單體江　謝銀燕　葉大航等

關(guān)鍵詞：短枝木麻黃；根際放線菌；青枯病菌；次生代謝產(chǎn)物；抗細(xì)菌活性

中圖分類號(hào)：S792.93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-1498（2023）04-0139-10

短枝木麻黃（Casuarina equisetifolia L.）為木麻黃科（Casuarinaceae）木麻黃屬（Casuarina）常綠喬木，原產(chǎn)于澳大利亞、太平洋諸島以及亞洲東南部，喜高溫多濕氣候，適生于海岸的疏松沙地。木麻黃生長迅速、耐干旱，并具有防風(fēng)固沙、耐鹽堿和生物固氮等特殊功能，被廣泛用于熱帶和亞熱帶沿海防護(hù)林的建設(shè)，是我國東南和華南沿海地區(qū)不可替代的沿海防護(hù)林樹種和當(dāng)家樹種，同時(shí)也是重要的經(jīng)濟(jì)林和園林綠化樹種。近年來，由于抗病品種缺乏、栽培經(jīng)營措施不當(dāng)以及自然災(zāi)害等因素的影響，木麻黃病蟲害的發(fā)生也日趨嚴(yán)重，其中，青枯病是發(fā)生規(guī)模最大、危害最嚴(yán)重的病害。木麻黃青枯病是由勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種系統(tǒng)性維管束病害，被稱為木麻黃的“癌癥”或“絕癥；青枯病也是目前世界范圍內(nèi)傳播廣泛、危害嚴(yán)重、最難防治的重大細(xì)菌性病害之一，可危害54個(gè)科的450余種植物。木麻黃青枯病的大面積發(fā)生，嚴(yán)重制約著沿海木麻黃防護(hù)林的健康發(fā)展，對我國東南沿海的生態(tài)環(huán)境和生態(tài)安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，目前尚無有效的防控措施。

根際微生物是受植物影響最大的土壤微生物類群，蘊(yùn)含著極其豐富的微生物資源。根際土壤中的有益微生物可通過直接或間接的方式促進(jìn)植物生長、防治由病原菌引起的多種植物病害。因此，根際微生物是重要生物活性產(chǎn)物的來源，探究和開發(fā)根際微生物為生物防治病蟲害問題以及提高農(nóng)林業(yè)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供了廣闊前景。放線菌是根際微生物中一類重要的微生物資源，目前基于微生物源活性先導(dǎo)化合物而研發(fā)的抗生素、免疫抑制劑、抗真菌、抗腫瘤以及抑制炎癥等藥物絕大多數(shù)來源于放線菌。Elshafie等從金合歡（Vachellia farnesiana （L.） Wight＆Arn.）和油橄欖（Canarium oleosum （Lam.） Engl.）中分離到2株根際放線菌可以很好的保護(hù)番茄（Solanum lycopersicum L.）免受核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的侵染；方正等從金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）根際土壤中分離出164株放線菌，其中，部分放線菌對多種供試細(xì)菌均表現(xiàn)出抑菌活性；葉景靜等從紅樹林根際土壤中分離出88株放線菌，其中，7株放線菌對至少一種供試細(xì)菌具有抗菌活性；吳佳等從纈草（Valeriana officinalis L.）根際土壤中共分離出118株放線菌，其中，33株放線菌對病原菌有較好的抑制效果；Kumari等發(fā)現(xiàn)，植物根際放線菌的粗提物對金黃色葡萄球菌（Staph y/ococcusaureus）、變形桿菌（Proteus vulgaris）以及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）表現(xiàn)出明顯的抑制作用。放線菌可產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物抑制某些病原菌生長，促進(jìn)植物生長發(fā)育，一些放線菌還可以侵染植物誘導(dǎo)其產(chǎn)生大量的活性次生代謝產(chǎn)物。木麻黃是一種特殊類型的共生營養(yǎng)型植物，對木麻黃共生固氮菌和菌根菌的研究一直是木麻黃研究的熱點(diǎn)。Gunasekera等從木麻黃固氮根瘤中分離到Frankia sp.、Micromonospora sp.和新的共生放線菌鏈霉菌屬（Streptomyces sp.），其中，鏈霉菌屬放線菌能明顯促進(jìn)木麻黃側(cè)根的生長。而目前對于木麻黃根際土壤放線菌的報(bào)道較少，Abhijit等從印度不同地區(qū)的木麻黃根際土壤中共分離到14株鏈霉菌屬放線菌，其中部分放線菌對3種供試細(xì)菌（Bacillus subtilis、Escherichiacoli和Xanthomonas citri）中的1種或2種表現(xiàn)出抑菌活性，所有放線菌對供試植物病原真菌（Fusarium oxysporum）都表現(xiàn)出抑制活性。本研究通過采集短枝木麻黃根際土壤，分離鑒定根際土壤中的放線菌，并測定短枝木麻黃根際放線菌次生代謝產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性，從中篩選出抗勞爾氏菌的活性菌株，進(jìn)一步采用HPLC分析活性菌株次生代謝產(chǎn)物的情況，以期為木麻黃青枯病的生物防治以及放線菌資源的綜合開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1短枝木麻黃根際土壤的采集

