孫 玲,程宇坤,劉 鵬,馬麗榮,王繼慶,耿洪偉

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/優(yōu)質(zhì)專用麥類作物工程技術(shù)研究中心,新疆烏魯木齊 830052; 2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 新疆烏魯木齊 830052; 3. 德州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,山東德州 253015)

小麥?zhǔn)侵袊匾募Z食作物[1],品質(zhì)改良是其主要的育種目標(biāo)之一[2]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)與面粉色澤、面團(tuán)流變學(xué)特性、面制品營養(yǎng)品質(zhì)有關(guān),是影響面制品最終加工品質(zhì)的重要因素[3-5]。

研究表明,SOD活性是由多基因控制的數(shù)量性狀,受環(huán)境影響較大,但主要由遺傳因素決定[6-8]。研究發(fā)現(xiàn),不同小麥材料籽粒的SOD活性不同,適當(dāng)?shù)蜏乜墒筍OD活性升高,其中在4 ℃時(shí)最高,在2 ℃時(shí)最低[9];小麥葉片的SOD活性隨著鹽濃度的升高而降低,這可能是由于活性氧含量的增加破壞了抗氧化防御系統(tǒng)的功能[10];低濃度PEG-6000脅迫處理時(shí),黑麥草葉片的SOD活性升高,隨著濃度的升高,SOD活性逐漸下降[11]。Wu等[12]和Beak等[13]將控制小麥籽粒Mn-SOD(含錳超氧化物歧化酶)活性相關(guān)基因定位到2A、2B和2D染色體長臂,將控制小麥籽粒Cu/Zn-SOD(含銅鋅超氧化物歧化酶)活性基因定位到7A、7B和7D染色體長臂;王繼慶等[8]利用國內(nèi)外冬小麥為材料,結(jié)合90K SNP芯片進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-Wide Association Analysis, GWAS),在5A染色體上檢測到控制小麥籽粒SOD活性貢獻(xiàn)率最高的位點(diǎn)(基因ID為TraesCS5A01G290800,本研究將其命名為TaSOD-A1),且該位點(diǎn)在3個(gè)環(huán)境下均能檢測到;趙永亮等[14]在2D染色體Xfbb377～Xfbcd410的區(qū)段也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)影響SOD活性的位點(diǎn)。

目前對小麥籽粒中過氧化物酶(peroxidase,POD)、脂肪氧化酶(lipoxygenase,LOX)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)等抗氧化酶及其與小麥品質(zhì)性狀的相關(guān)性研究已較為深入,并開發(fā)了相應(yīng)的功能標(biāo)記[15-17],但對小麥籽粒中SOD活性及其相關(guān)基因等位變異的研究還未見有報(bào)道。本研究在測定117份新疆小麥品種(系)籽粒SOD活性的基礎(chǔ)上,結(jié)合功能標(biāo)記SODA1和SODA11對小麥5A染色體上TaSOD-A1基因的等位變異進(jìn)行檢測,分析等位變異與SOD活性的相關(guān)性,以期利用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)培育高SOD活性的小麥新品種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料共計(jì)117份,包括24份新疆春小麥品種(系)和93份新疆冬小麥品種(系)。其中,24份新疆春小麥品種(系)包括2000年以來的近期自育品種(系)20份,2000年之前的早期自育品種(系)4份;93份新疆冬小麥品種(系)包括17份地方品種、35份引進(jìn)品種(系)和41份自育品種(系)。這些材料來自新疆不同區(qū)域,代表新疆小麥不同時(shí)期的狀況,由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遺傳育種課題組提供。新疆春小麥分別在2017、2018、2019年,冬小麥分別在2016-2017、2017-2018、2018-2019連續(xù)3個(gè)年度種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院瑪納斯實(shí)驗(yàn)站,隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),行長2 m,行距0.25 m,株距0.1 m,每個(gè)品種(系)種植3行,2個(gè)重復(fù)。田間管理與當(dāng)?shù)乇３忠恢?小麥長勢良好,正常收獲,為避免品種混雜,人工脫粒。

