劉瑩　耿顯勝　俞文仙等

關(guān)鍵詞：山茶；種質(zhì)資源；花腐??；抗性評價

中圖分類號：S763.15 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1001-1498（2023）04-0157-08

山茶是山茶科（ Theaceae）山茶屬（Camellia）的常綠小喬木或灌木，被尊為中國十大傳統(tǒng)名花之一，栽培歷史1800多年，是世界著名的觀賞花卉，具有極高的觀賞價值，在城市綠化、庭院栽培、盆花生產(chǎn)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。山茶屬植物絕大多數(shù)原產(chǎn)于中國，在日本、越南等地也有少數(shù)物種分布，在北美、歐洲、大洋洲（澳大利亞、新西蘭）等地區(qū)廣泛引種栽培。

山茶花腐病是由山茶葉杯菌（Ciborinia camelliae）引起的真菌性病害，該病嚴(yán)重影響山茶花的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值。山茶葉杯菌主要危害花朵，危害癥狀初期為褐色的斑點(diǎn)，后期蔓延至整朵花，致使受害花朵枯萎脫落。脫落后的花朵仍保持其形狀和硬度，后期在花瓣基部產(chǎn)生菌核，菌核在夏、秋季處于休眠狀態(tài)。翌年春天，隨著氣溫升高，菌核萌發(fā)，形成子囊盤和子囊孢子等有性世代的結(jié)構(gòu)，子囊孢子成熟后從子囊盤內(nèi)散發(fā)出來，借助風(fēng)力傳播到健康的花朵上，進(jìn)行新一輪侵染。山茶花腐病最早于1919年在日本被發(fā)現(xiàn)，后來美國、新西蘭和歐洲部分地區(qū)也陸續(xù)報道了該病害。鑒于其危害的嚴(yán)重性，以及其擴(kuò)散和蔓延的普遍性，山茶葉杯菌在2003年被歐洲和地中海植物保護(hù)組織（European and Mediterranean Plant Protection Organization， EPPO）列入A2類檢疫性有害生物，2013年被列入我國進(jìn)境植物檢疫有害生物名錄。我國雖然僅有該病害零星發(fā)生的報道，但實(shí)際上該病已在山茶花重要產(chǎn)區(qū)擴(kuò)散和蔓延，需引起高度重視。

新西蘭的研究人員在1999—2014年采用孢子接種法對部分山茶種質(zhì)資源進(jìn)行了花腐病的抗性評價，但評價的種質(zhì)資源多為國外品種且數(shù)量有限，我國絕大多數(shù)種質(zhì)資源的抗性水平尚不明確。本研究擬確定接菌后適宜的抗性評價時間點(diǎn)，制定山茶花腐病病情嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)和抗性評判標(biāo)準(zhǔn)，建立山茶種質(zhì)資源花腐病抗性評價技術(shù)，篩選出高抗花腐病的山茶種質(zhì)資源，研究結(jié)果為制定高效、安全的山茶花腐病的防控措施提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

委托中國工業(yè)微生物菌種保藏中心從荷蘭烏特勒支的微生物菌種保藏中心（Centraalbureauvoor Schimmelcultures，CBS）訂購花腐病的病原菌山茶葉杯菌（C.came Hiae，編號CBS 101527）。

本研究評價的56份山茶種質(zhì)資源來源于中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所國家山茶種質(zhì)資源庫（RISF）、金華市國際山茶物種園國家山茶種質(zhì)資源庫（JHICS）、浙江金華茶花苗圃（JHCNS）和肇慶棕櫚谷花園有限公司生產(chǎn)基地（PETC）。

