樞紐[17]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞具有更高的TCA循環(huán)活性，以滿(mǎn)足細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖需求[18]。1分子葡萄糖在細(xì)胞質(zhì)中生成2分子丙酮酸，丙酮酸氧化產(chǎn)生乙酰輔酶A，進(jìn)入TCA循環(huán)，完成葡萄糖的完全代謝，在這個(gè)過(guò)程中產(chǎn)生還原性等價(jià)物NADH和FADH2，這些分子隨后通過(guò)氧化磷酸化(OXPHOS)產(chǎn)生30～32個(gè)ATP。除了葡萄糖，色氨酸、亮氨酸等氨基酸分解代謝以及脂肪酸β-氧化均可生成乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)氧化供能[19]。不僅如此，TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物也經(jīng)常被耗盡，用于脂質(zhì)、氨基酸合成代謝[20]。例如，乙酰輔酶A在檸檬酸合酶(citrate synthase，CS)的催化下生成檸檬酸。檸檬酸作為T(mén)CA循環(huán)中的第一個(gè)產(chǎn)物，不僅可以由烏頭酸酶轉(zhuǎn)化為異檸檬酸，也可以輸出到細(xì)胞質(zhì)中，作為脂質(zhì)生物合成的前體，形成脂肪酸。

此外，TCA循環(huán)中產(chǎn)生的中間代謝物質(zhì)可作為活性分子促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。在TCA循環(huán)中，琥珀酸被琥珀酸脫氫酶(succinic de hydrogenase，SDH)氧化生成延胡索酸。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞中SDH的表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致琥珀酸和延胡索酸的積累，而琥珀酸是一種致癌代謝物[21]。琥珀酸通過(guò)激活琥珀酸受體信號(hào)，觸發(fā)PI3K-HIF-1α軸，介導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[22]。而延胡索酸可以與谷胱甘肽結(jié)合，破壞谷胱甘肽抗氧化的功能，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激[23]。

1.2 氨基酸代謝肝臟是氨基酸代謝的重要器官，在肝癌細(xì)胞中存在明顯的氨基酸代謝紊亂[24]。其中，谷氨酰胺代謝增強(qiáng)是肝癌氨基酸代謝的重要特征。Yang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌與肝硬化患者肝組織中谷氨酰胺顯著升高。Xie等[26]分別對(duì)l0例肝癌患者、10例肝血管瘤和10例健康對(duì)照者的尿液做了代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要富集于谷氨酰胺(glutamine，Gln)/谷氨酸代謝通路。何曉博等[27]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞對(duì)Gln的消耗比正常細(xì)胞高出 5～10倍。雖然Gln是一種非必需氨基酸，但肝癌細(xì)胞的生存嚴(yán)重依賴(lài)于這種氨基酸。

肝癌細(xì)胞除了通過(guò)糖酵解產(chǎn)生能量外，Gln也是其重要的能源物質(zhì)之一。Gln在谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS) 催化下脫去一個(gè)氨基生成谷氨酸，谷氨酸經(jīng)過(guò)谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH) 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，進(jìn)入TCA循環(huán)，產(chǎn)生ATP以供應(yīng)能量所需[28]。研究表明，GLS在增殖的肝癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，可以通過(guò) Wnt信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[29-30]。此外，Gln是用于合成嘌呤、嘧啶和氨基葡萄糖-6-磷酸的氮、碳的重要來(lái)源，合成的嘌呤、嘧啶和氨基葡萄糖-6-磷酸可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[31]。不僅如此，Gln還可以通過(guò)促進(jìn)谷胱甘肽形成以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)肝癌細(xì)胞帶來(lái)的損傷[32]。

