劉德春 楊文彬 肖嘯 楊懿 謝紅威 李威 顏奧琦

摘要：結(jié)合UV-Vis吸收光譜、熒光光譜和黏度測(cè)試法，系統(tǒng)研究了Tris-HCl（pH=7.25）緩沖溶液中U（VI）－鈣黃綠素（CA）配合物與鯡魚精DNA（hsDNA）的相互作用機(jī)理。通過摩爾比率法確定U（VI）-CA-hsDNA體系的結(jié)合比nU（VI）∶nCA∶nhsDNA=1∶2∶1。以雙倒數(shù)法計(jì)算出此體系在不同反應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，熱力學(xué)計(jì)算表明U（VI）-CA-hsDNA的反應(yīng)是疏水力驅(qū)動(dòng)進(jìn)行的自發(fā)行為。結(jié)合熒光分析、Scatchard法分析和溶液黏度變化分析，證明U（VI）-CA配合物對(duì)hsDNA的熒光猝滅為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)混合猝滅過程，作用方式為嵌插和非嵌插的混合結(jié)合模式。實(shí)驗(yàn)表明U（VI）-CA配合物嚴(yán)重影響hsDNA的生物功能。

關(guān)鍵詞：鯡魚精DNA放射性U（VI）鈣黃綠素?zé)晒忖?/p>

中圖分類號(hào)：O657.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1671-8755（2023）01-0022-09

Abstract：ViathemeasurementapproachesofUV-Visabsorptionspectrum，fluorescencespectrumandviscosity，theinteractionmechanismbetweenU（VI）-calcein（CA）complexandherringspermDNA（hsDNA）intheTris-HClbuffersolution（pH=7.25）wassystematicallyinvestigated.BindingratioofU（VI）-CA-hsDNAwasdeterminedasnU（VI）∶nCA∶nhsDNA=1∶2∶1bymolarratiomethod.BindingconstantsofU（VI）-CA-hsDNAcomplexatdifferenttemperatureswereobtainedbydoublereciprocalmethod，andtheevaluatedthermodynamicdataindicatedthattheformationofU（VI）-CA-hsDNAcomplexwasspontaneousanddrivenbyhydrophobicforce.Combinedwiththefluorescenceanalysis，scatchardmethodanalysisandsolutionviscositychangeanalysis，thefluorescencequenchingmodeofhsDNAbyU（VI）-CAcomplexwasprovedtobeamixeddynamic-staticquenchingprocess，andtheactionmodewasamixedcombinationmodeofintercalationandnonintercalation.TheexperimentalresultsshowthattheU（VI）-CAcomplexseriouslyaffectsthebiologicalfunctionofhsDNA．

Keywords：HerringspermDNA;RadioactiveU（VI）;Calcein;Fluorescencequenching

鈾在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科技領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。作為重要的放射性核素之一，即使在低濃度下也具有嚴(yán)重的毒性［1］，其不當(dāng)?shù)暮筇幚砘蚺欧艜?huì)對(duì)地面和含水層造成嚴(yán)重的環(huán)境威脅，因此，鈾及其各種衍生物的分析監(jiān)測(cè)受到廣泛關(guān)注［2］。含鈾廢物在水中易溶解、輸運(yùn)和沉淀，若處理不當(dāng)而排入水體中，在微生物作用下將產(chǎn)生更多有毒金屬有機(jī)物，通過食物鏈富集進(jìn)入人體，從而對(duì)人體健康造成嚴(yán)重影響［3］。因此，探索放射性鈾及其有機(jī)小分子活性配合物與生物大分子的作用方式，對(duì)了解放射性核素危害人體健康的致病機(jī)理具有重要意義。

