王 昕，韓 語，潘紀汶，楊 諾，鄭立新，曾紀鋒，郭桂英，鄭繼平

（1.海南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，?？?570228; 2.海南大學(xué) 校醫(yī)院 ，海口 570228;3.海南大學(xué) 動物科技學(xué)院，?？?570228; 4.海南大學(xué) 理學(xué)院，?？?570228）

女性陰道正常狀態(tài)下存在大量的菌群，這些陰道微生物與宿主之間保持著動態(tài)平衡，而平衡的打破則會導(dǎo)致各種條件致病菌滋生，繼而引發(fā)感染，如陰道炎、宮頸炎。在不同的報道中，陰道炎患者的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）檢出率都處于較高的水平[1-2]，且隨著抗生素的廣泛使用，耐藥性糞腸球菌也在不斷增加。目前，腸球菌（Eenterococcus）在臨床上是作為僅次于金黃色葡萄球菌的第二大類革蘭氏陽性病原菌[3]，而糞腸球菌則是腸球菌中檢出率校高的菌種之一。腸球菌除了對一些臨床常用抗生素如β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素等固有耐藥外，還可通過交換質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等方式對大環(huán)內(nèi)酯類、糖肽類、四環(huán)素類等產(chǎn)生新的獲得性耐藥，這將對使用抗生素進行臨床治療帶來很大的困難。除此以外，腸球菌本身還具備多種毒力基因，如：（1）cylA 是具有殺菌活性的雙肽抗生素，是激活細胞溶素的必要條件之一，可裂解大量真核細胞和革蘭氏陽性細胞；（2）gelE 是細胞外金屬肽酶，可水解明膠酶，膠原蛋白，血紅蛋白和其他生物活性化合物，fsr雙組分系統(tǒng)可調(diào)控其基因表達；（3）esp是參與免疫逃避的膜結(jié)合表面蛋白，其分子量在腸球菌表面最大，與感染有關(guān)；（4）efaA 是一種細胞壁粘附素；（5）cpd是一種性信息素，對人類白細胞有趨化作用；（6）asa1 是一種具有凝集作用的蛋白，可起到增強粘附的作用；（7）ace和acm是一種膠原結(jié)合蛋白，其可使腸球菌結(jié)合在宿主細胞的膠原蛋白上，完成定植，引發(fā)致?。唬?）hyl可產(chǎn)生具有侵襲性作用的透明質(zhì)酸酶[4-8]。這些毒力基因可使糞腸球菌通過黏附、定植以及逃避宿主免疫應(yīng)答等引起一系列的感染[4]。因此，本研究對從女性陰道分離的糞腸球菌進行毒力基因、耐藥基因及其耐藥性等方面的研究，以便為糞腸球菌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陰 道 拭子 樣 品收 集2017 年3 月 至2018年1 月海南大學(xué)校醫(yī)院婦科門診188 名臨床女性患者陰道分泌物拭子（一次性使用無菌拭子）。

1.2 培養(yǎng)基腦心浸出液（Brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、法國科瑪嘉鏈球菌顯色培養(yǎng)基。

1.3 藥敏紙片萬古霉素、青霉素、氨芐西林、紅霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、利奈唑胺、替考拉寧、呋喃妥因、氯霉素，均購于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4 試劑革蘭氏染色試劑盒購于南京建成科技 有 限 公 司；2×F8 Fast Long PCR Master mix、2×A8 Fast HiFi PCR Master Mix、PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒、DL2000 DNA Marker 均購于北京艾德萊生物科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒（Bacterial DNA Isolation Kit）購于北京華越洋生物科技有限公司。