1.3 脂質(zhì)代謝脂質(zhì)也稱(chēng)為脂肪，包括脂肪酸、三酰甘油、鞘脂、磷脂、膽固醇等在內(nèi)的多種分子[33]。在肝癌中存在異常的脂質(zhì)代謝，主要表現(xiàn)為異于正常細(xì)胞的脂肪酸合成(fatty acid synthesis，F(xiàn)AS)增強(qiáng)。肝癌細(xì)胞既可以通過(guò)從頭合成途徑產(chǎn)生脂肪酸，也可以通過(guò)脂肪分解途徑產(chǎn)生脂肪酸，其中脂質(zhì)從頭合成在肝癌細(xì)胞中占據(jù)主要地位[34-35]。Gln、乙酸都是肝癌細(xì)胞脂質(zhì)從頭合成的重要來(lái)源。谷氨酰胺脫氨生成為α-酮戊二酸，α-酮戊二酸通過(guò)還原羧化轉(zhuǎn)化為檸檬酸，檸檬酸在ATP-檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase，ACL)作用下可以轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A[36]。乙酸通過(guò)乙酰輔酶A合成酶(acetyl-CoA synthetases，ACSSs)也可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A是脂肪酸合成的必要底物。上述途徑產(chǎn)生的乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylaseα，ACCα)的作用下生成丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)，最后在脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)催化下生成脂肪酸[37]。

脂肪酸不僅是肝癌細(xì)胞增殖中所需合成的大量膜結(jié)構(gòu)的主要成分，還可以作為信號(hào)分子。比如，溶血磷脂酸可以通過(guò)G蛋白偶聯(lián)溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)受體在癌細(xì)胞的質(zhì)膜上通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制發(fā)出信號(hào)，刺激癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成[38]。此外在葡萄糖缺乏時(shí)，脂肪酸還可轉(zhuǎn)化為?；鈮A，在線(xiàn)粒體中經(jīng)β-氧化產(chǎn)生ATP，為肝癌細(xì)胞提供能量，因此脂肪酸合成對(duì)于肝癌細(xì)胞尤為重要[39]。

1.4 氧化應(yīng)激肝臟是自由基產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，超氧自由基(O2-)、羥基自由基(OH-)和過(guò)氧化氫(H2O2)是活性氧的主要形式。當(dāng)ROS的含量增加，超過(guò)細(xì)胞正常的抗氧化能力時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激[40]。此時(shí)，過(guò)量的自由基可攻擊細(xì)胞膜、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致其發(fā)生氧化損傷[41]。人體具有抗氧化系統(tǒng)，通過(guò)滅活或消除ROS，維持氧化物質(zhì)和抗氧化物的平衡，最大限度地減少或防止氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷。谷胱甘肽是肝細(xì)胞中最豐富且具有強(qiáng)大抗氧化性能的非酶抗氧化劑，由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸組成。谷胱甘肽可以直接清除OH-，還可以被谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化為谷胱甘肽二硫化物消耗H2O2以發(fā)揮其抗氧化性[42]。

肝癌細(xì)胞的高代謝伴隨著ROS的增加，為了減輕ROS對(duì)自身的傷害，肝癌細(xì)胞比正常肝細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)谷胱甘肽更大的需求。有研究表明，肝癌患者血清中用以合成谷胱甘肽的3種氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸)顯著增加[43]。Cheng等[44]發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常肝組織相比，肝細(xì)胞癌組織中的谷胱甘肽水平顯著升高，而高水平的谷胱甘肽可維持肝癌細(xì)胞更高的抗氧化應(yīng)激能力。因此，肝癌細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)谷胱甘肽的代謝，逃避氧化應(yīng)激帶來(lái)的傷害，從而最大限制地為自身創(chuàng)造有利的生存環(huán)境。