生物體細(xì)胞核中的重要遺傳物質(zhì)DNA大分子由糖磷酸骨架和4個(gè)核堿基組成［4］，它控制著蛋白質(zhì)的合成和儲(chǔ)存遺傳信息［5］，在基因轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)、癌變和突變中起著至關(guān)重要的作用。因此，DNA常作為研究各種抗腫瘤和抗癌藥物的生物活性靶分子［6］。研究各種小分子及其金屬離子的配合物與DNA的相互作用機(jī)理，對(duì)于設(shè)計(jì)能夠識(shí)別特定DNA位點(diǎn)的新型高效藥物具有重要意義［7］。近年來，有學(xué)者開展了小分子及其各種金屬離子配合物與DNA結(jié)合的研究［8］。然而，放射性U（VI）及其各種有機(jī)小分子活性配合物與DNA的相互作用機(jī)理卻鮮有報(bào)道。研究鈾及其有機(jī)小分子活性配合物與DNA的結(jié)合方式，可以從分子水平上了解鈾及其小分子活性配合物對(duì)人體健康的影響，準(zhǔn)確推進(jìn)針對(duì)靶向癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的無毒高效藥物的作用機(jī)理研究和開發(fā)［9］。UV-Vis吸收和熒光光譜具有測(cè)量簡(jiǎn)單、快速且靈敏的特點(diǎn)，是研究小分子與生物大分子之間作用機(jī)理的最有效方法［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)在生理pH值條件下利用多光譜法研究了U（VI）-鈣黃綠素活性配合物與鯡魚精DNA的相互作用機(jī)理，為放射性鈾在環(huán)境科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)領(lǐng)域的毒性預(yù)防、評(píng)價(jià)及相關(guān)藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1試劑

鯡魚精DNA（BR級(jí)，純度＞99.0%，分子量為17736g·mol-1），上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（BR級(jí)）、NaOH（AR級(jí)）、HCl（AR級(jí)）、茜素紅（AR級(jí)）、鈣黃綠素（AR級(jí)），成都市科隆化學(xué)品有限公司；硝酸鈾（AR級(jí)），北京化工廠。所有實(shí)驗(yàn)溶液均使用生物反應(yīng)最優(yōu)pH值的Tris-HCl緩沖溶液制備。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1UV-Vis吸收光譜測(cè)定

UV-Vis吸收光譜測(cè)量在UV-3150分光光度計(jì)（日本京都島津公司）和1.0cm石英比色皿上進(jìn)行。吸收光譜的測(cè)定分3步進(jìn)行，首先在系列10mL比色管中用Tris-HCl緩沖溶液配制固定濃度的U（VI），CA和hsDNA溶液（cCA=1×10-3mol·L-1，cU（VI）=1×10-3mol·L-1和chsDNA=1×10-5mol·L-1），以相應(yīng)pH值的緩沖溶液為空白參比溶液，掃描三者之間在20℃下相互作用的吸收光譜以確定最佳反應(yīng)pH值。其次，配制最佳反應(yīng)pH值下的U（VI），CA和hsDNA溶液（濃度同上一步），在石英比色皿中加入3.5mL相關(guān)溶液，采用滴定法測(cè)定U（VI）與CA相互作用的吸收光譜。最后，以摩爾比法得到U（VI）與CA反應(yīng)的結(jié)合比，配制此結(jié)合比下的一定濃度的U（VI）-CA配合物溶液，采用滴定法測(cè)定其與hsDNA在不同溫度下相互作用的吸收光譜。每次掃描光譜前均將比色皿中的樣品溶液充分混合并恒溫5min，體積效應(yīng)忽略不計(jì)，下同。

1.2.2熒光光譜測(cè)定

熒光光譜測(cè)量在F-4600熒光分光光度計(jì)（日本日立高科技公司，1.0cm石英比色皿）上進(jìn)行。測(cè)量過程分為3個(gè)步驟：首先，不同反應(yīng)溫度下U（VI）-CA-hsDNA三相作用體系熒光猝滅光譜的測(cè)定采用1×10-3mol·L-1濃度的U（VI）-CA配合物溶液滴定1×10-5mol·L-1濃度的hsDNA溶液。其次，以3×10-4mol·L-1茜素紅作為熒光探針，固定hsDNA濃度為1×10-6mol·L-1，在室溫25℃下測(cè)定hsDNA和U（VI）-CA配合物不同混合摩爾比（0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0）的熒光光譜。最后，通過測(cè)量U（VI）-CA-hsDNA溶液從30℃升溫至90℃的最大特征熒光峰（掃描步長(zhǎng)為10℃）的變化來確定U（VI）-CA-hsDNA配合物的熔點(diǎn)溫度（Tm），這里固定U（VI）-CA-hsDNA配合物的濃度為1×10-3mol·L-1。所有熒光光譜測(cè)定條件設(shè)置為中等速度，狹縫寬度5nm，幅度為2，波長(zhǎng)310nm。