1.2山茶花腐病抗性評價適宜時間點(diǎn)的確定

將山茶葉杯菌轉(zhuǎn)接到PDA平板上，20℃下培養(yǎng)15 d，用無菌打孔器從菌落的邊緣打取直徑為5mm的菌絲塊，作為接種體。取無病蟲害、無損傷、剛開放的攸縣油茶（Camellia yuhsienensis Hance）、單體紅山茶（C.uraku Kitamura）和皺果茶（C.rhytidocarpa Chang et S.Y. Liang）的離體花瓣作為試驗(yàn)材料，每種山茶取30片花瓣，設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)10片花瓣。用無菌昆蟲針在花瓣的中央刺6個針孔，在針孔處接上接種體，接菌后的花瓣擺放在鋪有無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。人工氣候箱培養(yǎng)條件設(shè)置為：溫度20℃，濕度80%，光照強(qiáng)度4000 Lx，光周期12 L：12 D。試驗(yàn)以接種無菌水的離體花瓣為對照處理組。

接菌后0、24、48、72和96 h，分別觀察接菌組和對照組花瓣的發(fā)病情況，使用單反相機(jī)（SELP1650 SONY CORP）拍照。使用ImageJ軟件測量病斑面積和花瓣的總面積，計(jì)算病斑的相對面積，依據(jù)病斑相對面積確定抗性評價適宜的時間點(diǎn)。

1.3山茶花腐病病情嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)和抗性評判標(biāo)準(zhǔn)的制定

采集無病蟲害、無損傷、剛開放的山茶花朵，采用1.2中的方法準(zhǔn)備花瓣樣品并接種山茶葉杯菌菌絲塊，接菌后72 h，使用單反相機(jī)拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。采用Image J軟件測量病斑面積和花瓣面積，計(jì)算病斑相對面積。

采用SPSS 23.0對所有測定樣品的病斑相對面積值做頻次分布統(tǒng)計(jì)。參考謝藝賢等病害抗性評價的分級標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)本研究中不同山茶種質(zhì)資源病斑相對面積的頻次分布數(shù)據(jù)，制定山茶花腐病病情嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

接菌后72 h的山茶花瓣，采用病情嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)確定其發(fā)病級別，計(jì)算山茶種質(zhì)資源的病情指數(shù)（Disease index，DI）。依據(jù)病情指數(shù)的大小制定山茶種質(zhì)資源花腐病抗性評判標(biāo)準(zhǔn)（表2）。

1.4山茶種質(zhì)資源資源花腐病抗性的評價

從1.1中描述的4個地點(diǎn)采集無病蟲害、無損傷、剛開放的山茶種質(zhì)資源的花朵，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，用于種質(zhì)資源的抗性評價。采用1.2中描述的方法準(zhǔn)備花瓣樣品并接種山茶葉杯菌的菌絲塊，人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，拍照記錄每片花瓣的發(fā)病情況。測量并計(jì)算病斑的相對面積，采用制定的病情嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)確定每片花瓣的發(fā)病級別，計(jì)算每份種質(zhì)資源的病情指數(shù)，依據(jù)制定的抗性評判標(biāo)準(zhǔn)評判每份種質(zhì)資源的抗性水平。病情指數(shù)

DI的計(jì)算公式如下：

式中，DI為病情指數(shù)；R_i為病害級別；T_j為病害級別的花瓣數(shù)；9為最高病害級別；～為某份種質(zhì)資源調(diào)查的花瓣總數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1山茶花腐病抗性評價適宜時間點(diǎn)的確定

從接種后花瓣病害癥狀來看，不同山茶種質(zhì)資源對花腐病的抗性存在明顯的差異。攸縣油茶接種后0～96 h均未出現(xiàn)病斑，單體紅山茶和皺果茶在接菌后0～24 h同樣未觀察到病斑，但隨著時間的增加，病斑開始擴(kuò)展（表3）。通過比較3份山茶種質(zhì)資源在接菌后相同培養(yǎng)時間的病斑相對面積，發(fā)現(xiàn)在接菌后Oh和24 h，3份種質(zhì)資源均未出現(xiàn)病斑，無法通過病斑的相對面積將它們的抗性水平區(qū)分開來；接菌后48 h，攸縣油茶和皺果茶的病斑相對面積均為0.00%，也無法通過病斑相對面積將這兩者的抗性水平區(qū)分開來；接菌后72 h和96 h，均是單體紅山茶病斑相對面積明顯大于皺果茶病斑相對面積，皺果茶病斑相對面積明顯大于攸縣油茶的病斑相對面積，即這2個時間點(diǎn)都能夠通過病斑的相對面積將3份山茶種質(zhì)資源的抗性水平區(qū)分開來。但是，接菌后72 h單體紅山茶病斑相對面積是相同時間點(diǎn)皺果茶病斑相對面積的30.23倍，明顯高于接菌后96 h單體紅山茶和皺果茶病斑相對面積的比值，即在該時間點(diǎn)3份山茶種質(zhì)資源的抗性水平區(qū)分最好。基于以上結(jié)果，本研究確定接菌后72 h為抗性評價的適宜時間點(diǎn)。

