陳欽鎮(zhèn)，李飛航，武浩恒，林向民，王樹啟，陳家林，劉 柱

（1.海南大學 動物科技學院，海口 570228; 2.海南大學 生命科學學院，?？?570228; 3.福建農林大學 生命科學學院，福州 350001; 4.汕頭大學 理學院，廣東 汕頭 515063; 5.廣東海大集團股份有限公司，廣州 510700）

近年來，隨著魚類需求量增加和水產養(yǎng)殖業(yè)不斷擴大，魚類疾病也在威脅著養(yǎng)殖產業(yè)，造成嚴重的經濟損失。集約化生產模式和抗生素的濫用使得魚類疾病難以得到有效的預防和控制，且抗生素的濫用容易產生負面影響，如水產養(yǎng)殖系統(tǒng)中抗生素抗性基因（ARGs）的轉移[1]和耐藥細菌的出現(xiàn)；它們對大多數水生生物具有一定毒性，易殘留且對生態(tài)環(huán)境造成破壞[2]。尋找和研發(fā)抗生素的替代飼料添加劑是目前水產養(yǎng)殖中亟待解決的重大問題。益生菌是一種已被確定的抗生素替代品。聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織 (FAO) 和世界衛(wèi)生組織（WHO）將益生菌定義為當在動物體內定植一定數量后對機體產生有益影響的活性微生物[3]。胃腸道是一個復雜的環(huán)境，有不同的微生物群落聚集，益生菌可以影響腸道微生物群落，減少疾病的發(fā)生[4]，如細菌數量增加、多樣性減少會引起腸道微生物生態(tài)失調，導致疾病。動物機體的免疫也與微生物的組成密切相關[5]。

國內外都有許多關于益生菌對魚類腸道菌群影響的報道，益生菌能夠調節(jié)腸道微生物組成，改善腸道健康[6]。廖慶釗等[7]在羅非魚飼料中添加乙醇假絲酵母，結果表明，投喂乙醇假絲酵母后,羅非魚腸道中梭桿菌門、鯨桿菌屬和艾克曼菌屬等有益菌群的豐度顯著上調，藍細菌門豐度減少。Hongqin 等[8]研究結果表明，在飼料中添加1×105CFU·g-1的丁酸梭菌增加了羅非魚腸道菌群的多樣性和有益菌（如芽孢桿菌）的相對豐度，降低了條件致病菌（如氣單胞菌）的相對豐度。在大黃魚幼魚的飼料中添加丁酸梭菌，改變了大黃魚幼魚腸道微生物群結構，降低了腸道微生物多樣性；添加丁酸梭菌可有效提高大黃魚幼魚腸道中丁酸梭菌的豐度，降低大黃魚幼魚腸道中一些潛在致病菌的豐度，對大黃魚的生長起到促進作用。Goncalves 等[9]在虹鱒魚基礎日糧中添加益生菌，飼喂7 d 后，其腸道微生物多樣性增加，厚壁菌門和梭桿菌門豐度增加，這兩個門的成員具有有益的作用，而變形菌門豐度降低。

如何讓益生菌在使用過程中長久發(fā)揮作用是目前研究的重要關注點。冷凍干燥是生產干燥菌粉的經典方法，干燥過程在真空、低溫下進行，從而減少了熱降解[10]。該方法通過冷凍含有細胞的水溶液并干燥，通過升華去除水分，但益生菌可能由于冰晶的形成、高滲透壓導致的膜損傷、DNA 變性和水分蒸發(fā)而損壞細胞[11]，因此，為了保護益生菌在脫水過程中不被破壞，在冷凍干燥前添加干燥介質作為保護劑[12]。添加保護劑可以提高益生菌在冷凍干燥和儲存過程中的穩(wěn)定性[13]。保護劑在冷凍干燥過程中極為重要，本研究選定脫脂奶粉、海藻糖、乳糖和蔗糖4 種常見保護劑進行篩選，旨在獲得最適合耐硼賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus boronitolerans，YS11）冷凍干燥的保護劑。目前YS11 對羅非魚腸道微生物菌群的影響尚不清楚，因此，本研究探究YS11 對羅非魚幼魚腸道微生物菌群的影響，為羅非魚養(yǎng)殖產業(yè)益生菌使用和病原菌防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物羅非魚作為實驗用魚，魚苗購自海南寶路水產科技有限公司文筆峰養(yǎng)殖基地，共250 尾，初始平均體質量為（1.11±0.26）g。養(yǎng)殖實驗在海南省海南大學實驗室的玻璃缸（30 cm×30 cm×80 cm）中完成。魚預先在實驗室環(huán)境養(yǎng)殖2 周，250 尾魚分5 缸，每缸各有50 尾。在整個實驗過程中使用無氯自來水（自來水靜置過夜以去除余氯）。