1.2 SOD活性檢測

SOD活性測定按照王繼慶等[8]的方法。將小麥籽粒去雜后,稱取10 g過0.8 mm旋風(fēng)磨,取0.1 g全麥粉置于2 mL離心管中,加入1 mL SOD提取介質(zhì)并振蕩混勻,在搖床上冰浴2 h后,10 000 r·min-1搖培15 min,取上清液(SOD粗酶液)4℃保存。SOD活性測定選用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法,反應(yīng)總體系為300 μL,包括0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液150 μL,滅菌水20 μL,130 mmol·L-1的甲硫氨酸(Met)溶液30 μL,750 μmol·L-1的氮藍(lán)四唑(NBT)溶液30 μL,100 μmol·L-1的EDTA-Na230 μL以及20 μmol·L-1的核黃素溶液30 μL,最后加入10 μL粗酶液,室溫條件下于560 nm波長處測定吸光度。每個(gè)品種的SOD活性重復(fù)測兩次,若兩次結(jié)果相差超過10%,則需重復(fù)測定。SOD活性以抑制NBT光還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示,單位為U·g-1。

1.3 DNA提取及質(zhì)量鑒定

用SDS法[3]提取DNA,并用紫外分光光度計(jì)和電泳檢測DNA的純度。紫外分光光度計(jì)檢測時(shí),OD260/OD280的比值是衡量核酸純度的標(biāo)準(zhǔn)之一,比值在1.7～2.0之間表明DNA純度較好,低于1.7表明含有其他雜質(zhì),高于2.0表明DNA已經(jīng)降解。電泳檢測時(shí),取5 μL DNA和1 μL 6×Loading Buffer進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,以條帶單一不拖帶為宜。

1.4 TaSOD-A1位點(diǎn)等位變異檢測

利用本課題組前期開發(fā)的功能標(biāo)記SODA1和SODA11檢測小麥5A染色體上TaSOD-A1位點(diǎn)的等位變異,引物信息見表1,由上海生工生物有限公司合成。以小麥基因組DNA為模板,在Eppendorf PCR儀(Eppendorf,德國)上進(jìn)行PCR分析。SODA1標(biāo)記在含有TaSOD-A1a等位變異的材料中可以擴(kuò)增出1 419 bp的片段,而在含有TaSOD-A1b等位變異的材料中無擴(kuò)增片段;SODA11標(biāo)記在含有TaSOD-A1b等位變異的材料中可以擴(kuò)增出2 567 bp的片段,而在含有TaSOD-A1a等位變異的材料中無擴(kuò)增片段。SODA1和SODA11標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系均為25 μL,包括模板DNA(100 ng·μL-1) 1 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,2×Taq Master Mix(with dye)(諾唯贊,南京) 12.5 μL,無菌水補(bǔ)足至25 μL。SODA1標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,63.7 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min;4 ℃保存。SODA11標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸2.5 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min;4 ℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后,進(jìn)行凝膠成像分析。

表1 檢測 TaSOD-A1位點(diǎn)等位變異的引物信息

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010及IBM SPSS statistics 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),根據(jù)方差方程的Levene檢驗(yàn)判斷兩組數(shù)據(jù)方差是否相等,然后查看對應(yīng)的T值及顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型新疆小麥籽粒的SOD活性

117份新疆小麥品種(系)在3個(gè)環(huán)境下的籽粒SOD活性平均值分別為1 607.65、 1 593.85和1 589.07 U·g-1,變化范圍分別為1 351.54～1 808.71、1 329.59～1 762.22、1 340.93～1 782.29 U·g-1,3個(gè)環(huán)境下的SOD活性相關(guān)系數(shù)在0.73～0.79之間,呈顯著相關(guān),所有材料取3個(gè)環(huán)境下SOD活性的平均值作為最終SOD活性值。117份新疆小麥品種(系)的籽粒SOD活性在1 360.38 ～ 1 741.04 U·g-1之間,平均值為1 596.86 U·g-1,其中冬小麥平均值 (1 607.30 U·g-1)高于春小麥平均值(1 556.39 U·g-1)。新疆春小麥近期品種(系)的籽粒SOD活性平均值(1 561.20 U·g-1)高于早期品種(系)的籽粒SOD活性平均值(1 549.10 U·g-1);冬小麥地方品種(系)的籽粒SOD活性平均值最高(1 640.44 U·g-1),引進(jìn)品種(系)的籽粒SOD活性平均值次之(1 620.93 U·g-1),自育品種(系)的籽粒SOD活性平均值最低(1 581.93 U·g-1),但均無顯著差異(表2)。