2.2不同山茶種質(zhì)資源花腐病抗性的評價

山茶種質(zhì)資源的病情指數(shù)和抗病水平分析發(fā)現(xiàn)，不同山茶種質(zhì)資源花腐病的抗性存在明顯差異，攸縣油茶的病情指數(shù)最小，為0.00，其對花腐病抗性水平為免疫，單體紅山茶的病情指數(shù)最大，高達(dá)55.93，其對花腐病抗性水平為高感（表4）。本研究評價的56份山茶種質(zhì)資源中，免疫和高抗種質(zhì)資源共8份，占參試種質(zhì)資源的比例為14.29%，包括攸縣油茶、大花紅山茶（C.magnif/ora Chang）、‘彩丹、杜鵑紅山茶、‘葡萄酒、皺果茶、‘迷茫的春天和‘夏夢文清；中抗種質(zhì)資源24份，占參試種質(zhì)資源的比例為42.86%，包括‘愛麗牡丹王‘山崎大錦‘夏日七心、崇左金花茶（C.chuangtsoensis S.Y.Liang et L.D.Huang）、長尾紅山茶（C.longicaudata Chang et S.Y. Liang）、‘春江虹蕊、浙江紅山茶（C.chekiangoleosa Hu）、‘花牡丹‘菊冬至等；中感種質(zhì)資源14份，占參試種質(zhì)資源的比例為25.00%，包括‘夏夢華林‘園林之嬌、越南油茶（C.vietnamensis T.C.Huang ex Hu）、‘夏日衍平‘富士之峰‘春節(jié)、博白大果茶（C.gigantocarpaHu et Huang）等；高感種質(zhì)資源10份，占參試種質(zhì)資源的比例為17.86%，包括‘伊豆立寒、中東金花茶（C.achrysantha Chang et S.Y.Liang）、‘小玫瑰、單體紅山茶、紅皮糙果茶（C.crapnellianaTutch）、金花茶（C.nitidissima Chi）等表4）。

本研究評價了山茶屬短柱茶組（Sect.Paracamellia）、瘤果茶組（Sect.Tuberculata）、紅山茶組（Sect.Camellia）、油茶組（Sect.Oleifera）、古茶組（Sect.Archecamellia）、金花茶組（Sect. Chrysantha）和糙果茶組（Sect. Furfuracea）共7組的種質(zhì)資源，這7個組的平均病情指數(shù)依次為0.00、1.85、13.25、16.57、25.56、29.63和35.19。短柱茶組和瘤果茶組的抗性最強(qiáng)，表現(xiàn)為免疫和高抗；紅山茶組的抗性較強(qiáng)，表現(xiàn)為中抗；油茶組抗性水平較弱，表現(xiàn)為中度感病；古茶組、金花茶組和糙果茶組的抗性最弱，都表現(xiàn)為高感花腐病。

同一組內(nèi)不同種間的抗性水平也存在差異。紅山茶組雖然總體抗性水平為中抗，但是在該組中既有高抗的大花紅山茶、‘彩丹‘杜鵑紅山茶、‘迷茫的春天和‘夏夢文清，也有中抗的‘夏日七心‘丹心、浙江紅山茶等種質(zhì)資源，還有高感花腐病的‘夏夢岳婷‘喬伊和單體紅山茶；油茶組總體抗性水平為中感，但油茶組中也有高抗品種‘葡萄酒，并且還有中抗的‘山崎大錦‘梅之風(fēng)‘白九重‘厚禮‘千代鶴‘榮光等種質(zhì)資源；金花茶組總體抗性水平為高感，但該組內(nèi)也有中抗種質(zhì)資源崇左金花茶（表4）。