1.2 耐硼賴氨酸芽孢桿菌的保存和培養(yǎng)將實驗室篩選到的耐硼賴氨酸芽孢桿菌16S rDNA 數據放入NCBI 中比對，發(fā)現(xiàn)與YS11 有99.83%的相似度。耐硼賴氨酸芽孢桿菌與甘油混合保存于-80 ℃冰箱。菌種復蘇使用1% 的菌體接種，采用LB 液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用分光光度計在600 nm 處的吸光度測定菌液濃度。

1.3 保護劑制備保護劑為5%蔗糖、10%蔗糖、5%海藻糖、10%海藻糖、10%乳糖、20%乳糖、10%脫脂奶粉、20%脫脂奶粉，以1%蛋白胨作為對照組。實驗中使用的保護劑均使用無菌蒸餾水溶解，在115 ℃下滅菌15 min。

1.4 真空冷凍干燥取1% YS11 接種于LB 液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)16 h，取108CFU·L-1的菌體，8 350 r·min-1，離心15 min，PBS 緩沖液洗滌重懸，離心棄上清，分別與1 mL 保護劑混合菌懸液，置于10 mL 離心管中，防止由于真空條件下液體溢出。先放置于-20 ℃冰箱，預冷12～24 h，再放入-80 ℃冰箱，放置5 h，再放入真空干燥機，-55 ℃，0.061 mar，干燥18 h。凍干粉制備完成后，存儲于4 ℃。

凍干粉復蘇：取凍干前同等溶液體積的PBS緩沖液重懸凍干粉。室溫靜置15 min，取100 μL菌懸液稀釋涂板，并計算存活率。

細菌存活率=凍干后活菌數 / 凍干前活菌數 ×100。

1.5 實驗配方與飼料制作以魚粉、豆粕為蛋白源，配菜粕、小麥、面粉、磷酸二氫鈣、維生素A、維生素D3、維生素E、煙酰胺、D-泛酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅等，制成42%粗蛋白及6%粗脂肪的基礎飼料。在基礎飼料中分別添加YS11、發(fā)酵液上清、YS11 加發(fā)酵液上清制備成3 種實驗飼料，分別記為YS11 組、FB 組和FLF 組，其中含有耐硼賴氨酸芽孢桿菌有效活菌數為107CFU·g-1。在基礎飼料中添加LB 液體培養(yǎng)基作為陰性對照組（LB 組），以投喂不添加益生菌的基礎飼料為空白對照組（Control）。飼料質量與液體配比（w/v）為10∶3。每天配制新鮮飼料，保存于4 ℃冰箱，飼喂前先取出放置至室溫再飼喂。1 d 飼喂2 次，日投喂量為魚體質量的7%～10%，分別為上午9：00 與下午4：00，每天排出50%原有的水，加入新鮮的水，并清理干凈羅非魚的糞便，飼喂周期為70 d。

1.6 樣品采集在飼喂70 d 后，分別在5 組中隨機撈取3 尾羅非魚，置于預冷的解剖盤上，解剖取整段腸道，將組織表面血液和結締組織用預冷的PBS 緩沖液沖洗干凈，分裝于EP 管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存，由北京百邁客生物科技有限公司進行腸道微生物高通量測序。

1.7 數據分析SPSS 軟件分析保護劑配方優(yōu)化實驗和羅非魚高通量測序方面的數據 (SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)。采用t檢驗來檢測5%顯著性水平下的差異。

2 結果與分析

2.1 保護劑對YS11 存活率的影響篩選最佳保護劑的濃度（表1），對照組對YS11 無法起到保護作用，凍干后存活菌數為（0.03±0.002 1）×108CFU·mL-1，存活率僅有0.19%，遠小于其他凍干保護劑的存活率。與對照組相比，4 種保護劑均起到了保護細菌免受低溫凍傷的情況。不同濃度的保護劑對細菌起到的保護作用也不相同，對比2 個蔗糖濃度下的細菌存活率，10%蔗糖組的存活率為9.20%，而5%蔗糖組的存活率為5.86%。對比2 個海藻糖濃度下的細菌存活率，10%海藻糖組的存活率為11.48%，而5% 海藻糖組存活率為4.64%。對比2 個乳糖濃度下的細菌存活率，10%乳糖組的存活率為9.93%，而20% 乳糖組的存活率為6.84%。對比2 個脫脂奶粉濃度下的細菌存活率，10%脫脂奶粉組的存活率為11.16%，而20% 脫脂奶粉組的存活率為2.42%。通過保護劑篩選實驗的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)YS11在10%海藻糖的保護下，能夠在干燥后保持較高的存活率。

