唐婷 李汶晉 李睿 馮紅

摘要：為探究嗜麥芽糖寡氧單胞菌H002響應(yīng)金屬鈾沖擊的分子機制及生物修復鈾污染的潛力，本研究從基因組和轉(zhuǎn)錄組兩個層面進行了分析.基因組測序結(jié)果表明， H002基因組大小為5 099 056 bp， 預測編碼4780個蛋白; 與其他6個近緣菌株相比， H002擁有344個獨特的編碼基因， 涉及膜轉(zhuǎn)運、細胞運動和分泌等功能. 轉(zhuǎn)錄組分析顯示， 在鈾脅迫的早期（1 h）， 差異基因主要富集于細胞運動、分泌、蛋白質(zhì)和肽聚糖合成等KEGG途徑. 部分分泌通道相關(guān)基因的表達下調(diào)，可降低細胞對鈾離子的攝取， 進而減輕鈾離子對細胞的毒性. 在鈾脅迫的后期（2 h和4 h）， 參與鈾生物礦化的磷酸酶相關(guān)基因和能夠提供還原電子的細胞色素c基因的表達上調(diào)， 能以主動方式降低鈾的細胞毒性.

關(guān)鍵詞：嗜麥芽糖寡氧單胞菌; 鈾; 基因組; 轉(zhuǎn)錄組學; 生物修復

收稿日期： 2022-12-15

基金項目： 四川省輻射誘變技術(shù)育種平臺項目（2021YFYZ0011）

作者簡介： 唐婷（1997-）， 女， 四川南充人， 碩士研究生， 研究方向為微生物學. E-mail： tangting@ stu.scu.edu.cn

通訊作者： 馮紅. E-mail： hfeng@scu.edu.cn

Genomic analysis and transcriptomic response to

uranium stress of Stenotrophomonas maltophilia H002

TANG Ting， LI Wen-Jin， LI Rui， FENG Hong

（Sichuan Key Laboratory of Molecular Biology and Biotechnology，

College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

To explore the molecular mechanism of Stenotrophomonas maltophilia H002 in response to metal uranium impact? and the potential of bioremediation of uranium pollution， genome and transcriptome analyses were performed in this study. It was shown that the H002 genome consists of 5 099 056 bp to encode 4780 proteins. Compared with the 6 homologous strains， H002 encodes 344 unique proteins， mainly involved in membrane transport， cell motility and secretion. Transcriptome analysis revealed that in the early stage （1 h）of uranium stress， the differentially expressed genes were mainly enriched in KEGG pathways such as cell mobility and secretion， the biosynthesis of protein and peptidoglycan. The downregulation of partial secretion channel-related genes may reduce the absorption of uranium ions， hence decreasing cellular toxicity. In the later stage （2 h and 4 h）of uranium stress， upregulation of the genes encoding phosphatases involved in uranium mineralization and the cytochrome c proteins， which can provide the reducing electronics， may help reduce the toxicity to the cells.

Stenotrophomonas maltophilia; Uranium; Genome; Transcriptome; Bioremediation

1 引 言

隨著工業(yè)化的快速發(fā)展， 在帶來巨大經(jīng)濟效益的同時， 也面臨著化石能源的日益枯竭和嚴重的環(huán)境污染. 因此尋找儲備充足而且污染小的能源迫在眉睫， 核能就是其中的一種選擇. 核能是由原子核經(jīng)核反應(yīng)后產(chǎn)生的能量， 其中重金屬鈾的裂變反應(yīng)是目前生產(chǎn)核能的主要方式. 但是在鈾礦的開采、冶煉以及使用過程中， 不可避免的會造成一些放射性污染^[1]. 這些污染物在衰變的過程中會產(chǎn)生放射線， 對人類和動植物都具有極大的損害. 因此， 鈾放射性污染的治理也成了一個需要攻克的難題^[2]. 目前鈾污染的治理主要有物理、化學和生物方法， 其中物理方法主要包括焚燒、蒸餾、蒸發(fā)及傾倒等; 化學方法主要有化學沉淀、濕式氧化、酸性消化等， 這兩種方法不僅需要較高的成本， 還可能帶來環(huán)境污染^[3]， 而生物修復因其成本低及生態(tài)友好引起了人們的重視^[4].