1.5 細菌的分離與鑒定醫(yī)院用無菌拭子采集女性患者陰道后穹窿內(nèi)分泌物，立即放入無菌管-4 ℃保存，隨即轉(zhuǎn)移至實驗室。利用顯色培養(yǎng)基接種菌株，將顏色顯深藍、淺紫色且鏡檢為鏈球狀的單菌落接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取細菌DNA。以DNA 為模板用PCR 的方法進行16S rRNA 鑒定，16S rRNA 引物序列為：F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；R: CGGTTACCT TGTTACGACTT。反應(yīng)體系見表1。PCR 結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送往北京天一輝遠公司進行測序，測序結(jié)果用BLAST 進行序列比對，同源性＞96%的結(jié)果判定為該菌株的鑒定結(jié)果。利用MEGA X 軟件，通過1 000 個重復(fù)計算Bootstrap值，用鄰接法制備了系統(tǒng)發(fā)育樹，并與代表物種進行了比較。從NCBI 獲得以下菌株的參考基因序列：E.faecalis2358 (MT604811.1)、E.faecalisGX26(KU937389.1)、E.faecalis4358 (MT544896.1)、Enterococcus durans98D (NR_036922.1)、Enterococcus hiraeR (NR_037082.1)、Enterococcus raffinosus1789-79 (NR_026499.1)、Enterococcus pseudoavium47-16 (NR_028705.1)、Enterococcus faeciumLMG-11423 (NR_0 42054.1)、Enterococcus aviumE6844(NR_028748.1)、Enterococcus casseliflavusNBRC 100478 (NR_104560.1)、Staphylococcus aureusATCC12600 (NR_118997.2)、Streptococcus agalactiaeATCC13813 (NR_040821.1)。最終對分離到的糞腸球菌進行編號，對菌株分離時間、分離地點等信息進行記錄。然后菌液與30%的甘油以1∶1 的比例存放于-80℃。

表1 16S rRNA 反應(yīng)體系

1.6 毒力基因的檢測參考文獻[9 - 12]，對分離到的糞腸球菌進行10 種毒力基因[腸球菌表面蛋白基因（enterococcus surface protein,esp）、輔助定植因子基因（accessory colonization factor,ace）、膠原蛋白結(jié)合粘附素基因（adhesion of collagen,acm）、明膠酶基因（gelatinase,gelE）、聚集性物質(zhì)基因（aggregation substance,asa1）、細胞溶素基因（cytolysin,cylA）、雙分子調(diào)控系統(tǒng)基因（fsr）、透明質(zhì)酸酶基因（Hyalronidase,hyl）、心內(nèi)膜炎抗原基因（endocarditis antigen,efaA）、性 信 息 素（sex pheromones,cpd）] 的PCR 擴增，引物詳見表2。

表2 毒力基因引物序列

1.7 藥敏試驗按照Kirby-Bauer (K-B)紙片擴散法進行藥敏試驗，統(tǒng)計實驗菌株對抗菌藥物的敏感性。以金黃色葡萄球（S.aureus）ATCC25923為藥敏質(zhì)控菌株，參照美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）最新標準進行實驗。

1.8 耐藥基因的檢測參考文獻[5,13]對分離到的糞腸球菌進行9 種耐藥基因[包括糖肽類耐藥基因vanA、vanB、vanC；氨基糖苷類藥物耐藥基因aac(6')/aph(2')、ant(6)-1；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)基因ermB、mefA；四環(huán)素類藥物耐藥基因tetM，β-內(nèi)酰胺酶基因tem] 的PCR 擴增，引物序列見表3。

表3 耐藥基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離與鑒定從188 名女性陰道分泌物拭子分離出157 株菌，通過顏色（藍色、淺紫色）、鏡檢（鏈球狀）挑選符合糞腸球菌特征的57 株菌進行16S rRNA 鑒定。從57 株臨床標本菌株中得到22 株糞腸球菌，排除同一患者分離的相同菌株。以16S rRNA 構(gòu)建的支序圖如圖1所示。

圖1 糞腸球菌支序圖

2.2 臨床標本分布情況在22 株糞腸球菌中，10 株來自陰道炎患者，5 株來自膀胱炎患者，2 株來自尖銳濕龐患者，1 株來自膀胱刺激癥患者，1 株來自白塞氏病患者，1 株來自子宮內(nèi)膜息肉患者，1 株來自備孕人員，1 株來自人流術(shù)后人員。這些菌株在這些人體內(nèi)并沒有交叉存在的情況。

