呂杉 楊盛 勞光杰 譚雪梅

為了探究成都東華門遺址土壤中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成，研制具有針對(duì)性的抑菌劑，本研究在東華門遺址的微生物病害發(fā)生點(diǎn)進(jìn)行采樣，用稀釋涂布平板法獲得可培養(yǎng)細(xì)菌，純培養(yǎng)后進(jìn)行形態(tài)學(xué)和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定. 結(jié)果顯示：分離到的27株細(xì)菌中，以芽孢桿菌、假單胞菌和金黃桿菌為主.根據(jù)菌株親緣關(guān)系和菌落顏色，選擇8株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、菌落顏色與病害發(fā)生點(diǎn)接近的關(guān)鍵菌株為靶標(biāo)進(jìn)行細(xì)菌防治探究. 研究表明：使用0.1%次氯酸鈉與中藥提取液（0.03 g/L大黃、0.3 g/L黃芩、0.3 g/L艾葉）復(fù)配后，具有與0.4%高濃度次氯酸鈉相當(dāng)?shù)臍⒕Ч? 表明使用中藥成分復(fù)配次氯酸鈉，在不降低抑菌效果的前提下，能顯著降低次氯酸鈉的使用濃度.

東華門遺址； 細(xì)菌； 微生物病害； 文物保護(hù)

Q938A2023.016003

收稿日期： 2022-05-25

基金項(xiàng)目： 成都市文物考古工作隊(duì)磚石類考古遺址現(xiàn)場(chǎng)保護(hù)服務(wù)項(xiàng)目（21H0698）

作者簡(jiǎn)介： 呂杉（2001-）， 女， 陜西渭南人， 本科生， 研究方向?yàn)槲奈镂⑸锊『?E-mail： 840419661@qq.com

通訊作者： 譚雪梅.E-mail： txmyyf@scu.edu.cn

Isolation， identification and control of bacteria in archeological earthen heritage site of Donghuamen in Chengdu

L Shan1， YANG Sheng2， LAO Guang-Jie1， TAN Xue-Mei1

（1. Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064， China;

2.Chengdu Institute of Cultural Relics and Archaeology， Chengdu 610075， China）

To study the structure of bacterial community in the soil of Donghuamen Site in Chengdu in order to develop a targeted bacteriostatic agent， culturable bacterial strains were isolated from soil collected from the Donghuamen Site by the plate method， followed by the analysis of morphology and 16S rDNA sequence for the bacterial identification. The results showed that 27 dominant bacterial strains were isolated and identified， among which Bacillus， Pseudomonas and Aureus were the main ones. According to the phylogenetic tree and color of the colonies， eight key strains were selected for bacteriostatic trial. Sodium hypochlorite of 0.1%， if mixed with Chinese medicine extract of 0.03 g/L rheum officinale， 0.3 g/L baical skullcap root and 0.3 g/L artemisia argyi， had a comparable bacteriostatic effect compared with 0.4% sodium hypochlorite. This indicated that the use of sodium hypochlorite compounded with traditional Chinese medicine extract may reduce the concentration applied without decreasing its bacteriostatic effect.

Earthen heritage site of Donghuamen in Chengdu; Bacteria; Microbial corrosion; Preservation of cultural relics

1 引 言

古遺址是人類社會(huì)發(fā)展的歷史見(jiàn)證，是歷史研究的重要依據(jù)，反映了人類社會(huì)在各個(gè)階段的文明特征，是人類寶貴的遺產(chǎn)［1］. 近年來(lái)，生物腐蝕對(duì)古遺址的損害也越來(lái)越受到關(guān)注［2］. 古遺址被發(fā)掘后暴露在空氣中，低代謝速率的動(dòng)態(tài)平衡被打破，大量微生物開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，造成嚴(yán)重的微生物病害，對(duì)文物產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損害［2］. 解析古遺址表面微生物組成結(jié)構(gòu)是古遺址微生物病害防治研究的基礎(chǔ)，為古遺址的保護(hù)提供了研究依據(jù)和思路.