生物修復的機制主要包括細胞內(nèi)積累、生物礦化、細胞表面吸附和生物還原， 其中大多數(shù)的研究集中在生物礦化和生物還原這兩個方面^[5]. U（VI）的生物礦化是指U（VI）與微生物相關(guān)的配體如磷酸鹽、碳酸鹽或氫氧化物沉淀; 鈾的生物還原是指微生物可以通過還原作用將高毒性的U（VI）還原成難溶且低毒性的U（IV）， 從而達到治理鈾污染的作用. 例如沙雷氏菌屬可以在磷酸酶的介導下將U（VI）沉淀為胞外磷酸鈾礦（HUO₂PO₄）^[6]; 硫還原菌可以通過毛狀蛋白絲或菌毛還原U（VI）^[7]; 奧奈達希瓦氏菌也可通過還原作用將高毒性的U（VI）還原成難溶且低毒的U（IV）^[8]. 許多微生物被用于處理鈾污染的廢水， 但常見的微生物對輻射很敏感， 放射性核素鈾的放射毒性將會影響其生存及某些特定功能， 從而限制它們在治理鈾污染中的應(yīng)用. 目前的研究表明， 嗜麥芽糖寡氧單胞菌耐受高水平的有毒重金屬， 諸如Cd、Pb、Co、Zn、Hg、Ag和鈾酰等， 并且還能在50 mmol/L的亞硒酸鹽和25 mmol/L的亞碲酸鹽條件下生長， 并將其分別還原為單質(zhì)硒粒Se⁰和晶體碲Te^0[9]. 因此， 嗜麥芽糖寡氧單胞菌在鈾以及其它重金屬離子的治理方面具有一定的潛力.

隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展， 利用組學的方法解析分子機制已成為重要的研究手段. 轉(zhuǎn)錄組測序可以了解微生物在去除重金屬和適應(yīng)環(huán)境的過程中， 胞內(nèi)發(fā)生的一系列復雜的生理生化反應(yīng)分子機制^[10]. 分子機制的解析有助于理解細菌如何與環(huán)境中的放射性核素相互作用， 同時可以用來改進生物修復技術(shù)^[11]. 本實驗室前期采用150 mg/L的U（VI）進行篩菌， 獲得一株對重金屬鈾具有高度耐受能力的嗜麥芽糖寡氧單胞菌H002， 在400 mg/L的鈾溶液下， 鈾的去除率為60%， 換算的吸附量為240 mg/g^[12]. 為了進一步探索H002對金屬鈾的響應(yīng)機制， 本研究針對H002進行基因組測序， 通過組裝獲得了完整的基因組; 并通過轉(zhuǎn)錄組測序， 分析研究了對鈾的適應(yīng)機制， 為后續(xù)的菌株改造以及鈾污染的治理提供理論依據(jù).

2 材料和方法

2.1 材 料

嗜麥芽糖寡氧單胞菌H002（CGMCC 1.18418）由本實驗室在⁶⁰Co輻照環(huán)境中分離獲得. 菌株采用TGY培養(yǎng)基（0.5%蛋白胨、0.3%酵母粉、0.1%葡萄糖）于30 ℃培養(yǎng).

2.2 方 法

2.2.1 基因組DNA和RNA提取

挑取H002單菌落于TGY液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.8， 離心收集菌體， 參照SDS-酶裂解法^[13]提取基因組DNA. 將TGY過夜培養(yǎng)的新鮮菌液， 按1%接種至100 mL TGY液體培養(yǎng)基中， 30 ℃震蕩培養(yǎng)， 8 h后加入終濃度為400 mg/L的U（VI）溶液， 繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)， 并取菌液測定OD₆₀₀. 在鈾處理0 h、1 h、2 h、4 h分別收取2～3 mL菌液， 經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存， 用于提取總RNA. 總RNA按照TRIzol試劑（購自 Thermo Scientific^TM）指南提取.