短枝木麻黃根際土壤于2018年6月采自雷州半島的廣東省湛江市雷州市，選取8個(gè)不同地點(diǎn)采集樣品，分別為A（20°58′43”N；110°7′52”E）、B（20°48'60″N; 110°20′2″E）、C（20°49′3″N;110°20'49″E）、D（20049′4″N; 110°20′49″E）、E（20°47′32″N; 110023′10″E）、F（20°47′32″N;110°23′10″E）、G（20°47′37″N; 110°23′8″E）和H（20°47′35″N；110°23′8″E）。采集時(shí)選取健康的短枝木麻黃植株，在主干1.5 m范圍內(nèi)從4個(gè)不同的方向挖取距離地面15～30 cm的根系，將根系挖出后采用抖根法收集根系掉落的土壤，將4個(gè)不同方向采集的土壤合并在一起用自封袋密封后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2根際放線菌的分離和純化

采用熱擊稀釋法分離短枝木麻黃根際土壤中的放線菌。首先將采集的土壤充分混勻，去除雜質(zhì)后取1g土壤置于100 mL的旋蒸瓶內(nèi)，加入10 mL無菌水，在50℃無壓條件下采用OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（東京理化器械株式會(huì)社）旋轉(zhuǎn)15min，使其充分混勻；而后取1 mL混勻后的土壤懸濁液于15 mL離心管內(nèi)，并向其加入9mL無菌水，充分混勻后采用同樣的方法依次稀釋成濃度為10^-1、10^-2和10^-3的土壤溶液，備用。分別吸取100 pL各濃度的土壤溶液，置于改良的M1固體培養(yǎng)基（未添加人工海鹽）平板上，用無菌的涂布棒涂布均勻，每個(gè)濃度重復(fù)3次；然后將培養(yǎng)基平板放在28℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，根據(jù)菌落生長情況以及菌落特征挑選肉眼可辨別的放線菌，接種于M1培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。將純化后的放線菌菌株接種于M1培養(yǎng)基上，28℃恒溫暗培養(yǎng)3～7 d，觀察記錄菌落形態(tài)和顏色，合并相同的菌株并拍照。將純化后的菌株接種在2.5 mL凍存管里（含0.5 mL無菌的甘油和0.5 mL M1液體培養(yǎng)基），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3根際放線菌菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將純化后的放線菌接種于ISP-2液體培養(yǎng)基中，28℃150 rpm的條件下震蕩培養(yǎng)1 d，吸取適量的放線菌菌絲，DNA提取方法按照Ezup柱式細(xì)菌基因DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取步驟進(jìn)行；采用原核生物通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R （5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為30μL：12μL ddH₂O，上下游引物各0.5μL，15μL2×Taq PCR MasterMix，2 pL模板DNA。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min，4℃保溫。所得序列均使用DNAMAN軟件進(jìn)行互補(bǔ)拼接，通過在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列，使用MAFTT version 7進(jìn)行序列處理后，采用鄰接法（Neighbor-joining），用MEGA 7.0.26軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中，Bootstrap method中重復(fù)抽樣次數(shù)設(shè)置1000，模式為Maximum Composite Likelihood。將最終的鑒定結(jié)果和所得的序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），并獲得其登錄號(hào)。