表1 保護劑對YS11 存活率的影響

2.2 YS11 對腸道微生物群的結構變化的影響

從16S rDNA 基因的V3 V4 擴增子中產生1 198 583 對Reads，雙端 Reads 質控、拼接后共產生 1 195 379 條 Clean Reads，每個樣品至少產生79 369 條 Clean Reads ，平均產生79 692 條 Clean Reads。組裝的序列平均長度為410 bp。截止97%的操作分類單位聚類產生了整個數據集的總共10 247 個操作分類單位。用α多樣性和β多樣性對樣品內部和樣品之間的微生物復雜性進行分析。從維恩圖中顯示（圖1-A），Control 組、LB 組、YS11 組、FB 組、FLF 組 共 有 特 征 個 數680 個OTUs，YS11 組、FB 組、FLF 組 中 特 征 個 數 的OTUs 數量分別為6、3 和4。從稀釋性曲線中（圖1 -B），筆者發(fā)現(xiàn)15 個樣本中，YS11 組、FB 組、FLF 組微生物多樣性有相似的趨勢，接近飽和平臺，Control 組、LB 組微生物多樣性有相似的趨勢?；谡w群落組成的β多樣性分析而言，表明添加YS11 后，腸道微生物群的聚集相似程度較高。對10 247 個OTUs（按97%序列同一性分組）的UniFrac 主坐標分析（PCoA）表明（圖1-C），對照組和處理組有明顯的分離，且對照最相同處理的樣品具有較高的分散性，處理組沒有顯示出與對照的單獨聚類，3 個處理組出現(xiàn)較高的聚集。通過非加權組平均法（UPGMA）分析進行樣品層次聚類（圖1-D），YS11、FB、FLF 組的腸道微生物群結構相似，聚集在較高的分支內，而Control 組和LB 組與處理組不同，聚集在較低的分支內。

圖1 腸道微生物群結構變化

2.3 YS11 對 腸 道微生物組 的 分 類 組 成 的 影 響

為了確定YS11 是如何影響羅非魚腸道微生物群落，在腸道微生物不同的分類尺度上，比較3 組不同處理組的微生物群落差異。在門、屬、種水平上最豐富的細菌分類群（前10 個）出現(xiàn)在所有魚類腸道樣本中。在門水平上（圖2-A），羅非魚腸道內變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）構成4 個最主要的細菌群落門，其中變形桿菌門在FB 組和FLF 組的相對豐度高于其他組，在FLF 組中厚壁菌門的相對豐度顯著高于其他組，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿 菌 門（Acidobacteria）、疣 維 菌 門（Verrucomicrobia）、巴氏桿菌門（Patescibacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）。在屬水平上（圖2-B），羅非魚腸道內非培養(yǎng)微桿菌科（uncultured bacterium Microbacteriaceae）、博斯氏菌 屬（Bosea）、非 培 養(yǎng) 根 瘤 菌 科（uncultured bacterium Rhizobiaceae）、鯨 蠟 桿 菌 屬（Cetobacterium）為主要細菌屬。在種水平上（圖2-C），羅非魚腸道內非培養(yǎng)微桿菌科（uncultured bacterium Microbacteriaceae）、非培養(yǎng)博斯氏菌屬（uncultured bacteriumBosea）、非培養(yǎng)根瘤菌科（uncultured bacterium Rhizobiaceae）、非培養(yǎng)鯨蠟桿菌（uncultured bacteriumCetobacterium）為主要細菌種。

圖2 微生物群落分布分析

2.4 YS11 對腸道微生物菌群中益生菌和病原菌的影響為了檢測羅非魚腸道中病原菌和益生菌的變化，從腸道微生物屬水平菌群相對豐度數據中，計算有益菌和病原菌增加或者減少的讀數。結果顯示桿菌屬、梭菌屬在FLF 組與對照組相比中存在顯著差異，數量增加。放線菌屬、雙歧桿菌屬和乳桿菌屬無顯著差異（表2）。氣單胞菌屬和愛德華氏菌屬在對照組和處理組中均存在顯著差異，數量顯著減少，其中愛德華氏菌屬在處理組中的數據均降為0（表2）。

表2 YS11 對腸道微生物菌群中益生菌和病原菌增加或減少的讀數 /條

3 討 論

本實驗在前人研究[14-20]的基礎上，采用海藻糖、蔗糖、脫脂奶粉和乳糖作為YS11 的保護劑，利用保護劑克服了由于低溫對細胞結構破壞導致干燥后存活率低的影響，并篩選出最佳保護劑濃度，結果表明10%海藻糖在保護細菌免受冷凍干燥過程中的損傷較為出色，使細胞在冷凍干燥后仍具有較強的活性，且有利于長期保存。