2.2.2 基因組測序、組裝和注釋

上述基因組DNA經(jīng)質(zhì)檢達標后（DNA濃度高于100 ng/μL， 且總量大于10 μg）， 委托北京諾禾致源生物科技有限公司利用PacBio RSⅡ測序平臺進行建庫、測序， 原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（PRJNA656069）. 通過SMRT Portal（v2.3.0）平臺去除低質(zhì)量的堿基及adapter， 獲得subreads數(shù)據(jù)， 然后采用HGAP^[14]基于有向無環(huán)圖的一致性進行從頭組裝， 最后運用Pbjelly^[15]軟件利用PacBio長讀取數(shù)據(jù)填充gap， 獲得閉合完整的基因組序列.

將組裝完整的基因組序列采用Rast系統(tǒng)（https：//rast.nmpdr.org/）^[16]進行在線注釋; 然后將預測的基因上傳Blast2GO^[17]， 利用內(nèi)置比對程序完成序列與Nr數(shù)據(jù)庫的同源比對， 結(jié)果文件經(jīng)Blast2GO數(shù)據(jù)庫搜尋后獲得GO注釋文件. 同時將基因組序列提交至在線網(wǎng)站（https：//www. genome.jp/tools/kaas/）^[18]與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對， 利用TBtools^[19]軟件進行富集分析. 最后采用Circos^[20]軟件繪制基因組的二維可視化圖譜.

2.2.3 轉(zhuǎn)錄組分析

將檢測合格的總RNA樣品委托北京諾禾致源生物科技有限公司使用Illumina PE150平臺進行雙端測序， 原始數(shù)據(jù)已提交NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（PRJNA656069）. 經(jīng)trim_galore和multiQC^[21]進行數(shù)據(jù)質(zhì)控， 得到clean data， 然后提交至Hisat2^[22]， 根據(jù)H002基因組序列建立索引， 采用默認參數(shù)運算并獲得比對文件， 運用samtools^[23]軟件完成文件的排序及格式轉(zhuǎn)換， 再利用StringTie^[24]進行定量， 使用python腳本分析數(shù)據(jù)獲得轉(zhuǎn)錄本的count文件及TPM值; 最后， 基于R語言的edgeR^[25]軟件包分析count數(shù)據(jù)， 計算得到log₂FC、P value和FDR等數(shù)值， 獲得差異基因（DEG）， 篩選闕值FDR < 0.05， 且|log₂FC| > 1.

2.2.4 RT-qRCR

為驗證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性， 隨機挑選了4個基因進行RT-qRCR， 分析了相關(guān)基因的相對表達量. qPCR的引物利用Primer5設(shè)計， 引物序列見表1， 并以16S rRNA基因作為內(nèi)參基因.

3 結(jié) 果

3.1 基因組分析

3.1.1 S.maltophilia H002基因組組裝與注釋

為了解嗜麥芽糖寡氧單胞菌H002的基因組特征及遺傳基礎(chǔ)， 本研究對H002菌株進行了全基因組測序. 結(jié)果表明H002菌株的基因組大小為5 099 056 bp（圖1a）， GC含量為66.5%. Rast預測得到4868個基因， 其中包括4780個蛋白編碼基因， 13個rRNA和75個tRNA基因.

進一步分析了H002的基因功能， 將基因組提交GO數(shù)據(jù)庫進行比對， 共注釋3287個基因， 占總編碼基因的68.76%， 主要分為三個組分， 其中生物過程（Biological process）占比48.49%， 主要參與代謝過程及細胞過程; 細胞組分（cellular component）占比24.61%， 主要參與細胞解剖實體和細胞內(nèi)組分; 分子功能（molecular function）占比66.05%， 其中催化活性及結(jié)合相關(guān)的基因最多（圖1a）. 利用KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝通路富集， 共注釋了1942個基因， 基因分布較多的依次為次生代謝產(chǎn)物生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）、抗生素生物合成（Biosynthesis of antibiotics）、不同環(huán)境中的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments）和雙組分系統(tǒng)（Two-component system）.