1.4根際放線菌次生代謝產(chǎn)物的制備

采用無菌打孔器從培養(yǎng)好的放線菌M1培養(yǎng)基平板上打取4塊菌餅，接種到裝有250 mL M1液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃150 rpm條件下培養(yǎng)14 d。發(fā)酵完成后采用4層紗布將菌絲殘?jiān)桶l(fā)酵液分開，然后往發(fā)酵液中加入等體積的乙酸乙酯，室溫下連續(xù)萃取3次，合并萃取液經(jīng)減壓濃縮后即得放線菌乙酸乙酯層次生代謝產(chǎn)物，4℃條件下保存，備用。

1.5根際放線菌次生代謝產(chǎn)物抗細(xì)菌活性的測定

供試細(xì)菌分別為木麻黃青枯病菌（Ralstoniasolanacearum，G^-）、大腸桿菌（Escherichia coll， G^-）、枯草芽孢桿菌（Baacillus subtilis，G+）和溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus，G+）。采用TLC-MTT-生物自顯影法測定短枝木麻黃根際放線菌次生代謝產(chǎn)物對不同供試細(xì)菌的抑制活性。先將各根際放線菌次生代謝產(chǎn)物溶解，用直徑0.5 mm的毛細(xì)管在薄層層析板上點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為5μL。采用二氯甲烷：甲醇=20：1的展開系統(tǒng)進(jìn)行薄層層析，在ZF-2型三用紫外儀下觀察化合物的薄層層析情況。薄層層析后在薄層板的一側(cè)點(diǎn)樣原點(diǎn)處點(diǎn)5μL 0.2mg·mL^-1硫酸鏈霉素作為陽性對照。向滅菌的LB半固體培養(yǎng)基（瓊脂質(zhì)量濃度為5 g·L^-1）中加入一定量的供試細(xì)菌菌液（45 mL LB+5 mL菌液），調(diào)至約10⁸CFU·mL^-1。用移液槍將制備好的菌懸液均勻噴灑到層析后的薄層板上，待培養(yǎng)基冷卻后，將薄層板置于28℃下黑暗保濕培養(yǎng)，12 h后在薄層板上均勻噴灑噻唑藍(lán)（MTT），約10 min后觀察試驗(yàn)結(jié)果。有抗菌活性成分處，供試細(xì)菌由于受到活性成分的抑制而出現(xiàn)白色抑菌斑；無抗菌活性成分處，供試細(xì)菌正常生長，與MTT反應(yīng)顯藍(lán)色。根據(jù)抑菌斑直徑的大小和多少來初步評(píng)價(jià)活性化合物的抑菌活性和數(shù)量，通過抑菌斑的遷移率（Rf）來初步判斷樣品中抗菌化合物的極性。

1.6根際放線菌次生代謝產(chǎn)物高效液相色譜分析

為進(jìn)一步闡明不同放線菌次生代謝產(chǎn)物的情況，采用高效液相色譜LC-16（島津儀器（蘇州）有限公司）對不同放線菌乙酸乙酯層提取物進(jìn)行分析。分別稱取20 mg濃縮后的提取物，加入1 mL色譜甲醇，超聲溶解，再用0.22μm的有機(jī)濾膜過濾，配置成濃度為20 mg·mL^-1的溶液，備用。流動(dòng)相為乙腈和水，流速為1mL.min^-1，WondaSilC₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm，島津儀器（蘇州）有限公司），柱溫為40℃，進(jìn)樣量為5μL。色譜分析條件為：0～2 min，10%的乙腈等度洗脫；1～30 min，乙腈濃度由10%線性遞增到100%；30～36 min，100%的乙腈等度洗脫；36～37 min，乙腈濃度由100%線性遞減到10%；37～45 min，使用10%的乙腈對色譜柱進(jìn)行再平衡；采用SPD-M20A二極管陣列檢測器（島津儀器（蘇州）有限公司）進(jìn)行全波長掃描檢測。

2結(jié)果與分析

2.1短枝木麻黃根際放線菌的分離和純化

通過菌落形態(tài)觀察，對從短枝木麻黃根際土壤中分離到的放線菌進(jìn)行初步合并，最終從木麻黃根際土壤中共分離得到12株不同的放線菌，其菌落形態(tài)見圖1。從圖1中可看出：在相同的生長時(shí)間內(nèi)，大多數(shù)放線菌單菌落為白色、圓形，但菌落的大小有所差別，菌株Ceaf-6的單菌落最大，生長速度較快；菌株Ceaf-9、Ceaf-19和Ceaf-23的單菌落相對較小，且菌株Ceaf-23后期培養(yǎng)基顏色會(huì)變深。