東華門遺址位于成都市青羊區(qū)東華門街18號(hào)，是我國(guó)重要的城市遺址中心（圖1a），濃縮了成都2000多年的歷史，見(jiàn)證了民族文明的興衰更迭［3］. 成都東華門遺址包括唐代摩訶池、明代蜀王府水道和清代貢院等重要?dú)v史遺址，是成都作為歷史文化名城的重要文物支撐［4］，具有極高的科學(xué)研究?jī)r(jià)值、歷史價(jià)值和文化價(jià)值［4］.

東華門遺址從2019年開(kāi)始有微生物病害發(fā)生.通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)生物病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，遺址表面發(fā)生了嚴(yán)重的微生物病害（圖1b～1d）. 微生物個(gè)體微小、能夠迅速繁殖，其廣泛存在于文物表面，對(duì)文物造成不可逆的損壞［5］. 微生物生長(zhǎng)所分泌的酸性物質(zhì)可能造成遺址表面嚴(yán)重腐蝕［6］. 細(xì)菌在代謝中產(chǎn)生的多種酸性次級(jí)代謝產(chǎn)物，可與文物的無(wú)機(jī)組分反應(yīng)，嚴(yán)重?fù)p害其藝術(shù)價(jià)值和歷史價(jià)值［7］. 研究表明細(xì)菌分泌的粘液可以腐蝕大理石等材質(zhì)的文物［8］. 細(xì)菌產(chǎn)生的無(wú)機(jī)酸，如硝酸和亞硝酸等，會(huì)直接腐蝕文物表面［9］. 除細(xì)菌外，真菌也是一類最活躍的腐蝕石質(zhì)文物的微生物，能夠通過(guò)改變環(huán)境中的pH來(lái)適應(yīng)自身的生長(zhǎng)［10］. 真菌和細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖后可能會(huì)產(chǎn)生色素，影響古遺址本體外觀，嚴(yán)重威脅古遺址的原真性和完整性. 因此，研究成都東華門遺址的微生物病害及其防治研究具有重要的意義. 本文針對(duì)東華門微生物病害，進(jìn)行了真菌病害和細(xì)菌病害的研究.由于真菌生長(zhǎng)后給細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)成分，細(xì)菌可以在干燥等更嚴(yán)苛的石質(zhì)環(huán)境中生存，所以本文重點(diǎn)研究了腐蝕細(xì)菌及其防控.

傳統(tǒng)化學(xué)抑菌劑存在污染環(huán)境和腐蝕遺跡等問(wèn)題，而文物因?yàn)槌Ｄ曷癫?，被發(fā)掘后暴露在空氣中，容易發(fā)生開(kāi)裂、剝離，因此，選用溫和、高效的抑菌劑是文物保護(hù)的重要原則. 中草藥屬于天然藥物，具有無(wú)污染、無(wú)毒副作用和殘留毒物量少等優(yōu)點(diǎn)，從中草藥中篩選抗菌藥物越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視［11］. 次氯酸鈉是一種廣譜抑菌劑，殺菌效果優(yōu)異，然而具有強(qiáng)氧化性，應(yīng)用于文物可能會(huì)對(duì)文物結(jié)構(gòu)造成損害. 艾葉為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有除濕止癢、抗菌消炎和抗腫瘤等功效［12］. 大黃具有瀉熱毒、破積滯和行瘀血的作用，臨床上也將其應(yīng)用于治療金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的炎癥［13］. 黃芩有較廣抗菌譜，對(duì)痢疾桿菌、白喉?xiàng)U菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌以及腦膜炎球菌等均有抑制作用，煎劑作喉頭噴霧，對(duì)腦膜炎帶菌者亦有效，即使對(duì)青霉素等抗菌素已產(chǎn)生抗藥性的金黃色葡萄球菌對(duì)黃芩仍屬敏感［14］.

2 材料與方法

2.1 材 料

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），次氯酸鈉，大黃、黃芩、五倍子、艾葉、蒲公英（成都貝斯特藥房）.