3.1.2 比較基因組分析

將H002基因組與數(shù)據(jù)庫中的其它嗜麥芽糖寡氧單胞菌菌株的基因組進行了比較， 各基因組的基本特征見表2. 它們的基因組大小和GC含量均非常相似， 其中H002預測編碼基因最多， 編碼基因4780個. 比較基因組分析表明， H002和其它6株嗜麥芽糖寡氧單胞菌共有3250個核心蛋白（圖1b）， 各菌株存在的特有蛋白數(shù)分別為344個H002， 215個SM 866， 187個CW002SM， 171個FDAARGOS_325， 163個WGB211， 132個T50-20， 70個ISMMS3. 其中H002的特有基因最多， 包括310個基因編碼未知蛋白; 另外 34個已知功能基因， 主要編碼膜蛋白、Ⅲ型限制-修飾系統(tǒng)以及分泌相關(guān)的蛋白. 這些特有的基因可能與不同菌株的生境適應(yīng)， 如鈾的耐受相關(guān).

3.2 對鈾脅迫的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)

3.2.1 鈾沖擊對S. maltophilia H002細胞生長的影響

為探究H002菌株在鈾沖擊下的響應(yīng)機制， 首先測量鈾沖擊下細菌的生長曲線， 并在細胞生長的對數(shù)期， 即8 h加入400 mg/L的鈾. 通過測定不同時間的OD₆₀₀值， 用于監(jiān)測細胞的生長情況（圖2a）. 結(jié)果表明在加入鈾以后， 細胞密度增長緩慢， 說明細胞生長受到抑制; 隨著時間的推移， 細胞逐步恢復生長， 細胞密度在處理4 h后， 基本達到對照水平. 說明H002細胞在鈾沖擊下， 經(jīng)過短暫的適應(yīng)， 可能通過調(diào)整細胞的代謝， 迅速恢復生長.

3.2.2 S. maltophilia H002對鈾脅迫的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)

為了明確H002菌株響應(yīng)鈾脅迫的分子或代謝過程， 分別在鈾處理后的不同時間點取樣， 進行了比較轉(zhuǎn)錄組分析. 結(jié)果顯示（圖2b）， 在鈾處理后1 h與0 h相比， 發(fā)現(xiàn)近千個差異表達基因， 其中488個基因上調(diào)， 460個基因下調(diào)， 說明H002細胞對鈾脅迫作出了快速的響應(yīng). 隨著時間的延長， 處理后2 h和4h的差異基因數(shù)目繼續(xù)增加， 特別是上調(diào)的基因， 在4 h達到1743個. 說明細胞通過調(diào)節(jié)基因表達， 逐漸適應(yīng)脅迫環(huán)境， 細胞恢復正常生長.

為了更直觀的展現(xiàn)鈾沖擊后不同恢復生長階段的差異基因表達模式， 將3033個差異基因的表達水平（TPM值）經(jīng)過歸一化處理， 繪制了表達量熱圖（圖2c）. 結(jié)果表明， H002菌株經(jīng)鈾沖擊后， 基因表達的響應(yīng)大概可區(qū)分為三種表達模式. 第一類在處理初期（1 h）表達量持續(xù)上升， 主要包括雙組份信號轉(zhuǎn)導及代謝分泌過程的基因. 第二類為初期（1 h）表達量下降， 后期（2 h和4 h）表達量上升. 這類基因主要參與調(diào)控細胞的運動、信號轉(zhuǎn)導以及DNA的復制及修復. 第三類為處理初期（1 h）表達量基本不變， 后期（2 h和4 h）表達量上調(diào)的基因， 主要涉及信號傳遞及DNA的復制和修復.