表2 不同類型新疆小麥品種(系)的籽粒SOD活性

2.2 TaSOD-A1位點(diǎn)等位變異類型的檢測結(jié)果及其與SOD活性的關(guān)系

利用前期開發(fā)的TaSOD-A1位點(diǎn)功能標(biāo)記SODA1和SODA11,對117份新疆小麥品種(系)進(jìn)行等位變異檢測,結(jié)果(圖1)顯示,24份新疆春小麥品種(系)中,3份材料用SODA1標(biāo)記可擴(kuò)增出1 419 bp的片段,說明這些材料含有TaSOD-A1a;21份材料用SODA11標(biāo)記可擴(kuò)增出2 567 bp的片段,說明這些材料含有TaSOD-A1b。93份新疆冬小麥品種(系)中,56份材料用SODA1標(biāo)記可擴(kuò)增出1 419 bp的片段,說明這些材料含有TaSOD-A1a;37份材料用SODA11標(biāo)記可擴(kuò)增出2 567 bp的片段,說明這些材料含有TaSOD-A1b。

A:SODA1標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果;B:SODA11標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果。M1:DL2000;M2:DL5000;1:新春22;2:新春34;3:新春30;4:新冬7號;5:新冬21號;6:新春03;7:新春40;8:新春26;9:新春27;10:新春31。

進(jìn)一步分析含有TaSOD-A1位點(diǎn)不同等位變異新疆小麥品種(系)的籽粒SOD活性,發(fā)現(xiàn)TaSOD-A1a等位變異類型材料的籽粒SOD活性在1 514.48～1 741.04 U·g-1之間,TaSOD-A1b等位變異材料的籽粒SOD活性在 1 360.38～1 715.53 U·g-1之間,且TaSOD-A1a等位變異材料的籽粒SOD活性平均值(1 628.71 U·g-1)顯著高于含有TaSOD-A1b等位變異材料的平均值(1 564.46 U·g-1),說明TaSOD-A1a是改善面制品色澤和營養(yǎng)品質(zhì)的優(yōu)異等位變異類型。在新疆冬小麥的引進(jìn)品種(系)中,TaSOD-A1a等位變異材料的SOD活性平均值(1 634.59 U·g-1)顯著高于TaSOD-A1b等位變異材料的平均值(1 584.78 U·g-1)(表3),進(jìn)一步證明了SODA1和SODA11標(biāo)記的準(zhǔn)確性較高,可輔助選育高SOD活性的小麥品種。

表3 含有TaSOD-A1位點(diǎn)不同等位變異的新疆小麥品種(系)的籽粒SOD活性

2.3 新疆冬小麥和春小麥 TaSOD-A1位點(diǎn)的不同等位變異分布

從表3可以看出,117份新疆小麥品種(系)中,59份材料含有TaSOD-A1a等位變異,占比50.4%;58份材料含有TaSOD-A1b等位變異,占比49.6%。24份新疆春小麥品種(系)中,3份材料含有TaSOD-A1a等位變異,占比12.5%,21份材料含有TaSOD-A1b等位變異,占比87.5%;93份新疆冬小麥品種(系)中,56份材料含有TaSOD-A1a等位變異,占比60.2%,37份材料含有TaSOD-A1b等位變異,占比39.8%。新疆24份春小麥全部為自育品種(系);新疆冬小麥品種(系)中,TaSOD-A1a等位變異的分布頻率高低依次為引進(jìn)品種(系)(30.1%)>自育品種(系)(19.4%)>地方品種(10.8%);TaSOD-A1b等位變異的分布頻率高低依次為自育品種(系)(24.7%)>地方品種(7.5%)=引進(jìn)品種(系)(7.5%)。

3 討 論

3.1 新疆小麥品種(系)的SOD活性

目前SOD活性檢測有鄰苯三酚自氧化法、氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法、黃嘌呤氧化酶-NBT等方法[18-21],其中NBT光還原法的靈敏度較高[22]。本研究用此方法檢測新疆小麥品種(系)的籽粒SOD活性,發(fā)現(xiàn)3個(gè)環(huán)境下籽粒SOD活性的變化幅度最大值為457.20 U·g-1,且3個(gè)環(huán)境間的SOD活性顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)在0.73～0.79之間,表明NBT光還原法檢測小麥籽粒SOD活性的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較高。檢測結(jié)果表明,新疆小麥品種(系)的籽粒SOD活性平均值(1 596.86 U·g-1)低于中國四個(gè)麥區(qū)主要種植品種的籽粒SOD活性平均值(北部冬麥區(qū)1 801.74 U·g-1,西南冬麥區(qū)1 787.21 U·g-1,黃淮冬麥區(qū)1 771.19 U·g-1,長江中下游冬麥區(qū) 1 759.67 U·g-1)[8],原因可能是新疆屬于干旱地區(qū),年降水量較少,同時(shí)還會遭遇高溫等逆境脅迫,最終導(dǎo)致小麥品種(系)籽粒SOD活性的升高,但這一結(jié)果也印證了環(huán)境會影響SOD活性。新疆冬小麥籽粒SOD活性平均值(1 607.30 U·g-1)明顯高于新疆春小麥籽粒SOD活性平均值(1 556.39 U·g-1),說明新疆冬小麥品種(系)可用于高SOD活性小麥的改良。在新疆冬小麥品種(系)中,地方品種和引進(jìn)品種(系)的籽粒SOD活性相等,且較高,因此地方品種是新疆小麥品質(zhì)改良的主要著力點(diǎn),育種工作要積極推廣地方品種,同時(shí)加大引進(jìn)外地品種的力度,才能加快新疆小麥品質(zhì)改良的進(jìn)程。

