河南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心 喬禮

鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心 羅俊霞

酶抑制法農(nóng)藥殘留快速檢測試劑盒是基于有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對動物體內(nèi)膽堿酯酶的抑制作用研制的。進行檢測時，在膽堿酯酶及其底物（乙酰膽堿）的共存體系中加入農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液，當樣品中含有不同濃度的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥時，酶活性受到不同程度抑制，乙酰膽堿被酶催化水解的程度發(fā)生變化，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑的變色反應亦隨之發(fā)生變化；反之，如果試樣提取液中未含有該兩類農(nóng)藥，酶的活性不被抑制，試樣中加入的底物被酶催化水解，其產(chǎn)物與加入的顯色劑反應的變色程度較大。目測顏色的變化或用分光光度計測定吸光度在一定時間內(nèi)的變化值，計算出抑制率，可以粗略判斷樣品中是否含有該兩類農(nóng)藥殘留。該方法的核心試劑是酶，而酶來源廣泛，不同來源及來源于同一生物體不同部位的酶活性均不相同，對農(nóng)藥的敏感性也存在較大差異，由此衍生出的兩種快速檢測試劑盒對農(nóng)藥的敏感性也各不相同，因此在日常檢測工作中應用該方法的檢測結(jié)果同樣品實際時常不符，出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。為了全面了解市售酶抑制-比色法農(nóng)藥殘留快速檢測試劑盒的品質(zhì)，使其在農(nóng)產(chǎn)品檢測與監(jiān)管工作中發(fā)揮更大作用，特安排本試驗，以期為使用者提供一定的借鑒作用。

一、材料與方法

（一）試驗儀器

上海復博農(nóng)業(yè)科技有限公司、上海博納新技術(shù)研究所生產(chǎn)的16 通道、CL-BIII 型農(nóng)殘速測儀；杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)的SHA-C 型、雙重恒溫水浴振蕩器；WH-861 型旋渦混合器；北京三二八科學儀器有限公司生產(chǎn)的HH.W21-Cr 420 型電熱恒溫水浴鍋；Thermo 品牌的200μL 和Rongtai 品牌的 5 mL 移液槍。

（二）試劑及其配制方法

1. 產(chǎn)自深圳的永道品牌的酶抑制-比色法農(nóng)藥殘留快速檢測試劑盒；試驗用水為純凈水；使用前，采用500 mL 的純凈水溶解緩沖鹽得到緩沖溶液；使用3 mL的緩沖溶液配制酶和顯色劑；使用3 mL 的純凈水配制底物。

2.農(nóng)藥標準品。辛硫磷、喹硫磷、敵敵畏、氧化樂果、毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲、伏殺硫磷、蠅毒磷、水胺硫磷、倍硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對硫磷、對硫磷22 種有機磷類農(nóng)藥和涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威、涕滅威砜5 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

農(nóng)藥標準品濃度為1000 mg·L-1，來源于農(nóng)業(yè)環(huán)境保護科研檢測所，使用時先稀釋成80 μg· mL-1的儲備液，試驗時按照需要進行吸取。

（三）試驗設計

試驗分別取適量農(nóng)藥標準品于一次性燒杯中，按照2 g 稱樣量，使農(nóng)藥的質(zhì)量濃度分別為0.05 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1、1 mg·kg-1、2 mg·kg-1、3 mg·kg-1，每 一種農(nóng)藥設5 個濃度梯度；每個濃度水平3 次重復。

1.測試方法。對照液和農(nóng)藥測試：對照液和農(nóng)藥的測試方法參照國標進行；設定2.5 mL 和3 mL 兩種樣品提取體積。分別移取2.5 mL 和3 mL 的緩沖溶液和樣品提取液于10 mL 一次性試管中，再依次加入100μL 酶、100μL 顯色劑，旋渦混勻，在37℃條件下水浴10 min，之后加入100μL 底物搖勻，將對照液和樣品同時放入16 通道的CL-BIII 型農(nóng)殘速測儀比色池中進行檢測（對照液放第一通道）；儀器根據(jù)第一通道測定的對照3 min內(nèi)吸光度的變化值自動計算得到抑制率，記錄抑制率。

2.數(shù)據(jù)處理。選取5 種農(nóng)藥在各濃度水平下3 次測定所得抑制率的加權(quán)平均值在0～100%的濃度值，用Excel 將抑制率和農(nóng)藥濃度常用對數(shù)的散點圖進行線性擬合，得到濃度-效應曲線方程、求出相關(guān)系數(shù)及每一種農(nóng)藥對各種試劑盒的半抑制濃度IC50。根據(jù)濃度-效應曲線方程y=kx+b求得y=50%時對應的x軸的值，IC50=10x；線性范圍是指抑制率為0 對應最大的濃度值到測定的最大的抑制率對應的濃度值之間的范圍；同樣求出IC10。

因食品安全國家標準中規(guī)定新鮮蔬菜中毒死蜱、甲基對硫磷、氧化樂果的最大限量分別為0.05 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1，個別試劑盒測定這3 種農(nóng)藥的IC50的最大值分別為6.70 mg·kg-1、9.924 mg·kg-1、10.397 mg·kg-1，其對應的IC10的值分別為0.940 mg·kg-1、1.620 mg·kg-1、2.781 mg·kg-1，均大于國家的限量標準，因此，本試驗將IC10設定為試劑盒的檢測限，以此比較不同的試劑盒對不同農(nóng)藥的敏感性；IC10越低，說明試劑盒對該農(nóng)藥越敏感。當IC10＜10-3mg·kg-1，試劑盒對農(nóng)藥極敏感；當10-3mg·kg-1＜ IC10＜ 10-1mg·kg-1，試劑盒對農(nóng)藥較敏感；當10-1mg·kg-1＜IC10＜1 mg·kg-1，試劑盒對農(nóng)藥不太敏感；當IC10≥1 mg·kg-1，試劑盒對農(nóng)藥不敏感。