3.2.3 S. maltophilia H002對鈾沖擊初期的差異表達基因的分析

上述結(jié)果表明鈾處理的早期（1 h）， 細菌細胞受到鈾沖擊， 導致出現(xiàn)近千個差異表達基因. 為了進一步了解鈾脅迫早期胞內(nèi)的調(diào)控機制， 將鈾處理1 h與0 h的差異基因進行了KEGG富集分析（圖3a）. 其中， 上調(diào)基因主要涉及核糖體和生物抗性及肽聚糖合成過程. 核糖體作為蛋白質(zhì)翻譯的機器， 在蛋白質(zhì)的合成過程中必不可少. H002菌株有70個核糖體相關(guān)基因（圖3b）， 在鈾脅迫的初期大多數(shù)表達上調(diào)， 但是隨著處理時間的增長基因表達量不斷下降， 說明前期細菌通過增加蛋白質(zhì)的合成， 響應(yīng)鈾的刺激. CAMPs是宿主抵御微生物感染和微生物產(chǎn)物的天然防御系統(tǒng)的重要組成部分， 而細菌已經(jīng)發(fā)展出了許多對抗CAMPs的機制. 這些抗性機制包括通過陽離子分子取代細胞表面的陰離子成分降低對CAMPs的親和力， 膜射流泵以及肽酶的產(chǎn)生^[26]. 此前有報道稱smeDEF基因的表達能夠促進嗜麥芽糖寡氧單胞菌的固有耐藥性^[27]. KEGG富集在CAMP抗性通道的RND型外排泵基因smeDEF（peg.4155， peg.4156， peg.4157）在鈾處理1 h后其表達量急劇上升， 表達水平提高了至少4倍以上， 后續(xù)也維持高水平表達. 說明外排泵基因能夠迅速響應(yīng)鈾的刺激， 可能具有解毒功能. 肽聚糖是細菌細胞壁的主要組成之一， 對于維持細胞形態(tài)及細胞存活是必需的， 說明細胞可能通過增強細胞壁從而抵御鈾離子進入細胞.

膜分泌通道作為細菌與外界環(huán)境溝通的重要樞紐， 在細菌的應(yīng)激響應(yīng)中具有重要作用. 分析發(fā)現(xiàn)H002中具有223個膜相關(guān)蛋白， 在鈾處理的初期， 有64個基因表達上調(diào)， 主要注釋為RND型蛋白以及其它的外膜轉(zhuǎn)運蛋白， 如金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白. 金屬離子外排是細菌常用的一種解毒策略， RND-HME（Resistance-nodulation-division heavy metal efflux）被認為是細菌潛在的鈾代謝策略^[28]. 基于H002的38個RND型相關(guān)基因繪制了表達量熱圖（圖3c）， 鈾處理初期（1 h）， 包括上述三個smeDEF基因在內(nèi)共有16個基因上調(diào)， 其中包含注釋為鈷/鋅/鎘等重金屬的外排蛋白、膜融合蛋白以及參與多藥外排的轉(zhuǎn)運蛋白. 但是， Na⁺和H⁺轉(zhuǎn)運蛋白的表達量并未發(fā)生變化， 說明一價陽離子通道可能不參與初期的鈾調(diào)控反應(yīng).

下調(diào)的基因主要參與調(diào)控細胞的分泌及運動. 其中T6SS作為膜內(nèi)一個完整的分泌體系， 主要以接觸依賴的方式將毒性效應(yīng)物質(zhì)傳遞給其他細胞. 有研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌對一些抗生素的耐藥機制與T6SS系統(tǒng)有關(guān). 例如耐四環(huán)素抗性質(zhì)粒的存在會沉默T6SS的功能， 提高細菌的耐藥性^[29]. 基于H002細菌的14個T6SS相關(guān)基因繪制了表達量熱圖（圖3d）， 在鈾沖擊的早期， 幾乎所有的T6SS基因均表達下調(diào)， 說明H002經(jīng)鈾處理后， 再短時間內(nèi)可能通過調(diào)低T6SS系統(tǒng)的表達， 從而提高細菌的抵抗力. 細菌在面臨不利環(huán)境時， 可以通過運動行為實現(xiàn)“避害”， 同樣環(huán)境脅迫也能誘發(fā)細菌的運動發(fā)生改變甚至抑制細菌的運動. 再鈾處理后初期， 大量細菌的鞭毛及纖毛相關(guān)基因的表達量下調(diào)， 說明鈾對細菌的運動造成了損傷（圖4b和4c）.