3.2 TaSOD-A1位點(diǎn)功能標(biāo)記的實(shí)用性驗(yàn)證

功能標(biāo)記因操作簡單和高效,廣泛應(yīng)用于作物育種中。小麥籽粒SOD活性影響面制品的加工品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)[4-5],培育高SOD活性的小麥新品種具有重要意義。本研究用TaSOD-A1位點(diǎn)的功能標(biāo)記SODA1和SODA11對新疆小麥品種(系)進(jìn)行等位變異檢測,發(fā)現(xiàn)TaSOD-A1位點(diǎn)的等位變異與SOD活性顯著相關(guān),其中含有TaSOD-A1a等位變異材料的籽粒SOD活性平均值(1 628.71 U·g-1)顯著高于含有TaSOD-A1b等位變異的材料(1 564.45 U·g-1)。但同時(shí)也存在個(gè)別等位變異類型與預(yù)測SOD活性高低不相符的情況,且含有TaSOD-A1a等位變異材料的籽粒SOD活性也并非總是高于含有TaSOD-A1b等位變異材料的籽粒SOD活性。其原因可能是小麥基因組中除TaSOD-A1位點(diǎn)外,還存在其他與籽粒SOD活性相關(guān)的基因/QTL。王繼慶等[8]研究表明,SOD活性為數(shù)量性狀,由多基因控制,在多個(gè)染色體上均含有微效基因,不同基因的互作效應(yīng)以及同一基因不同位點(diǎn)的差異都是導(dǎo)致SOD活性差異的原因。后續(xù)將開發(fā)5B、5D等其他染色體上的功能標(biāo)記,通過不同標(biāo)記的組合更有效地篩選高SOD活性的品種,為小麥SOD活性改良提供參考。

3.3 新疆小麥品種(系) TaSOD-A1位點(diǎn)等位變異的分布規(guī)律

93份新疆冬小麥品種(系)中,含有與高SOD活性相關(guān)的TaSOD-A1a等位變異材料占比為60.2%,其中引進(jìn)品種(系)占比最高,地方品種占比最低,說明引進(jìn)品種(系)是優(yōu)異等位變異的主要力量,新疆早期的育種工作主要圍繞地方品種展開,外地品種(系)的引入在很大程度上提高了優(yōu)異等位變異的數(shù)量;24份新疆春小麥品種(系)中,只有3份近期品種(系)為優(yōu)異等位變異類型,占比12.5%,說明新疆地區(qū)早期對小麥籽粒SOD的關(guān)注度較低,對籽粒SOD活性與小麥品質(zhì)的相關(guān)性研究較晚。作物的產(chǎn)量與品質(zhì)之間存在一定的負(fù)相關(guān)[23],為解決溫飽問題,中國主要注重小麥的產(chǎn)量,而對小麥品質(zhì)的改良直到20世紀(jì)后期才受到關(guān)注,這可能會導(dǎo)致品質(zhì)較好的小麥品種被淘汰。在今后的新疆小麥育種工作中,應(yīng)把注意力放在來自國內(nèi)外的優(yōu)良外引品種(系)上,才能加快小麥的品質(zhì)改良進(jìn)程。

4 結(jié) 論

新疆冬小麥品種(系)的籽粒SOD活性平均值明顯高于新疆春小麥品種(系)。功能標(biāo)記SODA1和SODA11可以較好地區(qū)分TaSOD-A1位點(diǎn)的等位變異TaSOD-A1a和TaSOD-A1b,進(jìn)而預(yù)測SOD活性的高低,外引品種(系)是新疆小麥SOD活性改良的主要力量。