2.3 毒 力基因檢測結(jié)果以DNA 為 模 板 用PCR 的方法進行毒力基因檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。10 種毒力基因在糞腸球菌中有著很高的檢出率，除hyl未被檢出外，其余9 種基因的檢出率都在50%以上。依檢出率由高到低依次是efaA（100%，22/22）、asa1（90.9%，20/22）、cylA（90.9%，20/22）、fsr（90.9%，20/22）、cpd（90.9%，20/22）、acm（86.4%，19/22）、gelE（81.8%，18/22）、esp（68.2%，15/22）、ace（54.5%，12/22）。

圖2 糞腸球菌毒力基因結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果13 種抗生素的藥敏紙片結(jié)果顯示，糞腸球菌對萬古霉素、呋喃妥因、利奈唑胺、替考拉寧敏感性好，對其他抗菌藥物則均表現(xiàn)不同程度的耐藥，其中對鏈霉素和四環(huán)素的耐藥率較高，具體耐藥率見表4。

表4 糞腸球菌藥敏紙片耐藥率結(jié)果

2.5 耐 藥基因檢測結(jié)果以DNA 為 模 板 用PCR 的方法進行耐藥基因檢測，9 種耐藥基因在糞腸球菌中的檢出結(jié)果如圖3 所示，除了vanA（0%）、vanB（0%）和vanC（18.2%）有著較低的檢出率外，其余6 種基因的檢出率分別為aac(6')/aph(2')（40.9%）、ant(6)-1（59.1%）、ermB（68.2%）、mefA（54.5%）、tetM（72.2%）和tem（81.8%），其中四環(huán)素類耐藥基因和β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因都有著很高的檢出率。

圖3 糞腸球菌耐藥基因結(jié)果

3 討 論

糞腸球菌是女性陰道中正常菌群之一，但當陰道黏膜受損時，就會導(dǎo)致這些條件致病菌群比例失調(diào)引起感染。由于在生理構(gòu)造上十分接近，增強了細菌從陰道轉(zhuǎn)移到泌尿道的可能，因此陰道炎的產(chǎn)生在很大程度上會引起泌尿生殖系統(tǒng)疾病，尤其是尿路感染（UTI）[14]。根據(jù)文獻報道，糞腸球菌是引起尿路感染的主要病原菌[15]。因此，研究該菌毒力基因、耐藥基因及其耐藥性的關(guān)系十分重要，可以為臨床用藥提供參考。近年來腸球菌毒力基因或潛在的毒力基因在糞腸球菌中的分布研究較多，不同來源、不同種糞腸球菌毒力基因檢出率存在較大差異，可能是地區(qū)、人群、標本等不同造成的。22 株來自海南大學(xué)校醫(yī)院分離的菌株中，其9 種毒力基因的檢出率均大于50%，僅有hyl基因未檢出。22 株糞腸球菌攜帶多重毒力基因，所有糞腸球菌可同時表達5 種以上毒力，其中同時含8 種毒力基因的糞腸球菌最多占40.9%，含5 種毒力基因的菌株最少占9.1%，這個結(jié)果與祝進[16]的研究結(jié)果相同。esp的檢出率與許婧[4]的研究結(jié)果相符，均在65%左右，且同樣的hyl未被檢出。gelE具有較高的檢出率，這與Sharifi[17]等的研究結(jié)果相同。cylA 的檢出率一般為40%，而本研究含cylA 的糞腸球菌高達90.9%。祝進[16]的研究樣本來自浙江，cylA、esp和gelE 的檢出率分別為38.9%、52.2%和47.8%。白耀霞[9]等的研究樣本來自江蘇，cylA、esp和gelE 的檢出率分別為30.77%、56.41%和58.97%。祝進[16]與白耀霞[9]等的研究相比，其毒力基因檢出率很是接近。而本研究樣本來源于海南，cylA 和gelE 的檢出率比文獻[9,16]的檢出率有較大的上升幅度，其他基因如asa1、acm、cpd和efaA 和文獻[9,16]相比差別也很大。由此可以反映出，不同地區(qū)糞腸球菌毒力因子的檢出率有較大的差異。cpd基因的存在有助于獲得相關(guān)的性信息素質(zhì)粒，可以獲得相關(guān)的毒力和耐藥決定因素。因此，筆者推測在本研究的分離株中存在多重耐藥可能與cpd基因的高攜帶率有關(guān)[6]。在本研究中efaA 的檢出率高達100%，這與Creti等[5]的研究結(jié)果一致。Eaton[7]等的研究表明，efaA 基因始終存在于醫(yī)學(xué)糞腸球菌分離物中，并且大多數(shù)（89%）來自食品的糞腸球菌菌株具有efaA 決定因子，因此，以efaA 為基因靶，可用于對糞腸球菌的分子檢測。