1.5 腸道菌群肝癌患者存在腸道菌群失調(diào)，失調(diào)的腸道菌群可通過(guò)促進(jìn)肝纖維化、導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、影響代謝物水平等機(jī)制參與肝癌的病理過(guò)程[45-46]。次級(jí)膽汁酸和短鏈脂肪酸是腸道菌群的代謝產(chǎn)物。目前，已有大量研究證實(shí)，腸道菌群的膽汁酸代謝與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。初級(jí)膽汁酸在肝細(xì)胞內(nèi)合成后進(jìn)入腸道，梭菌屬將其脫羥基化、氧化和差向異構(gòu)化形成次級(jí)膽汁酸，而次級(jí)膽汁酸被重吸收后會(huì)對(duì)肝臟造成損傷[47]。脫氧膽酸是常見(jiàn)的次級(jí)膽汁酸，有研究表明，脫氧膽酸可導(dǎo)致DNA損傷，引起肝細(xì)胞老化，老化的肝細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝癌發(fā)生[48-49]。短鏈脂肪酸是腸道菌群酵解膳食纖維而產(chǎn)生的有益代謝產(chǎn)物，在結(jié)腸產(chǎn)生后經(jīng)門(mén)靜脈到達(dá)肝臟及全身。肝癌患者腸道菌群失衡會(huì)導(dǎo)致短鏈脂肪酸嚴(yán)重缺失，而短鏈脂肪酸具有抗癌作用[50]。研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸可以被肝癌細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)特異性識(shí)別后可激活下游死亡受體凋亡途徑，促進(jìn)TNF-α分泌，從而誘導(dǎo)Hepg2肝癌細(xì)胞凋亡[51]。由此可見(jiàn)，腸道菌群失調(diào)引起的代謝物改變是促進(jìn)肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

2 代謝組學(xué)對(duì)肝癌早期診斷和鑒別診斷的推動(dòng)作用

超過(guò)2/3的肝癌患者因診斷晚而得不到及時(shí)、有效的治療，生存率低，而現(xiàn)有的診斷標(biāo)志物并不能滿(mǎn)足臨床實(shí)際需求，尋找新型的敏感、低創(chuàng)的診斷標(biāo)志物已迫在眉睫[52]。利用代謝組學(xué)尋找肝癌早期篩查與診斷標(biāo)志物是肝癌研究的重要方向。

Han等[53]用液相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行非靶向和靶向代謝組學(xué)分析，并結(jié)合肝組織和血清代謝物進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)肝癌患者肝臟中的類(lèi)維生素A含量顯著下降，具有90%的特異性，可用以區(qū)分肝癌患者和健康個(gè)體。其中，視黃醇有望成為一種肝癌候選診斷生物標(biāo)志物。人體絕大部分視黃醇貯存在于肝臟中，因此肝癌的發(fā)展對(duì)視黃醇含量的影響可能比其他類(lèi)型的癌癥更大。

Luo等[54]對(duì)包括肝細(xì)胞癌患者、肝硬化患者、慢性乙型肝炎病毒感染者和健康對(duì)照者在內(nèi)的 1 448 名中國(guó)受試者進(jìn)行研究，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜篩選，確定苯丙氨酸-色氨酸、甘氨膽酸為潛在診斷標(biāo)志物。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這組生物標(biāo)志物的特異性，研究者將胃癌和肝內(nèi)膽管癌患者納入此次研究。在驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，與胃癌患者和肝內(nèi)膽管癌患者相比，肝細(xì)胞癌患者血清苯丙氨酸-色氨酸明顯下降，而甘氨膽酸水平明顯升高，表明這兩種代謝物的結(jié)合可能是區(qū)分肝癌患者和非肝癌患者的理想標(biāo)準(zhǔn)物。

Bai 等[55]通過(guò)定量靶向代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌患者的血清尿素遠(yuǎn)高于慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者和慢性丙型肝炎患者，尿素是肝細(xì)胞癌患者特異性升高的血清生物標(biāo)志物，說(shuō)明尿素可能是肝癌潛在的血清生物標(biāo)志物。同時(shí)該研究數(shù)據(jù)顯示，甲胚蛋白診斷肝癌的敏感性只有60.49%，尿素聯(lián)合甲胚蛋白、癌胚抗原可提高肝癌診斷的敏感性。楊訓(xùn)俊等[56]通過(guò)檢測(cè)肝癌患者、肝硬化患者以及慢性乙型肝炎患者血清中的尿素和甲胚蛋白水平，發(fā)現(xiàn)尿素聯(lián)合甲胚蛋白可用于監(jiān)測(cè)慢性乙型肝炎病情是否發(fā)展及肝癌的診斷上，其特異度可達(dá)90%以上。