3.2.4 S. maltophilia H002對鈾沖擊后期的差異表達基因的分析

為理解鈾處理后期的細胞調(diào)控機制， 著重分析了處理后4 h與0 h的差異表達基因. 上調(diào)基因主要涉及細胞的膜轉(zhuǎn)運、分泌及代謝， 其中RND外排基因的表達水平均有顯著提高（圖3c）; 此外， 66個ABC轉(zhuǎn)運相關(guān)基因中有54個基因的表達也上調(diào). 說明隨著鈾刺激時間的增長， 細胞的防御機制全面開啟. 一般來說， 細胞色素蛋白在還原過程中是必不可少的， 通過以細胞色素c作為電子載體可將電子傳遞給U（VI）， 從而實現(xiàn)鈾的生物還原^[30]. 分析結(jié)果顯示細胞色素c相關(guān)基因（peg.3260、peg.3262、peg.4325、peg.4326）的表達量上調(diào). 為了感知和響應(yīng)環(huán)境變化， 細菌進化出不同的調(diào)節(jié)系統(tǒng)， 包括參與對金屬離子響應(yīng)的雙組分系統(tǒng)（Two-component system）^[31]. 與0 h相比， 4 h時許多雙組份系統(tǒng)的表達上調(diào)， 說明一些雙組分系統(tǒng)能夠感應(yīng)金屬離子， 增強下游防御基因的表達， 從而抵御鈾離子的脅迫.

微生物分泌的磷酸酶可以水解溶液中的有機磷化合物產(chǎn)生無機磷酸鹽， 后者與鈾反應(yīng)形成穩(wěn)定的磷酸鈾酰沉淀， 證明磷酸酶基因在鈾的解毒過程中發(fā)揮著重要作用^[32]. 基于H002中的36個磷酸酶基因的表達量熱圖（圖4a）， 顯示在早期（1 h）， 大多數(shù)磷酸酶基因表達變化不顯著; 當細胞適應(yīng)鈾脅迫后， 開始持續(xù)上調(diào)表達， 4 h與1 h相比， 其中的30個基因的表達量提高1倍以上， 而膜相關(guān)磷脂磷酸酶（putative membrane-associated phospholipid phosphatase， peg.847）表達量上調(diào)最高， 達16倍. 相反， 只有3個基因的表達量下調(diào). 這些結(jié)果說明磷酸酶基因主要在細胞適應(yīng)鈾脅迫環(huán)境后， 可能開始發(fā)揮解毒作用.

鞭毛是細菌表面生長的細長且彎曲的蛋白質(zhì)附屬絲狀物， 不僅是細菌的一種運動器官， 同時還是一個分泌通道. 利用30個鞭毛組成元件的基因繪制了表達量熱圖（圖8）， 數(shù)據(jù)表明在早期階段， 大多數(shù)下調(diào)， 在2 h時后轉(zhuǎn)而持續(xù)上調(diào)表達， 其中編碼鞭毛合成蛋白Flis的基因表達量上調(diào)達到10倍. 此外， 纖毛作為細菌表面延伸出來的絲狀結(jié)構(gòu)， 同樣也是細菌的一個運動器官， 而且參與分泌及電子的傳遞. 據(jù)報道， 纖毛通過電子傳遞， 可在細胞外還原U（VI）， 并且可以作為細胞的一種保護機制， 使U（IV）沉積物分散在纖毛中， 防止鈾在細胞周質(zhì)內(nèi)過度沉淀， 從而減少對細胞的毒性作用^[33]. 為此， 對38個纖毛相關(guān)基因進行了熱圖分析（圖4c）， 結(jié)果顯示與0 h相比， 幾乎所有的基因在受鈾脅迫的早期均表達下調(diào) （1 h）; 但隨著響應(yīng)機制的激活， 大多數(shù)纖毛相關(guān)的基因在后期（4 h）表達轉(zhuǎn)為上調(diào). 說明在鈾處理早期解毒機制尚未完全開啟時， 細胞通過將鈾泵出細胞以及減少鈾離子的吸收從而降低鈾的累積毒性， 而隨著解毒相關(guān)基因的表達增強， 細菌通過運動及膜轉(zhuǎn)運的增強促進鈾的吸附從而完成鈾的沉淀及還原.