2.2 方 法

2.2.1 樣本采樣 依據(jù)前期對(duì)成都東華門遺址現(xiàn)場(chǎng)生物病害調(diào)查的結(jié)果，選取6個(gè)典型的微生物病害發(fā)生點(diǎn)，用無(wú)菌勺刮取樣本于50 mL無(wú)菌離心管中，置于低溫泡沫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室.

2.2.2 細(xì)菌的分離、純化及鑒定 取約2 g樣本于15 mL無(wú)菌水中，在200 r/min，37 ℃下培養(yǎng)20 min使其混合均勻，將混合液濃度梯度稀釋至10-3后涂布于LB固體培養(yǎng)基，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；挑取不同形態(tài)特征的單菌落于LB固體培養(yǎng)基上繼續(xù)純化. 重復(fù)上述操作3～4次直至所有菌落形態(tài)一致，完成純化.

挑取純化后單菌落于4 mL LB液體培養(yǎng)基中，于200 r/min，37 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜，按照1∶1的比例將菌種和50%的甘油混合保存，一份置于-20 ℃冰箱保存，一份置于-80 ℃冰箱保存［15］.

2.2.3 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定 觀察并記錄純化完成的菌株的形態(tài)特征，挑取純化后細(xì)菌于4 mL LB液體培養(yǎng)基中，于200 r/min，37 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜. 利用試劑盒提取細(xì)菌DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA，正向引物為27F（5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物為1492R（5′-TACGGCTACCTTCTTACGACCTT -3′）［16］. PCR擴(kuò)增體系為50 μL：將25 μL的2×Taq PCR PreMix、2 μL的27F、2 μL的1492R，1 μL的細(xì)菌DNA，20 μL的ddH2O混合反應(yīng). 反應(yīng)結(jié)束后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其產(chǎn)物，將條帶清晰且明亮的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司測(cè)序［17］.

2.2.4 細(xì)菌的產(chǎn)酸情況測(cè)定 為了篩選出關(guān)鍵腐蝕菌株，本研究對(duì)分離到的細(xì)菌通過(guò)甲基紅試驗(yàn)（M.R試驗(yàn)），伏普試驗(yàn)（V.P試驗(yàn)）［18］，進(jìn)行初篩.

2.2.5 抑菌實(shí)驗(yàn) 根據(jù)菌株的顏色和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，分析成都東華門遺址腐蝕微生物的關(guān)鍵菌株. 參考文獻(xiàn)資料，選擇對(duì)文物損傷較小的抑菌劑，初步選定化學(xué)成分的抑菌劑：低濃度次氯酸鈉；中藥：大黃、黃芩、五倍子、艾葉、蒲公英作為待選抑菌劑.

化學(xué)抑菌劑：配制濃度為4%的次氯酸鈉溶液. 中藥抑菌劑：使用水煎法［13］制備水提物，所配置的溶液近似認(rèn)為1 g/mL［13］，將配制的溶液高溫高壓滅菌.

采用十倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），以LB液體培養(yǎng)基為稀釋液，取培養(yǎng)基900 μL，在第1管中加入抑菌劑母液100 μL，使用渦旋震蕩儀混勻［13］，吸取該管混合液100 μL加至第2管，依次至第5管.取10 μL抑菌劑和90 μL 8log10 CFU/mL菌液混合均勻［13］. 于37 ℃下培養(yǎng)18～24 h 后，觀察并記錄細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，以渾濁度為指標(biāo)檢查試管中有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以不顯示渾濁，細(xì)菌未生長(zhǎng)的試管對(duì)應(yīng)的藥液稀釋度即為最小抑菌濃度（MIC）.

將直徑為6 mm的定性濾紙片于梯度稀釋后的抑菌劑中浸泡1 h后烘干，取 8log10 CFU/mL的對(duì)數(shù)期菌懸液100 μL于LB固體培養(yǎng)基涂布. 在平板上放置不同濃度的載藥濾紙片，做好標(biāo)記，培養(yǎng)過(guò)夜后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑.