Jee等[57]利用代謝組學(xué)分析了75例轉(zhuǎn)移肝癌患者和134名年齡和性別匹配的未轉(zhuǎn)移癌患者的基線(xiàn)血清樣本，試圖找到有價(jià)值的肝癌代謝生物標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸中的花生四烯酸和亞油酸代謝與肝癌的發(fā)病相關(guān)，肝癌組花生四烯酸水平高于無(wú)癌對(duì)照組，花生四烯酸可能在肝癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

單個(gè)癌結(jié)節(jié)直徑小于3 cm，或相鄰的兩個(gè)癌結(jié)節(jié)直徑之和不超過(guò)3 cm的肝細(xì)胞癌被稱(chēng)為小肝癌。小肝癌患者往往伴隨多發(fā)結(jié)節(jié)性肝硬化，且肝硬化的結(jié)節(jié)與腫瘤非常相似[58]，如何區(qū)分小肝癌與肝硬化結(jié)節(jié)仍是影像學(xué)檢查的一個(gè)挑戰(zhàn)，代謝組學(xué)可以為肝癌和肝硬化的鑒別提供策略。Han等[59]通過(guò)靶向代謝組學(xué)研究肝癌與肝硬化肝組織及血清的差異性代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸、溶血磷脂酰膽堿205、琥珀酰腺苷和尿苷是肝癌與肝硬化異質(zhì)性生物標(biāo)志物，提高了肝癌診斷的敏感性和特異性，為臨床區(qū)分肝癌與肝硬化提供了策略。Gong等[60]采用非靶向代謝組學(xué)和靶向花生四烯酸分析研究乙肝致肝硬化和肝癌患者的血清代謝譜，發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中花生四烯酸和甘油磷脂含量高于乙肝-肝硬化患者。有文獻(xiàn)報(bào)道，肝癌血清中鞘脂類(lèi)和溶血卵磷脂等的表達(dá)量顯著高于肝硬化患者，而?；悄懰?、甘氨脫氧膽酸等的表達(dá)量顯著低于肝硬化患者，這些小分子化合物的代謝特征能有效區(qū)分肝硬化和肝癌[61]。

這些研究表明，代謝組學(xué)是肝癌早期診斷和鑒別的一種較有發(fā)展前景的工具，這些研究或許會(huì)發(fā)現(xiàn)能夠早期診斷肝癌患者的代謝生物標(biāo)志物，推動(dòng)肝癌的早期診斷和鑒別。

3 代謝組學(xué)對(duì)肝癌中醫(yī)證型研究的推動(dòng)作用

中醫(yī)的證是建立在司外揣內(nèi)、整體觀念下對(duì)疾病過(guò)程中某一階段病因、病機(jī)和病位的高度概括，與代謝組學(xué)通過(guò)對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行動(dòng)態(tài)化、整體性分析，以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)部變化進(jìn)而認(rèn)識(shí)機(jī)體整體功能狀態(tài)的特點(diǎn)相似[62]。因此，中醫(yī)研究者們也逐漸采用代謝組學(xué)方法研究證候潛在的生物學(xué)基礎(chǔ)和差異性代謝通路，以期用現(xiàn)代研究術(shù)語(yǔ)揭示中醫(yī)證候本質(zhì)[63]。代謝組學(xué)不僅可以區(qū)分同一疾病不同證候，還可以辨別同一證候的不同疾病。