2.2短枝木麻黃根際放線菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

基于短枝木麻黃根際放線菌16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）表明：菌株Ceaf-9、Ceaf-19、Ceaf-20、Ceaf-21、Ceaf-22和Ceaf-23與菌株S.luteogriseus聚在同一大支上，親緣關(guān)系較近，但自展值只有89，且遺傳距離也不相同，進(jìn)一步通過序列比對發(fā)現(xiàn)并不是同一菌株，因此，以上菌株未鑒定到種。菌株Ceaf-15與S.hawaliensis（登錄號(hào)為M2389914.1）聚在同一支上，且自展值為98，最大相似度為99.65%，因此，菌株Ceaf-15最終鑒定為S.hawaiiensis（登錄號(hào)為MK764957）。按照同樣的分類依據(jù)，綜合菌落形態(tài)以及構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，短枝木麻黃根際放線菌的最終鑒定結(jié)果見表1。BLAST結(jié)果顯示：所有菌株與最大相似菌株的相似性均在97%以上。分離到的12株短枝木麻黃根際放線菌均為鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）放線菌，說明鏈霉菌屬放線菌為短枝木麻黃根際土壤中的優(yōu)勢菌群。

2.3根際放線菌次生代謝產(chǎn)物的抗細(xì)菌活性

短枝木麻黃根際放線菌次生代謝產(chǎn)物對4種供試細(xì)菌的抑制活性見表2。4種供試細(xì)菌中，木麻黃青枯病菌和大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌為革蘭氏陽性菌。由表2可知：不同放線菌次生代謝產(chǎn)物對4種供試細(xì)菌的抑制活性差異較大，但對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑制活性未表現(xiàn)出明顯差異。菌株Ceaf-9和Ceaf-23提取物均未表現(xiàn)出任何抑菌活性，其他提取物均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，但對不同供試細(xì)菌的抑菌活性差異較大；菌株S.spinosus Ceaf-4提取物對木麻黃青枯病菌、大腸桿菌及溶血葡萄球菌的抑菌斑直徑均大于10 mm，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性；菌株S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌的抑菌斑直徑也大于10 mm，但菌株Ceaf-4抑菌斑的Rf值為0.30～0.57，而菌株Ceaf-12抑菌斑的Rf值為0.45～0.58，說明菌株Ceaf-4對青枯病菌的抑制活性更強(qiáng)；R_f越小，化合物的極性越大，多數(shù)放線菌抑菌斑的Rf值為0.30～0.50，說明具有活性的化合物多為極性中等偏大的化合物。綜上所述，菌株S.spinosusCeaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。

2.4根際放線菌次生代謝產(chǎn)物分析

12株短枝木麻黃根際放線菌乙酸乙酯層次生代謝產(chǎn)物的HPLC-UV色譜圖見圖3。從圖3可看出：12株放線菌均含有一定數(shù)量的次生代謝產(chǎn)物，但不同化合物的相對含量（峰高）差別較大。抗細(xì)菌活性結(jié)果（表2）表明，菌株S.spinosusCeaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，但圖3表明這2株放線菌的次生代謝產(chǎn)物具有明顯的區(qū)別，S.spinosus Ceaf-4中的各個(gè)次生代謝產(chǎn)物相對含量差別不大，保留時(shí)間（R_t）集中在10～15 min，通過紫外吸收分析發(fā)現(xiàn)為結(jié)構(gòu)類似的化合物；而S.chattanoogensis Ceaf-12在R_t=20 min左右有一個(gè)明顯的吸收峰，說明此化合物的含量較高。此外菌株Ceaf-1、Ceaf-6和Ceaf-20也含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，但抗菌活性一般。綜合考慮抗菌活性和次生代謝產(chǎn)物的情況，菌株S.spinosusCeaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12可作為候選菌株進(jìn)一步分離其中的活性成分。