1.2.3U（VI）-CA-hsDNA反應(yīng)體系黏度的測(cè)定

使用烏氏黏度計(jì)（0.6mm）在25℃水浴中進(jìn)行反應(yīng)體系溶液的黏度變化測(cè)量。hsDNA和U（VI）-CA配合物溶液的濃度均固定在1×10-4mol·L-1。加入2mLhsDNA溶液于10mL比色管中，分別加入不同量（0～8mL）的U（VI）-CA溶液，以Tris-HCl緩沖溶液稀釋制備系列不同濃度的U（VI）-CA-hsDNA三相體系溶液。分別在黏度計(jì)中加入不同濃度的U（VI）-CA-hsDNA溶液，重復(fù)3次測(cè)定各樣品的流動(dòng)時(shí)間t。溶液比黏度η0和η值由η=（t-t0）/t0進(jìn)行計(jì)算［11］，其中t和t0分別代表在添加不同濃度U（VI）-CA配合物和單獨(dú)緩沖溶液存在下hsDNA的流出時(shí)間；η和η0分別代表添加和沒有添加U（VI）-CA配合物的hsDNA溶液的比黏度。

2結(jié)果及分析

2.1溶液pH值對(duì)U（VI）-CA-hsDNA配合物形成的影響

CA在不同的溶液pH值條件下與放射性U（VI）離子或hsDNA反應(yīng)時(shí)，其UV-Vis吸收光譜特征峰的吸光度值和位置會(huì)發(fā)生明顯變化，從而可確定體系反應(yīng)的最佳pH值。如圖1所示，CA溶液在323nm和493nm出現(xiàn)兩個(gè)特征吸收峰。將各反應(yīng)體系在493nm處的特征吸收峰的吸光度變化值和紅移值列于表1中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)U（VI）-CA和U（VI）-CA-hsDNA系統(tǒng)在pH值7.25時(shí)存在最大的吸光度降低值和紅移值，表明此pH值為U（VI）-CA-hsDNA配合物形成的最佳值，它接近人體生理pH值，符合hsDNA大分子的生物學(xué)條件。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在pH=7.25下進(jìn)行。

2.2U（VI）-CA-hsDNA配合物形成的UV-Vis吸收光譜分析

CA與U（VI）的結(jié)合率可以通過分光光度滴定法的UV-Vis吸收光譜計(jì)算得到［12］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)U（VI）-CA配合物在493nm特征峰處的吸光度值隨U（VI）量的增加而顯著降低，并產(chǎn)生一定程度的紅移（圖2（a），每滴10μL，0-13對(duì)應(yīng)0～130μL）。通過摩爾比法可求得此特征峰處U（VI）-CA配合物的結(jié)合比nU（VI）∶nCA=1∶2（圖2（b））［13］。采用相同的方法，在λ=492nm處可確定U（VI）-CA-hsDNA三相體系的結(jié)合比nU（VI）∶nCA∶nhsDNA=1∶2∶1（圖2（c）和圖2（d），cU（VI）-CA=5.0×10-5mol·L-1，chsDNA=1.0×10-6mol·L-1，每滴10μL，0-30對(duì)應(yīng)0～300μL）。根據(jù)朗伯-比爾定律（吸光度A=εbc，b=1cm），U（VI）-CA和U（VI）-CA-hsDNA配合物在20℃下的表觀摩爾吸光度（ε）分別為5.11×104L·mol-1·cm-1和7.33×104L·mol-1·cm-1。

2.4U（VI）-CA配合物對(duì)hsDNA的熒光猝滅機(jī)理

圖5為不同溫度下滴加U（VI）-CA配合物的hsDNA溶液的熒光光譜（λex=310nm，λem=391nm，pH=7.25）。從圖5可見，hsDNA溶液的熒光強(qiáng)度隨著U（VI）-CA量的增加而顯著降低，但最大發(fā)射波長(zhǎng)隨溫度的升高而產(chǎn)生明顯的紅移現(xiàn)象，表明hsDNA的構(gòu)象產(chǎn)生了改變（圖5（a）、圖5（b）和圖5（c））。同時(shí)，在475nm附近出現(xiàn)了一個(gè)等熒光強(qiáng)度點(diǎn)，表明U（VI）-CA配合物對(duì)hsDNA產(chǎn)生了嵌插作用［17］。由于hsDNA蛋白隨溫度升高而變性，導(dǎo)致U（VI）-CA-hsDNA溶液的熒光強(qiáng)度隨溫度升高而降低［18］?；谀柋确?，計(jì)算出U（VI）-CA-hsDNA配合物在不同溫度下的結(jié)合比nhsDNA∶nU（VI）-CA=1∶1（圖5（d）），與UV-Vis吸收光譜的分析結(jié)果相同。