3.1 同病異癥

3.1.1 脾虛濕盛證有學(xué)者對(duì)脾虛濕盛證肝癌患者的血漿代謝組學(xué)、尿液代謝組學(xué)進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示肝癌患者血漿和尿中的檸檬酸含量均明顯低于健康人群[64-65]。脾虛濕盛型肝癌患者血漿中的膽酸水平顯著升高，膽酸可能是肝癌脾虛濕盛證血漿中的候選生物標(biāo)志物之一。此外，肝癌患者尿中牛磺酸水平顯著高于健康人群，且脾虛濕盛證組高于非脾虛濕盛證組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明?；撬峥赡苁瞧⑻摑袷⒆C和非脾虛濕盛證兼?zhèn)涞闹匾x物，而牛磺酸作為膽汁酸鹽的重要組成部分，主要參與脂肪的消化過(guò)程，?；撬崴降奈蓙y提示辨證屬脾虛濕盛證肝癌患者可能存在更為嚴(yán)重的脂質(zhì)代謝失調(diào)。

3.1.2 陽(yáng)虛證陳群偉等[66]應(yīng)用核磁共振波譜技術(shù)分析21例陽(yáng)虛證原發(fā)性肝癌患者和21例非陽(yáng)虛證肝癌患者的血清代謝物，發(fā)現(xiàn)肝癌陽(yáng)虛證組極低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、膽堿、脂類(lèi)、異亮氨酸、乳酸、糖類(lèi)等代謝物較非陽(yáng)虛證組均明顯下降。其中，低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白分別參與膽固醇和三酰甘油的運(yùn)輸，而這可能會(huì)導(dǎo)致脂類(lèi)化合物的異常聚集或利用障礙，說(shuō)明脂質(zhì)代謝紊亂可能是區(qū)別陽(yáng)虛證和非陽(yáng)虛證的代謝特征之一。正常細(xì)胞和肝癌細(xì)胞都要利用葡萄糖產(chǎn)能，葡萄糖有氧糖酵解可以生成丙酮酸，丙酮酸生成乳酸，產(chǎn)生ATP，葡萄糖和乳酸代謝水平的降低一定程度上說(shuō)明陽(yáng)虛證肝癌患者較非陽(yáng)虛證肝癌患者能量生成低下，而能量代謝不足可能是陽(yáng)虛證患者畏寒乏力、肢冷蜷臥的重要原因。

3.2 異病同證中醫(yī)治療是建立在整體觀、辨證論治的基礎(chǔ)之上，證型是指導(dǎo)中醫(yī)遣藥組方的基本依據(jù)，若證型相同，即使是不同疾病，也可以使用同樣的處方。為了探求“異病同證”的共同代謝物，魏濱等[67]對(duì)大腸癌和肝癌術(shù)后患者肝腎陰虛證、脾虛證、濕熱證和隱證的血漿代謝物進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)甘氨酸、色氨酸、尿素是肝腎陰虛證和濕熱證肝癌、大腸癌術(shù)后患者共同升高的代謝產(chǎn)物，其中隱證患者的色氨酸卻是降低的，說(shuō)明色氨酸可能是濕熱證、肝腎陰虛證特征性的代謝物。此外，除了甘氨酸、色氨酸、尿素代謝水平的改變，濕熱證相較于肝腎陰虛證存在更為嚴(yán)重的代謝紊亂，如葡萄糖、甘露醇、山梨醇代謝水平升高，而肝腎陰虛證并無(wú)此代謝改變。甘露醇、山梨醇均為糖類(lèi)分解過(guò)程中產(chǎn)生的物質(zhì)，說(shuō)明濕熱證主要影響糖代謝，而肝腎陰虛證卻主要以氨基酸代謝擾動(dòng)為主。