在同一親本的不同雜交組合中，雜交品種的抗性也表現(xiàn)不同。以杜鵑紅山茶為親本的雜交品種中，‘夏夢文清（杜鵑紅山茶ב帕克斯先生）、‘夏日七心（杜鵑紅山茶ב帕克斯先生）、‘夏夢華林（紅山茶品種‘都鳥×杜鵑紅山茶）、‘園林之嬌（杜鵑紅山茶×紅山茶品種‘達(dá)婷）、‘夏日衍平（‘媚麗×杜鵑紅山茶）和‘夏夢岳婷（‘客來邸×杜鵑紅山茶）的病情指數(shù)分別為4.81、5.56、15.93、18.89、19.26和27.41?！膲粑那灞憩F(xiàn)為高抗花腐病，‘夏日七心表現(xiàn)為中抗花腐病，‘夏夢華林‘園林之嬌和‘夏日衍平表現(xiàn)為中感花腐病，‘夏夢岳婷表現(xiàn)為高感花腐?。ū?）。與親本杜鵑紅山茶相比，除了‘夏夢文清外，其它5個雜交品種的抗花腐病的水平均有所降低，表明雜交品種的抗性水平發(fā)生分離，可能是雙親親本共同影響子代的抗病性。

3討論

種質(zhì)資源的抗病性是以植物物理和化學(xué)因子為基礎(chǔ)，減輕或克服病原物致害作用的一類特性。實(shí)踐表明，利用種質(zhì)資源的抗病性防控病害是高效、安全的防控措施。我國具有極為豐富的山茶種質(zhì)資源，眾多的山茶種質(zhì)資源為抗病育種提供了豐富的候選種質(zhì)資源。本研究對我國華東和華南地區(qū)收集和保存的山茶種質(zhì)資源開展花腐病的抗性評價，研究結(jié)果有助于明確山茶種質(zhì)資源花腐病的抗性水平，為利用種質(zhì)資源的抗病性防控花腐病提供基礎(chǔ)。

國外花腐病抗性評價工作起步早，Taylor于1999年首次采用氣傳子囊孢子接種法評價了78份山茶種質(zhì)資源對花腐病的抗性，初步明確了抗病和感病種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)10份中抗花腐病的種質(zhì)資源，包括攸縣油茶、尖連蕊茶（C.cuspidata Wright ex Gard），川滇連蕊茶（C.longicarpaChang），五柱滇山茶（C.yunnanensis Cohen）和‘春霧等。2004年，Taylor在1999年的抗性評價的基礎(chǔ)上，比較了不同接種方法和接種后不同時間點(diǎn)對抗性評價的影響，發(fā)現(xiàn)氣傳子囊孢子接種法優(yōu)于孢子懸浮液接種法，確定接菌后72h為適宜的抗性評價時間點(diǎn)。另外，該研究還鑒定出了13份高抗種質(zhì)資源，包括攸縣油茶及以攸縣油茶為親本的雜交種、玫瑰連蕊茶（C.rosaefloraHooker）、五柱滇山茶（C.yunnanensis Cohen）、臺灣連蕊茶（C.lutchuensis Wright ex Gard）等。2013年，Denton-Giles等采用病斑相對面積、乳突有無、胞間H₂O₂、初生菌絲的相對數(shù)量等多個指標(biāo)，綜合評價了短柱茶組、連蕊茶組（Sect. Theopsis）、紅山茶組和實(shí)果茶組（Sect.Stereocarpus）內(nèi)40份物種及1份雜交種對花腐病的抗性，發(fā)現(xiàn)短柱茶組中的攸縣油茶、連蕊茶組的臺灣連蕊茶和南投禿連蕊茶（C.transnokoensis Hayata）為高抗種質(zhì)資源，占總評價種質(zhì)資源的7.32%。以上抗性評價都是采用子囊孢子作為接種體進(jìn)行抗性鑒定，子囊孢子接種雖在一定程度上模擬自然侵染過程，但山茶葉杯菌不能夠在人工培養(yǎng)基上產(chǎn)生子囊孢子，田間收集子囊孢子難度大，且孢子質(zhì)量難以控制。本研究采用菌絲塊作為接種體進(jìn)行抗性評價，結(jié)果表明，菌絲塊能夠在較短的時間內(nèi)引起山茶花瓣發(fā)病，并且通過病斑相對面積能夠?qū)⒉煌剐运降姆N質(zhì)資源區(qū)分開來，故山茶葉杯菌的菌絲塊也能夠作為接種體用于種質(zhì)資源的抗病性評價。本研究采用3份抗性不同的種質(zhì)資源設(shè)置時間梯度，比較了接菌后不同培養(yǎng)時間對抗性評價的影響，確定接菌后72 h為適宜的評價時間點(diǎn)，該研究結(jié)果與Taylor采用子囊孢子接種時的結(jié)果一致。