3 結(jié)果和分析

3.1 細(xì)菌的分離和純化

本研究共分離到27株細(xì)菌，除菌株B-2以外，其他26株的菌落均為不透明狀態(tài)（表1），呈現(xiàn)多種顏色，以橘黃色和淡黃色為主，其次為淡橘黃色和白色（圖2）.

3.2 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)分離純化的 27株細(xì)菌的16S rDNA 序列進(jìn)行BLAST對(duì)比，結(jié)果表明：成都東華門遺址典型微生物以芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和金黃桿菌屬（Chryseobacterium）為主（表2）.其中芽孢桿菌屬菌株14株，占總分離菌株的51.85%；假單胞屬菌株5株，占18.52%；金黃桿菌屬菌株3株，占11.11%. 本研究還分離到鏈霉菌屬（Streptomyces）2株，橄欖形菌屬（Olivibacter）2株，擬桿菌屬（Fictibacillus）1株. 鑒定出所有菌株與已知菌株的同源性均在 98％以上.

根據(jù)16s rDNA測(cè)序結(jié)果，使用MEGA軟件，選定標(biāo)準(zhǔn)菌株12株，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）. 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，從不同微生物病害發(fā)生點(diǎn)采樣分離的很多菌株的親緣關(guān)系較近，部分菌株的親緣達(dá)到100%，說(shuō)明在露天環(huán)境下，部分種屬的細(xì)菌在東華門遺址微生物病害中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位.

3.3 細(xì)菌的產(chǎn)酸測(cè)定

對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行M.R，V.P試驗(yàn)，測(cè)定其產(chǎn)酸情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，假單胞菌屬菌株Y-4、BW-3，芽孢桿菌屬菌株BW-6、G-3、YG-4、YG-6、B-3和B-1，鏈霉菌屬菌株G-2，橄欖形菌屬菌株YG-1、YG-2，能夠水解葡萄糖產(chǎn)酸，因此可能對(duì)東華門古遺址文物產(chǎn)生微生物腐蝕.

3.4 關(guān)鍵腐蝕菌株的確定

本研究根據(jù)種屬關(guān)系，篩除親緣關(guān)系相似的菌株，根據(jù)細(xì)菌的產(chǎn)酸情況，篩選能夠產(chǎn)酸的菌株，并結(jié)合細(xì)菌菌落產(chǎn)生的顏色，選擇產(chǎn)酸能力較強(qiáng)、對(duì)文物外觀顏色影響較大的差異較大的菌株為關(guān)鍵菌，包括假單胞菌屬菌株B-2，芽孢桿菌屬菌株BW-6、BW-4、Y-6和BW-5，鏈霉菌屬菌株G-2，金黃桿菌屬菌株YG-8，橄欖形菌屬菌株YG-2，進(jìn)行后續(xù)的抑菌試驗(yàn).

3.5 抑菌劑的最小抑菌濃度

以3.4中確定的關(guān)鍵菌株為靶標(biāo)菌株，測(cè)定2種無(wú)機(jī)廣譜殺菌劑與5種中藥提取物的MIC（表4）. 結(jié)果表明：無(wú)機(jī)殺菌劑中次氯酸鈉殺菌效果顯著且穩(wěn)定，在0.04%～0.4%濃度范圍內(nèi)對(duì)關(guān)鍵腐蝕細(xì)菌生長(zhǎng)有顯著抑制效果，作用最強(qiáng)；5種中藥提取物的殺菌效果各不相同，其中大黃的殺菌效果最顯著，黃芩與艾葉也有比較明顯的殺菌效果.