這些研究有助于從代謝組學(xué)的角度理解“同病異證”“異病同證”下中醫(yī)證候的科學(xué)內(nèi)涵。

4 代謝組學(xué)對(duì)中藥及復(fù)方研究的推動(dòng)作用

“藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用”，單味中藥還是復(fù)方在肝癌的治療中均起到了重要的作用。近年來(lái)，研究者們運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)從代謝物質(zhì)改變的角度闡釋中藥及復(fù)方治療肝癌的起效機(jī)制，而這些研究工作將有利于正確指導(dǎo)中醫(yī)藥在臨床中的運(yùn)用。

4.1 單味中藥及單體的代謝組學(xué)研究

已故女畫(huà)家孫多慈女士是吳健雄一輩子的閨蜜，孫多慈比吳健雄小一歲。她們相識(shí)于中央大學(xué)，那時(shí)她們一個(gè)讀藝術(shù)系，一個(gè)在物理系。孫多慈回憶當(dāng)年青春逼人的吳健雄簡(jiǎn)直是魅力四射、男女通吃：“遠(yuǎn)在民國(guó)20年即1931年，我們同在南京中央大學(xué)讀書(shū)，那時(shí)的健雄是一個(gè)嬌小玲瓏、活潑矯健的女孩子。她是江蘇太倉(cāng)人，一雙神采奕奕的眸子，靈巧的嘴唇，短發(fā)，平鞋，樸素大方但剪裁合身的短旗袍。在兩百左右的女同學(xué)中她顯得那樣地突出，當(dāng)然她也是一般男孩子的追求目標(biāo)。不僅男孩子，女孩子竟也有人為她神魂顛倒呢。”

4.1.1 雙氫青蒿素雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物，不僅具有抗瘧疾、抗炎的作用，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[68]。為了解雙氫青蒿素是否可以通過(guò)影響肝癌細(xì)胞代謝從而抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，王惠國(guó)等[69]以Huh7和BEL-7402肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，采用GC-MS法檢測(cè)雙氫青蒿素干預(yù)后兩種細(xì)胞代謝物的變化。結(jié)果顯示，雙氫青蒿素可影響兩種細(xì)胞的氨基酸代謝。具體來(lái)說(shuō)，雙氫青蒿素可能參與調(diào)解天冬氨酸-丙氨酸-谷氨酸的代謝，抑制兩種肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

4.1.2 苦參堿王珂欣等[70]采用1H-NMR方法研究苦參堿對(duì)人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)苦參堿能顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)外谷氨酸，破壞肝癌細(xì)胞能量代謝，降低細(xì)胞內(nèi)外甘氨酸的量。甘氨酸是合成嘌呤的重要原料，因此降低細(xì)胞內(nèi)外甘氨酸可抑制DNA合成，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖。

4.1.3 青蒿琥酯王惠國(guó)等[71]以Huh7、SMMC-7721肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，運(yùn)用GC-MS技術(shù)研究青蒿琥酯干預(yù)24h后的差異性代謝物，發(fā)現(xiàn)了18種顯著上調(diào)和21種顯著下調(diào)的差異代謝物，主要涉及丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、谷胱甘肽的代謝，而這些氨基酸可作為合成脂類(lèi)、核苷酸的中間代謝物以促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。

4.1.4 鵝掌草三萜皂苷姚詩(shī)琪等[72]建立H22肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，采用GC-MS技術(shù)對(duì)模型組及鵝掌草三萜皂苷高劑量組的腫瘤組織做代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)鵝掌草三萜皂苷可以有效抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與組氨酸代謝有關(guān)。

4.1.5 靈芝多糖有研究證明中藥單體靈芝多糖有抗肝癌作用[73]。于雷等[74]采用Hep G2細(xì)胞構(gòu)建小鼠肝癌模型，收集靈芝多糖干預(yù)組和模型組肝癌小鼠糞便進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖組小鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物乙酸、丙酸、正丁酸3種短鏈脂肪酸水平均顯著高于模型組，表明靈芝多糖可增加腸道菌群有益代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸，發(fā)揮治療肝癌的潛在機(jī)制。