隨著抗生素的出現(xiàn)和使用，腸球菌的耐藥性逐年升高，已成為主要致病菌。在本實驗中，耐藥表型與基因型相符程度很高，且81.8%的糞腸球菌攜帶2 種以上耐藥基因。自2005 年以來，糞腸球菌對氨芐西林的耐藥率在國內(nèi)呈現(xiàn)逐年下降的趨勢，且維持在10%以下[18]。在臨床上，β-內(nèi)酰胺類抗生素一直被用于治療各種疾病。本研究中糞腸球菌對氨芐西林的耐藥率高達50%，編碼β-內(nèi)酰胺類的基因tem陽性率達81.8%，此結(jié)果暗示海南海口地區(qū)存在氨芐西林使用過度問題，導(dǎo)致該地區(qū)的糞腸球菌對氨芐西林的耐藥性增強。因此，在之后的臨床治療中應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇性使用β-內(nèi)酰胺類抗生素，以防止糞腸球菌選擇性獲得該耐藥基因，給后續(xù)的治療帶來困難。氨基糖苷類抗生素，如慶大霉素整體呈現(xiàn)耐藥率降低的現(xiàn)象[19-21]，本研究中慶大霉素的耐藥率也處于較低的水平。除此以外，其他抗生素的耐藥率都與國內(nèi)現(xiàn)狀基本相同。自1988 年首次報道耐萬古霉素腸球菌（VRE）后，在世界各地都陸續(xù)報道發(fā)現(xiàn)了耐藥菌[22-23]。VRE 分為9 個表型,vanA、vanB、vanC（C1, C2, C3）、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM、vanN，其中VanA 和VanB 是臨床上最常見的耐萬古霉素基因型且有重要臨床意義，且以vanA 最常見[24]。高VRE 的存在給人類的健康帶來了嚴重的威脅，并在部分地區(qū)引起較高的死亡率。在國內(nèi)，除了臺灣地區(qū)VRE 檢出率較高外，其余地區(qū)與世界水平相比，仍處于較低的水平[18,25]。在本試驗中未檢測到攜有vanA 和vanB 的耐藥基因菌株以及耐萬古霉素和耐替考拉寧的菌株，這與其他人的研究結(jié)果相同[19-20,26]，說明?？诘貐^(qū)的糞腸球菌對糖肽類抗菌藥物有著高度敏感性。因此，?？诘貐^(qū)可采用萬古霉素對糞腸球菌進行治療，但要注意用量且及時檢測，以防出現(xiàn)VRE。

本次研究從臨床分離得到的22 株糞腸球菌，其毒力基因檢出率較高，耐藥基因的檢出與耐藥表型結(jié)果基本符合。22 株糞腸球菌對氨芐西林的耐藥率與全國水平相比偏高，推測可能是與當?shù)剡^度使用氨芐西林抗生素有關(guān)，應(yīng)引起注意。但22 株糞腸球菌對萬古霉素、呋喃妥因、利奈唑胺和替考拉寧均無耐藥情況，這為今后的臨床治療提供了一定的科學(xué)用藥參考。