3.6 復(fù)配抑菌劑的抑菌圈測(cè)定

由于強(qiáng)氧化性的次氯酸鈉等化學(xué)抑菌劑對(duì)文物可能有一定的損傷，為了降低化學(xué)抑菌劑的使用量，本研究選擇以0.4%的次氯酸鈉為主，復(fù)配以殺菌效果相對(duì)優(yōu)良，同時(shí)作用溫和的中藥成分大黃、黃芩、艾葉，進(jìn)行殺菌效果探究. 將0.01 g/mL的大黃、1 g/L黃芩和0.4%次氯酸鈉等比例混合，制備終濃度約為0.03 g/L大黃、0.3 g/L黃芩和0.1%次氯酸鈉的復(fù)配抑菌劑A；將1 g/L艾葉、1 g/L黃芩、0.4%次氯酸鈉等比例混合，制備終濃度約為0.3 g/L艾葉、0.3 g/L黃芩、0.1%次氯酸鈉的復(fù)配抑菌劑B.

使用抑菌圈法測(cè)定復(fù)配抑菌劑A和B的殺菌效果（表5），結(jié)果表明：復(fù)配抑菌劑A和B對(duì)關(guān)鍵細(xì)菌殺菌效果顯著. 因此，化學(xué)抑菌劑次氯酸鈉稀釋3倍后與其他中藥抑菌成分復(fù)配，復(fù)配抑菌劑與稀釋前次氯酸鈉的殺菌效果相比較無(wú)明顯降低，說(shuō)明與溫和的中藥成分復(fù)配，能夠大幅降低化學(xué)抑菌劑的使用濃度，也能達(dá)到基本相當(dāng)?shù)臍⒕Ч?

4 討 論

中國(guó)具有5000多年璀璨的文明，除成都東華門遺址外，還有很多的文化遺址遭受嚴(yán)重的微生物病害，現(xiàn)有的保護(hù)措施仍然難以解決微生物造成的損害. 對(duì)于石質(zhì)文物遺址，腐蝕微生物會(huì)導(dǎo)致文物疏松、多孔、斷裂，造成細(xì)胞壁的中膠層、次生細(xì)胞壁等嚴(yán)重變形［19］. 從成都東華門遺址分離出的主要腐蝕細(xì)菌為芽孢桿菌、金黃桿菌和假單胞菌. 芽孢桿菌屬的細(xì)菌能夠形成芽孢，芽孢桿菌能夠在各種極端環(huán)境中存活，如高溫、極酸、極鹽、殺菌劑等，在自然環(huán)境中廣泛存在［20］. 芽孢桿菌都能夠形成帶有芽孢的生物膜，產(chǎn)生相似的代謝產(chǎn)物，都能產(chǎn)生環(huán)肽、抗生素、酸（多聚谷氨酸、聚天冬氨酸）和聚多糖等［21］. 但由于微生物腐蝕機(jī)理復(fù)雜，目前，芽孢桿菌屬微生物腐蝕作用機(jī)理仍有待研究［22］. 金黃桿菌屬形態(tài)呈現(xiàn)黃色、淡黃色，顏色鮮亮，嚴(yán)重?fù)p害了文物的藝術(shù)價(jià)值和觀賞價(jià)值，此外，其能產(chǎn)黏液、參與脫氮并產(chǎn)生EPS，促進(jìn)物體表面形成生物膜，造成文物表面溶解氧的濃度差異，形成適宜鐵氧化菌、硫酸鹽還原菌和產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)的環(huán)境，加劇文物腐蝕［23］.

目前，微生物多樣性研究主要是于編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進(jìn)行的. 細(xì)菌主要是基于16S區(qū)，16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基16S rRNA的DNA序列，這些序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū)，保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異.

本研究結(jié)果表明，將低濃度的化學(xué)抑菌劑和溫和的中藥成分復(fù)配使用，與高濃度化學(xué)抑菌劑相比較，針對(duì)東華門古遺址分離出的關(guān)鍵菌株仍具有良好的殺菌效果，為東華門遺址的微生物病害的防治工作奠定了一定的基礎(chǔ).但本研究仍需要深入探究大黃、黃芩、艾葉和低濃度次氯酸鈉在長(zhǎng)期使用過(guò)程中對(duì)文物和環(huán)境的影響，以及在東華門遺址現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行細(xì)菌的殺菌效果研究.

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