本研究以病斑相對面積為測量指標(biāo)，制定了山茶花腐病病情嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)和抗性評判標(biāo)準(zhǔn)，建立了山茶花腐病抗性評價技術(shù)體系，評價了56份山茶種質(zhì)資源花腐病的抗性，明確了8份為免疫或高抗花腐病種質(zhì)資源、24份為中抗種質(zhì)資源、14份為中感種質(zhì)資源、10份為高感種質(zhì)資源。在8份免疫或高抗花腐病種質(zhì)資源中，攸縣油茶的抗性最強(qiáng)，這與Taylor和Denton-Giles等的研究結(jié)果一致。攸縣油茶原產(chǎn)于我國，具有濃烈花香味、耐瘠薄、果實(shí)出仁率高、果油率高等優(yōu)點(diǎn)，并且該物種還抗花腐病和炭疽病，因此攸縣油茶可以作為優(yōu)質(zhì)抗源用于花腐病和炭疽病的抗性育種。杜鵑紅山茶是山茶屬特有的珍稀瀕危物種，該物種的自然種群僅分布于廣東省陽春市。杜鵑紅山茶是夏季和秋季開花的物種，而夏、秋季節(jié)山茶葉杯菌處于不活躍狀態(tài)，因此杜鵑紅山茶能夠避免被山茶葉杯菌侵染，具有避病性。本研究室內(nèi)抗性評價結(jié)果表明，杜鵑紅山茶以及以杜鵑紅山茶為親本的雜交品種‘夏夢文清對花腐病的抗性水平都為高抗，因此杜鵑紅山茶也可作為優(yōu)質(zhì)抗源用于花腐病的抗性育種。

4結(jié)論

本研究比較了接種山茶葉杯菌后不同培養(yǎng)時間對抗性評價的影響，確定接種菌絲塊于山茶種質(zhì)資源的離體花瓣，并在接菌后72 h統(tǒng)計(jì)病斑的相對面積，能有效地對山茶種質(zhì)資源進(jìn)行抗病性評價。本研究制定了山茶花腐病病情嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)和抗性評判標(biāo)準(zhǔn)，建立了一套山茶花腐病抗性評價技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)對我國華東和華南地區(qū)收集和保存的56份山茶種質(zhì)資源開展花腐病的抗性評價，明確這56份山茶種質(zhì)資源花腐病的抗性水平，分析了山茶屬不同組間、同一組內(nèi)不同種間以及同一親本的不同雜交組合之間抗病性的差異性，篩選出了攸縣油茶、大花紅山茶、‘彩丹、杜鵑紅山茶、‘葡萄酒、皺果茶、‘迷茫的春天和‘夏夢文清8份免疫或高抗花腐病的山茶種質(zhì)資源。研究結(jié)果為制訂高效、安全的山茶花腐病的防控措施提供理論依據(jù)。