3討論

木麻黃是我國南方尤其是華南地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)林和生態(tài)林樹種，而青枯病作為木麻黃的“癌癥”，嚴(yán)重影響其種植和生長，影響我國的生態(tài)安全以及沿海防護(hù)林的建設(shè)。根際微生物作為植物的第二套基因組，在植物保護(hù)中起著重要作用。近年來，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的不斷成熟，木麻黃根際微生物的研究也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。木麻黃根際土壤中特征微生物的含量差異明顯，細(xì)菌分布量最大，其次是真菌和放線菌。隨著栽植代數(shù)的增加，細(xì)菌含量減少，而真菌含量增加。同時(shí)，木麻黃根系分泌物，酚酸對根際土壤微生物群落具有特異選擇性，引起根際微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致連栽障礙問題。本研究采用熱擊稀釋法從短枝木麻黃根際土壤中共分離出12株放線菌，均為鏈霉菌屬放線菌，說明鏈霉菌屬放線菌為短枝木麻黃根際土壤的優(yōu)勢菌株，這與Abhijit等的研究結(jié)果一致。根際微生物的組成受到植物種類、土壤類型、季節(jié)變化、環(huán)境條件和栽培管理制度等各種因素的影響。木麻黃作為我國華南和東南沿海地區(qū)重要的生態(tài)防護(hù)林和用材林樹種，其生長環(huán)境土壤貧瘠、含鹽量高、有機(jī)質(zhì)含量少，且植被資源匱乏，物種單一，是造成放線菌種類相對單一的重要原因。此外，并不是所有根際放線菌都能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此，分離到的這12株放線菌只是短枝木麻黃根際放線菌的一部分。前期的研究表明，從海芒果（Cerbera manghas L.）、紅豆杉（Taxus wallichiana var.chinensis （Pilg.） Florin）等植物根際土壤中分離出的鏈霉菌屬放線菌比例均比較高。

目前，放線菌已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物和醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域。放線菌是產(chǎn)生抗生素最多的一類生物群體，而鏈霉菌屬又是產(chǎn)生抗生素最多的一類放線菌。根際放線菌種類豐富，代謝途徑各異，可產(chǎn)生一系列的次生代謝產(chǎn)物從而抑制病原菌在植物根際的生長和繁殖。近年來，木麻黃青枯病的大面積發(fā)生嚴(yán)重影響我國沿海的生態(tài)安全，從木麻黃根際土壤中尋找新的活性菌株以及次生代謝產(chǎn)物，為病害的生物防治提供了一個(gè)新的思路。本研究的抗菌活性結(jié)果表明，菌株S.spinosus Ceaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌均表現(xiàn)出較好的抑制活性，其抑菌斑直徑均大于10mm。HPLC結(jié)果表明，菌株S.spinosus Ceaf-4的提取物中含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，菌株S.chattanoogensis Ceaf-12在R_t=20 min左右時(shí)存在一個(gè)紫外吸收較高的化合物，2株放線菌中的抗菌活性成分是否與這些化合物有關(guān)值得進(jìn)一步研究。本研究只采用了M1培養(yǎng)基對不同放線菌進(jìn)行發(fā)酵，在后續(xù)研究中可改變培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，有效激活沉默基因的表達(dá)，可誘發(fā)菌株產(chǎn)生新的活性化合物，同時(shí)利用LC-MS/MS構(gòu)建不同菌株次生代謝產(chǎn)物的可視化分子網(wǎng)絡(luò)，快速探尋新型的化合物及其同系物。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于根際微生物的研究中，探究開發(fā)根部有益微生物為病蟲害的防治提供了廣闊的前景。在后續(xù)的研究中可結(jié)合高通量測序技術(shù)研究木麻黃根際放線菌的生物多樣性，同時(shí)嘗試采用不同的培養(yǎng)基，分離得到盡可能多的放線菌菌株，并比較不同培養(yǎng)基中放線菌的分布和生長情況。

4結(jié)論

通過對華南沿海短枝木麻黃根際土壤樣品中放線菌的分離培養(yǎng)，共分離得到12株不同的鏈霉菌屬放線菌，鏈霉菌屬放線菌為短枝木麻黃根際土壤中的優(yōu)勢放線菌。進(jìn)一步對篩選出的菌株進(jìn)行發(fā)酵及抗菌活性研究，篩選出一些抗菌活性較好的菌株，其中，菌株S.spinosus Ceaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12對木麻黃青枯病菌表現(xiàn)出較好的抑制活性。HPLC分析發(fā)現(xiàn)，菌株S.spinosus Ceaf-4和S.chattanoogensis Ceaf-12的次生代謝產(chǎn)物類型豐富，值得進(jìn)一步對其化合物進(jìn)行分離制備，可作為候選抗菌活性菌株進(jìn)一步開發(fā)和利用。