4.1.6 大黃素邢月曉[75]采用核磁共振分析大黃素干預(yù)Hep G2肝癌細(xì)胞的代謝組學(xué)，結(jié)果顯示大黃素可降低甘氨酸和谷胱甘肽的水平，甘氨酸可作為谷胱甘肽的底物，而谷胱甘肽可以維持細(xì)胞氧化還原平衡，其含量顯著降低，提示大黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激代謝引起細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗肝癌作用。

4.1.7 重樓皂苷有研究表明，重樓皂苷作為天然產(chǎn)物具有抗肝癌活性。邱培宇[76]構(gòu)建H22肝癌荷瘤小鼠模型并利用核磁共振方法研究重樓皂苷干預(yù)后的血清代謝組學(xué)。與模型組相比，重樓皂苷治療后，肝癌小鼠血清中磷酸膽堿、極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳酸水平降低，說(shuō)明重樓皂苷參與肝癌脂質(zhì)代謝和能量代謝。

4.1.8 木蝴蝶總黃酮李楠楠等[77]采用二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌模型，并分析木蝴蝶總黃酮干預(yù)后各組大鼠血漿代謝物的變化。與模型組比較，木蝴蝶總黃酮干預(yù)后共有285種差異性代謝物，這些代謝物主要與膽汁酸合成、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝等途徑有關(guān)。亞油酸、花生四烯酸等脂肪酸在腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲以及促血管新生過(guò)程中，均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[78]，而木蝴蝶總黃酮能降低這些代謝物質(zhì)表達(dá)，表明其抗肝癌機(jī)制可能與調(diào)控脂質(zhì)代謝有關(guān)。

4.1.10 紫雛菊Xu等[80]用Hepa1-6細(xì)胞構(gòu)建肝癌荷瘤小鼠模型，采用LC-MS技術(shù)確定L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、D-(+)-色氨酸和棕櫚等14種血清差異代謝物，而高劑量紫雛菊干預(yù)組主要調(diào)節(jié)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成代謝。

4.2 中藥復(fù)方的代謝組學(xué)研究

4.2.1 健脾解毒方劉嘉輝等[81]采用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)肝癌大鼠模型，用代謝組學(xué)的方法研究健脾解毒方(黨參、茯苓、白術(shù)、炙甘草、柴胡、半枝蓮、龍葵、馬齒莧、莪術(shù))抗肝癌的作用機(jī)制。以健脾解毒方干預(yù)2周后，應(yīng)用 GC-MS 技術(shù)檢測(cè)大鼠肝臟組織代謝物，發(fā)現(xiàn)健脾解毒方主要從上調(diào)煙酸和煙酰胺代謝、減少腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)、上調(diào)纈氨酸及異亮氨酸含量改善肝癌的氨基酸代謝紊亂，以及下調(diào)脫氫抗壞血酸水平改善氧化還原狀態(tài)，從而起到抗肝癌的作用。

4.2.2 青蒿鱉甲湯成欣等[82]通過(guò)分析H22原位肝細(xì)胞癌模型小鼠血漿代謝組學(xué)，研究青蒿鱉甲湯(青蒿、鱉甲、生地黃、知母、丹皮)治療癌性發(fā)熱的代謝機(jī)制。在青蒿鱉甲湯連續(xù)給藥14 d后，采用 LC-MS技術(shù)對(duì)給藥組、模型組以及空白組小鼠的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析，篩選出86個(gè)具有顯著差異的代謝物。通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些代謝物主要用于參與膽汁分泌、鞘脂代謝和類(lèi)固醇激素生物合成代謝。