為了進(jìn)一步探索U（VI）-CA對(duì)hsDNA的猝滅機(jī)理，假設(shè)熒光猝滅是動(dòng)態(tài)猝滅過程，因此可用Stern-Volmer方程來描述［19］：

2.5U（VI）-CA配合物與hsDNA之間的結(jié)合模式分析

由于茜素紅（AR）分子可以嵌入DNA鏈雙螺旋的堿基對(duì)中，從而增加其熒光強(qiáng)度。因此，AR可用作熒光探針來研究U（VI）-CA配合物與hsDNA之間的相互作用。AR對(duì)U（VI）-CA-hsDNA體系的影響可通過熒光Scatchard方程進(jìn)行分析［24］：

式中：r是指每個(gè)核苷酸結(jié)合配合物的量；c是游離配合物的濃度；n是r的最大值；K是單個(gè)位點(diǎn)固有的結(jié)合常數(shù)。根據(jù)r的定義，可得：

U（VI）-CA是否嵌插入hsDNA的螺旋雙鏈中，可以通過測(cè)定U（VI）-CA-hsDNA不同溫度下的變性溫度（Tm）來確定。因?yàn)镈NA的變性溫度一般在70℃左右，如果嵌入劑嵌入DNA的雙鏈堿基對(duì)中，則可以提高DNA螺旋雙鏈的穩(wěn)定性和Tm值；反之，非嵌入結(jié)合會(huì)導(dǎo)致Tm值增加不明顯［27］。測(cè)定U（VI）-CA-hsDNA配合物在不同加熱溫度下的系列熒光光譜，以最大特征峰處的熒光值比Ft/F0為縱坐標(biāo)、加熱溫度為橫坐標(biāo)繪制U（VI）-CA-hsDNA配合物的熱變性曲線如圖8所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在U（VI）-CA配合物存在下，hsDNA的Tm為80℃，表明U（VI）-CA配合物已嵌入hsDNA的雙螺旋堿基對(duì)中［28］。

雖然光學(xué)探針可以提供必要但不充分的線索來探索二者的結(jié)合模式，但流體動(dòng)力學(xué)測(cè)量對(duì)溶液中結(jié)合模式的長(zhǎng)度變化卻很敏感［29］。即，hsDNA與U（VI）-CA配合物的結(jié)合模式可以通過黏度測(cè)量進(jìn)一步驗(yàn)證。當(dāng)嵌入劑嵌入DNA后會(huì)增長(zhǎng)DNA的雙螺旋鏈，導(dǎo)致DNA溶液的黏度顯著增加。反之，小分子配合物部分或非嵌入DNA的雙螺旋鏈中卻會(huì)降低DNA溶液的黏度，這是因?yàn)榉乔度虢Y(jié)合不會(huì)明顯增加DNA溶液的黏度［30］。如圖9所示，hsDNA溶液的相對(duì)黏度值隨著U（VI）-CA配合物的增加量而降低，并最后趨于平衡。進(jìn)一步證明U（VI）-CA與hsDNA的相互作用模式確實(shí)為嵌入和非嵌入結(jié)合模式。

3結(jié)論

本文結(jié)合UV-Vis吸收光譜、熒光光譜、熱變性和黏度測(cè)量法研究了U（VI）與鈣黃綠素和U（VI）-CA配合物與hsDNA之間的相互作用，獲得了U（VI）-CA-hsDNA的結(jié)合比（摩爾比1∶2∶1）、結(jié)合作用力和結(jié)合方式等信息和數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明U（VI）-CA配合物和hsDNA的結(jié)合是受焓驅(qū)動(dòng)的自發(fā)作用，前者對(duì)hsDNA的猝滅過程是由動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅相結(jié)合引發(fā)的，二者之間的作用方式為采用嵌插和非嵌插混合的結(jié)合模式。本文結(jié)果為了解放射性核素對(duì)人體的致病機(jī)理和尋找新的能夠識(shí)別特定DNA位點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物提供了理論和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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