3.2.5 RT-qPCR驗證差異基因

隨機選取轉(zhuǎn)錄組中的4個差異基因（peg.888、peg.2378、peg.847、peg.4157）， 通過RT-qPCR， 分析了這4個基因在0 h、2 h、4 h的表達量， 并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了比較， 結(jié)果表明這4個基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與qPCR數(shù)據(jù)趨勢基本一致（圖5）， 說明基于轉(zhuǎn)錄組的差異基因表達水平是可靠的.

4 討 論

鈾作為一種常見的放射性元素， 存在于一些礦物中， 但含量都很低. 鈾的毒性主要由其化學性質(zhì)和放射性決定的， 一般來說溶解度越高， 毒性越強. 因此將高溶解度的鈾轉(zhuǎn)化為沉淀或可溶性低的鈾礦成為鈾污染處理的重要途徑. 鈾的生物修復就是利用一些具有還原或礦化能力的微生物來治理鈾污染， 因其不同于物理和化學方法的高昂成本而廣受重視. 但是， 鈾對微生物細胞也具有毒性， 原因是鈾離子可能與某些酶的競爭性結(jié)合或鈾取代了酶的金屬離子輔助因子， 從而導致酶失活， 嚴重時甚至導致細胞死亡^[34]. 因此， 篩選具有高效生物修復潛力和高耐受性的細菌是必要的; 同時， 利用組學技術(shù)探索生物修復途徑和耐受機理， 對于理解和菌株改造在環(huán)境治理的實踐中同樣具有重要意義.

本實驗室前期分離得到了一株具有較高濃度鈾吸附能力和耐受的嗜麥芽糖寡氧單胞菌H002菌株， 具有開發(fā)用于鈾污染治理的潛力. 因此， 為了進一步了解H002菌株遺傳基礎(chǔ)以及耐受和吸附鈾的分子機理， 本研究利用三代DNA測序并結(jié)合組學分析技術(shù)， 測序獲得了H002的基因組， 并通過比較基因組分析， 發(fā)現(xiàn)H002菌株具有一些菌株特有的基因， 如膜蛋白和分泌通道相關(guān)的蛋白等， 這些基因可能與其耐鈾機制相關(guān).