4.2.3 復(fù)方苦參注射液復(fù)方苦參注射液是用于治療癌癥相關(guān)疼痛和肝癌輔助治療的中成藥制劑。Wang等[83]利用1H-NMR技術(shù)對(duì)復(fù)方苦參注射液干預(yù)后的肝癌大鼠血清及肝臟組織中的差異性代謝物進(jìn)行篩選并靶量化，發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液顯著降低了肝癌大鼠血清中檸檬酸、乳酸含量以及肝臟組織中檸檬酸的水平，血清和肝臟中的己糖激酶和丙酮酸激酶水平均顯著升高，3 mL·kg-1的復(fù)方苦參注射液干預(yù)后能顯著抑制己糖激酶和丙酮酸激酶的活性。乳酸是有氧糖酵解的產(chǎn)物，檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，己糖激酶和丙酮酸激酶是有氧糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵的限速酶。該研究說(shuō)明，復(fù)方苦參注射液治療肝癌的機(jī)制可能是抑制糖酵解過(guò)程中關(guān)鍵代謝物(檸檬酸和乳酸)和關(guān)鍵代謝酶的活性，從而干預(yù)肝癌的能量代謝。

4.2.4 艾迪注射液艾迪注射液是由斑蝥、人參，黃芪和刺五加組成的中成藥制劑，臨床用以治療肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌等多種癌癥。有研究報(bào)道，多胺的代謝水平在肝癌中升高，但服用艾迪注射液后，多胺及其代謝物水平有下降趨勢(shì)[84]。為了探求多胺代謝與抗癌活性之間的關(guān)系，Liu等[85]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靶向分析艾迪注射液及拆解組合干預(yù)人肝癌細(xì)胞HL-7702和HepG2后細(xì)胞中的11種多胺代謝。結(jié)果顯示，艾迪注射液對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，艾迪注射液及其拆解組和聯(lián)合組均可不同程度地降低HepG2細(xì)胞多胺代謝水平。

5 結(jié)語(yǔ)

代謝組學(xué)平臺(tái)能夠快速篩選出數(shù)百種代謝物，并同時(shí)監(jiān)測(cè)包括氨基酸、脂類(lèi)、碳水化合物和核苷酸等不同途徑的代謝物，作為肝癌研究的重要手段，該技術(shù)在肝癌代謝研究中展現(xiàn)了巨大的潛力。①肝癌的早期診斷是預(yù)后的關(guān)鍵，但目前缺乏特異性和靈敏性較高的診斷標(biāo)志物，利用代謝組學(xué)尋找肝癌標(biāo)志物是肝癌早期篩查與診斷研究的重要方向。②手術(shù)、介入、放化療仍是肝癌主要的治療方式，但因復(fù)發(fā)性高、遠(yuǎn)期效果不理想等問(wèn)題，肝癌的治療也逐漸趨向于從整體考慮，并不以消除整個(gè)癌腫作為治療目標(biāo)，更強(qiáng)調(diào)”帶瘤生存，與瘤共生”[86]。肝癌具有明顯代謝異常的特征，而干預(yù)腫瘤細(xì)胞代謝、打破腫瘤自身代謝平衡是當(dāng)下切實(shí)可行的一種治療方式[87]。代謝組學(xué)可監(jiān)測(cè)帶瘤生存狀態(tài)下患者的代謝改變，明確藥物治療后的效果，有利于對(duì)代謝治療做出針對(duì)性的指導(dǎo)。③中醫(yī)藥治療肝癌具有較好的效果，但具體機(jī)制需要闡明。代謝組學(xué)系統(tǒng)性、整體性的研究特點(diǎn)與中醫(yī)整體觀、辨證論治思維模式相契合，因此，代謝組學(xué)的應(yīng)用有利于中醫(yī)藥辨證論治下中醫(yī)證候本質(zhì)的探索。此外，中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多層次、多途徑協(xié)同作用的特點(diǎn)是肝癌治療起效的關(guān)鍵，將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到中藥復(fù)方的研究中，能夠探索中藥復(fù)方作用下體內(nèi)代謝物的變化，有助于充分挖掘中藥復(fù)方的作用機(jī)制和療效。

綜上所述，以肝癌為研究對(duì)象的代謝組學(xué)可以為我們提供一個(gè)更大的視角以了解機(jī)體整體代謝活動(dòng)。