通過試驗的結(jié)果比較2.5 mL 和3 mL 的樣品提取體積對測定結(jié)果的影響和該試劑盒對不同的有機磷農(nóng)藥的敏感性。

二、結(jié)果與分析

經(jīng)過測定，試劑盒測定蠅毒磷和甲基異柳磷，當提取液取用3 mL 時，抑制率同農(nóng)藥濃度之間不存在線性關(guān)系，當提取液取用2.5 mL 時，在農(nóng)藥5 個濃度水平下，抑制率均為0。無論樣品提取液取用3 mL 還是2.5 mL，測定水胺硫磷和倍硫磷，抑制率同農(nóng)藥濃度之間不存在線性關(guān)系；伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對硫磷、對硫磷7 種農(nóng)藥，在5 個濃度水平下，抑制率均為0。也就是說該試劑盒對蠅毒磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、倍硫磷、伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對硫磷、對硫磷11 種農(nóng)藥極不敏感。

（一）取用3 mL 樣品提取液試驗

由表1 知，當提取液取用3 mL 時，試劑盒對16 種農(nóng)藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、辛硫磷、涕滅威、喹硫磷、涕滅威砜、敵敵畏、氧化樂果、毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲的順序依次降低。試劑盒對涕滅威亞砜、克百威農(nóng)藥極為敏感，其IC10均在10-3mg·kg-1以下，占所測試農(nóng)藥總數(shù)的7.41 %；試劑盒對滅多威、辛硫磷、涕滅威、喹硫磷4 種農(nóng)藥較為敏感，其IC10均在10-3～10-1mg·kg-1，占所測試農(nóng)藥總數(shù)的14.81%；試劑盒對涕滅威砜、敵敵畏、氧化樂果3 種農(nóng)藥不太敏感，其IC10在 10-1～1 mg·kg-1，占所測試農(nóng)藥總數(shù)的11.11%；試劑盒對毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲極不敏感，其IC10在1 mg·kg-1以上，占所測試農(nóng)藥總數(shù)的25.93%，總體上講，試劑盒極不敏感的農(nóng)藥占所測試農(nóng)藥的66.67%。

表1 提取液取用3 mL 時試劑盒對16 種農(nóng)藥的敏感性對照

（二）取用2.5 mL 樣品提取液試驗

由表2 可知，當提取液取用2.5 mL 時，試劑盒對16 種農(nóng)藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威、喹硫磷、涕滅威砜、敵敵畏、辛硫磷、氧化樂果、久效磷、毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、伏殺硫磷、馬拉硫磷、敵百蟲、殺撲磷的順序依次降低。試劑盒對涕滅威亞砜、克百威農(nóng)藥極為敏感，其IC10均在10-3mg·kg-1以下，占所測試農(nóng)藥總數(shù)的7.41 %；試劑盒對滅多威、涕滅威、喹硫磷3 種農(nóng)藥較為敏感，其IC10均在 10-3～10-1mg·kg-1，占所測試農(nóng)藥總數(shù)的11.11%；試劑盒對涕滅威砜、敵敵畏、辛硫磷、氧化樂果4 種農(nóng)藥不太敏感，其IC10在10-1～1 mg·kg-1，占所測試農(nóng)藥總數(shù)的14.81%；試劑盒對久效磷、毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、伏殺硫磷、馬拉硫磷、敵百蟲、殺撲磷極不敏感，其IC10在1 mg·kg-1以上，占所測試農(nóng)藥總數(shù)的29.63%，總體上講，試劑盒極不敏感的農(nóng)藥占所測試農(nóng)藥的66.67%

表2 提取液取用2.5 mL 時試劑盒對16 種農(nóng)藥的敏感性對照

三、結(jié)論與討論

從IC10看，在所測試的27 種農(nóng)藥中，試劑盒對蠅毒磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、倍硫磷、伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對硫磷、對硫磷11種農(nóng)藥極不敏感，測定時樣品提取液無論是取用3 mL還是2.5 mL，在設定的5 個農(nóng)藥濃度水平下，抑制率 為0或者抑制率同農(nóng)藥濃度之間無線性關(guān)系。在用該試劑 盒測定實際樣品時，當樣品中含有這11 種農(nóng)藥中的任意一種或者幾種（在食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量中規(guī)定的限量以上、在3 mg·kg-1以下），用該試劑盒測定將出現(xiàn)假陰性；當樣品中含有涕滅威亞砜，其含量大于2.041 7×10-4mg·kg-1、小于食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量中規(guī)定的限量時，用該試劑盒測定將出現(xiàn)假陽性。因此，試劑盒對各農(nóng)藥敏感性的巨大差異是導致試劑盒檢測樣品出現(xiàn)假陽性和假陰性的原因之一。

根據(jù)《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的規(guī)定，采用永道試劑盒進行檢測，按照50%的判定閾值進行判定，在所測定的27 種農(nóng)藥中，只有當樣品中含有涕滅威砜、克百威時可以報出陽性，含有其他25種農(nóng)藥均只能報出陰性，因此，建議國標和行標修改判定閾值。