其次， 利用RNA測序分析研究了H002菌株對鈾沖擊的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答. 生長曲線結(jié)果表明， 在鈾處理后的0～4 h內(nèi)， 細胞生長速度雖有減緩， 但整體差異較小， 仍呈上升趨勢. 重要的是H002能夠在較短時間內(nèi)適應(yīng)鈾脅迫， 很快恢復并維持細胞自身的生長. 在鈾沖擊后的4個時間點總共涉及3033個差異基因， 占總基因的63%， 主要涉及信號轉(zhuǎn)導以及細胞代謝等相關(guān)的基因， 說明這些基因可以通過調(diào)節(jié)表達水平， 適應(yīng)并降低鈾脅迫的細胞毒性， 在鈾處理4 h后細胞恢復正常生長. 值得注意的是， 在鈾脅迫處理后的不同階段， 差異表達基因類別是不同的， 說明不同的基因在響應(yīng)鈾脅迫發(fā)揮了不同的功能. 在鈾處理后早期（1 h）， 核糖體相關(guān)基因和細菌抗性相關(guān)基因及肽聚糖合成基因上調(diào)， 說明細胞的蛋白質(zhì)合成量增加， 同時大量合成肽聚糖可能強化細胞壁， 有助于抵御鈾離子. 此外， 膜分泌通道作為鈾離子進入細胞的一道關(guān)卡， 在鈾防御機制中具有重要作用， 部分膜通道相關(guān)基因如RND外排蛋白基因在鈾沖擊早期表達量上調(diào)， 可能降低鈾在細胞內(nèi)的積累^[28]. 此外， VI型分泌通道T6SS相關(guān)基因的表達下調(diào)， 可能減少細胞攝取鈾離子. 據(jù)報道T6SS可能負調(diào)控細菌的防御反應(yīng)^[29]. 因此， 在脅迫初期， H002細胞主要通過調(diào)節(jié)上述相關(guān)基因表達， 規(guī)避鈾對細胞的毒性.

當H002細胞適應(yīng)鈾脅迫后， 即在2～4 h時間段， 大量的基因表達上調(diào)， 說明細菌的防御機制全面開啟. 例如， 參與生物還原反應(yīng)的細胞色素蛋白c相關(guān)基因在4 h表達量顯著提高; 同時大量具備電子傳遞功能的鞭毛及纖毛合成相關(guān)基因的表達量也上調(diào)， 說明H002菌株可能利用生物還原將高毒性U（Ⅵ）還原成低毒性的U（Ⅳ）， 從而達到解毒效果. 此外， 鈾沖擊后期磷酸酶相關(guān)基因的表達量得到顯著的增強， 這些磷酸酶催化形成的磷酸基團很有可能參與了S. maltophilia H002與鈾之間的相互作用， 使U（Ⅵ）轉(zhuǎn)化為磷酸鈾?；衔锍恋恚?從而避免鈾對細胞的毒性.因此， 在鈾脅迫后期， H002可能以主動的方式降低鈾的生物有效性， 從而降低對細胞的毒性.

綜上所述， S. maltophilia H002具備健全的膜通道和分泌系統(tǒng)、磷酸酶編碼基因、電子傳遞系統(tǒng)等遺傳基礎(chǔ)， 可以通過生物還原以及生物礦化等機制將可溶性的鈾污染轉(zhuǎn)化為不溶性的鈾， 實現(xiàn)鈾污染的生物修復， 這與硫酸鹽還原菌的修復過程相似^[35]. 然而， 鈾污染經(jīng)常伴隨Cd、Cu、Zn等重金屬的共同污染， 這些重金屬可能威脅硫酸鹽還原菌的生長^[36]. 而S. maltophilia對Cd、Cu、Zn等重金屬也具有一定的耐受性^[9]， 因此， S. maltophilia H002在治理鈾以及其他重金屬污染等方面具有一定優(yōu)勢和開發(fā)潛力.

5 結(jié) 論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組學分析了S. maltophilia H002耐受重金屬鈾離子的分子機制， 揭示了在鈾沖擊的早期階段（1 h）， H002細胞通過上調(diào)蛋白質(zhì)和細胞壁的合成， 以及膜通道， 可能降低細胞吸收鈾離子， 規(guī)避鈾離子對細胞的損傷; 當細胞適應(yīng)脅迫后， 即在2 h和4 h能夠啟動包括雙組分系統(tǒng)、RND外排蛋白、磷酸酶、細胞色素c等基因的表達， 通過感應(yīng)鈾離子脅迫信號及傳遞、生物礦化和還原作用等機制主動降低鈾的細胞毒性.

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引用本文格式：

中 文： 唐婷， 李汶晉， 李睿， 等. 嗜麥芽糖寡氧單胞菌H002的基因組分析及對鈾脅迫的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)[J]. 四川大學學報： 自然科學版， 2023， 60： 066003.

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