魚腸道內環(huán)境復雜，由復雜多樣的微生物群組成，這些微生物相互作用，影響宿主的各種功能，包括營養(yǎng)、消化發(fā)育、免疫和抗病能力[21]。本研究結果表明，通過在基礎飼料中添加YS11，可以調節(jié)羅非魚腸道微生物群向更有益的微生物群落發(fā)展。由稀釋性曲線、PCoA 分析和UPGMA分析可知，在OTU 水平上，3 個處理組與對照組間的微生物群落分布差異較大，對照組間差異較小，且對照組的多樣性減少，YS11 的菌體和發(fā)酵液對羅非魚腸道微生物群的影響較為相近，可以調節(jié)腸道微生物群的結構，增加腸道微生物的多樣性和豐度，說明YS11 對腸道微生物群發(fā)育起到積極作用。本研究結果與前人研究結果相同，即添加益生菌后，能夠從稀釋性曲線、PCoA 分析和UPGMA 分析中發(fā)現(xiàn)處理組和對照組中存在顯著差異。

Hongqin 等[8]在大黃魚幼魚期向飼料中添加丁酸梭菌，結果表明在處理組中，幼魚腸道中的微生物物種豐度下降，顯著提高丁酸梭菌屬的豐度，降低某些潛在病原菌的豐度。在門水平上，大黃魚腸道中以變形菌門、厚壁菌門和放線菌門為主要優(yōu)勢菌。在屬水平上，檢測到雷辛格氏菌、假單胞菌和不明梭狀芽孢桿菌為大黃魚腸道中的優(yōu)勢菌屬。在種水平上，耐冷假單胞菌、丁酸梭菌、糞產堿菌成為腸道菌群群落的優(yōu)勢種。Tan 等[22]研究報道，從尼羅羅非魚腸道中分離出的1 株菌株為穩(wěn)定乳桿菌（Rummeliibacillus stabekisii），飼喂8 周益生菌后，結果表明，處理組中益生菌相對豐度高，如桿菌屬和乳酸菌屬顯著高于對照組，而病原菌如葡萄球菌和鏈球菌的相對豐度顯著低于對照組。

本研究結果表明，在微生物群落門水平上，變形桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、梭桿菌門為最主要的細菌群落門。與對照組相比，處理組放線菌門豐度較低，厚壁菌門和變形菌門豐度較高；在屬水平上，處理組博斯氏菌屬和鯨醋桿菌屬豐度較高，F(xiàn)LF 組根瘤菌豐度顯著增加。根瘤菌有利于纖維素分解和果膠分解[23]，鯨醋桿菌能夠抵抗膽汁，代謝肽和碳水化合物產生乙酸[24]。屬水平上益生菌和病原菌數量變化的結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，病原菌如愛德華氏菌屬和氣單胞菌屬的豐度下降；益生菌如桿菌屬、梭菌屬的豐度上升。愛德華氏菌于2013 年首次被發(fā)現(xiàn)，是侵染全球大多數魚類的病原體，傳播速度快，宿主多，對水產養(yǎng)殖業(yè)造成大量經濟損失[25]。氣單胞菌屬中有許多種是危害水產的病原菌，如維氏氣單胞菌[26]、嗜水氣單胞菌[27]等。結果表明，YS11 能夠使腸道微生物中的病原菌數量減少，同時使益生菌數量增加。在門水平上，與前人研究結果大致相同，變形菌門的變化有所不同，在屬和種水平上，與前人研究結果不同，可能是因為使用的益生菌不同，或者實驗魚不同，對微生物菌群影響也不盡相同。在屬水平上，YS11 還能夠使愛德華氏菌屬豐度下降，表現(xiàn)出更好的抑制病原菌的能力，同時促進桿菌屬豐度的增加，且促進梭菌屬豐度增加，與之前研究結果一致[8,20]。

4 結 論

通過研究飼料中添加益生菌耐硼賴氨酸芽孢桿菌YS11，對羅非魚腸道微生物群落的影響，結果表明，添加益生菌后，腸道微生物群落發(fā)生變化，益生菌生存環(huán)境得到改善，有利于羅非魚的生長。本研究的創(chuàng)新點在于探究耐硼賴氨酸芽孢桿菌YS11 對羅非魚腸道微生物群落的影響尚未見報道，本研究的不足在于本實驗選取時間點較少。