薛海瑞 李國秀 孫意冉 王韜宇 樊云芳 唐琳

摘 要 ???：為探究黑果枸杞花色苷最佳提取工藝和抗氧化活性，采用超聲酶輔助提取法、乙醇/硫酸銨雙水相萃取法、乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取法提取黑果枸杞花色苷，通過響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，并使用 t -BHP誘導(dǎo)BRL 3A細(xì)胞建立抗氧化模型來探索黑果枸杞花色苷的氧化應(yīng)激保護(hù)作用.結(jié)果表明，超聲酶輔助提取得率為：（17.92±0.04） mg/g；乙醇/硫酸銨雙水相萃取得率為：（15.46±0.31） mg/g； 乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取得率為：（15.02±0.19） mg/g.體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，乙醇/硫酸銨雙水相萃取的花色苷（LRN）抗氧化活性最強(qiáng)，純化后的乙醇/硫酸銨雙水相萃取的花色苷（LRNA）可通過減少細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生來緩解t-BHP誘導(dǎo)的氧化損傷.綜上所述，該工藝便捷、穩(wěn)定可用于黑果枸杞花色苷的提取，同時(shí)證明了LRN抗氧化活性最強(qiáng).

關(guān)鍵詞 ：黑果枸杞； 花色苷； 響應(yīng)面； 抗氧化； 活性氧；

中圖分類號(hào) ： Q949.95 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ：A DOI ： ?10.19907/j.0490-6756.2023.046004

收稿日期： ?2022-10-21

基金項(xiàng)目： ?寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022BBF0100103）

作者簡介： ??薛海瑞（1997-）， 男， 山西省太原人， 碩士研究生， 主要研究領(lǐng)域?yàn)樗幱锰烊划a(chǎn)物.

通訊作者： ?唐琳.E-mail：tanglin@scu.edu.cn

Research on optimization of the extraction process and antioxidant ?activity of anthocyanins from ?Lycium ruthenicum ?Murr.

XUE Hai-Rui ?1， LI Guo-Xiu ?1， SUN Yi-Ran ?1， WANG Tao-Yu ?1， FAN Yun-Fang ??2， TANG Lin ?1

（1. Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China;

2. Lycium Barbarum Research Institute， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan 750000， China）

To investigate the optimal extraction process and antioxidant activity of anthocyanins of ?Lycium ruthenicum ?Murr.， the anthocyanins of ?Lycium ruthenicum ?Murr. were extracted by ultrasonic enzyme-assisted extraction， ethanol/ammonium sulfate aqueous two-phase extraction， ethanol/sodium dihydrogen phosphate aqueous two-phase extraction， and the extraction process was optimized by response surface methodology， the antioxidant model of BRL 3A cells induced by ?t -BHP was used to explore the protective effect of ?Lycium ruthenicum ?Murr. anthocyanins on oxidative stress. The results showed that the yield of ultrasonic enzyme assisted extraction was （17.92 ± 0.04） mg/g; the yield of ethanol/ammonium sulfate aqueous two-phase extraction was （15.46 ± 0.31） mg/g; the extraction yield of ethanol/sodium dihydrogen phosphate aqueous two-phase system was （15.02 ± 0.19） mg/g. The in vitro antioxidant experiments showed that the antioxidant activity of anthocyanins （LRN） extracted by EtOH/（NH 4） 2SO ?4 aqueous two-phase extraction was the strongest， purified EtOH/（NH 4） 2SO ?4 aqueous two-phase extraction of anthocyanins （LRNA） can alleviate ?t -BHP-induced oxidative damage by reducing ROS production in cells. In summary， this process is convenient and stable and can be used for the extraction of anthocyanins from ?Lycium ruthenicum ?Murr. At the same time， it also proves that LRN has the strongest antioxidant activity.

Lycium ruthenicum ?Murr.; Anthocyanins; Response surface; Antioxidant; ROS

1 引 言

黑果枸杞（ Lycium ruthenicum ?Murr.）為茄科枸杞屬植物，是我國西北地區(qū)特有的耐旱、耐堿、耐鹽生灌木植物.其果實(shí)中含有豐富的花青素、類胡蘿卜素、維生素等多種營養(yǎng)成分 ?［1］ ， 關(guān)于黑果枸杞化學(xué)成分的研究目前主要有多糖類、黃酮類、花色苷類、生物堿類、精油和脂肪酸類，現(xiàn)代藥學(xué)研究表明，黑果枸杞具有抗氧化、抗疲勞、降血糖、降血脂、保肝護(hù)腎、免疫調(diào)節(jié) ??［2-4］.

花色苷是黑果枸杞中重要的抗氧化活性成分，目前已知的黑果枸杞花色苷種類主要有：飛燕草素、矮牽牛素、矢車菊素、天竺葵素、芍藥素等以及衍生的糖苷 ?［5］.前人對(duì)花色苷物質(zhì)進(jìn)行了大量的活性研究，包括抗氧化、降血脂、抗衰老、抗腫瘤、抑菌等活性研究，但當(dāng)前對(duì)黑果枸杞花色苷提取工藝的研究不夠全面，存在的問題主要是花色苷得率較低、目的物質(zhì)失活、提取物雜質(zhì)成分較多難以獲取較高純度花色苷、提取成本較高且污染較大等 ?［6，7］，如何高效經(jīng)濟(jì)的獲取高純度花色苷是研究重點(diǎn).提取花色苷的常用方法主要有有機(jī)溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、微波提取法、超聲波輔助提取法、生物酶輔助提取法等，隨著生物學(xué)提取工藝的發(fā)展，現(xiàn)在單一的提取方法并不能滿足對(duì)活性成分得率高、活性強(qiáng)的需求，雙水相萃取法由于得率較高、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、且有一定的純化作用逐漸應(yīng)用到花色苷的提取中 ?［8］.

響應(yīng)面作為一種優(yōu)化提取的方法，它將提取實(shí)驗(yàn)中目的物質(zhì)得率作為一個(gè)或多個(gè)因素（如料液比、乙醇濃度等）的函數(shù)，并通過圖形將這種函數(shù)關(guān)系直觀的體現(xiàn)出來，并提供最優(yōu)的提取方案，此方法普遍應(yīng)用于中藥活性成分的提取工藝研究中 ??［9］.在本實(shí)驗(yàn)室以往的研究中對(duì)比了青海、甘肅、寧夏、新疆等地黑果枸杞花色苷的含量，其中青海省最高，所以本實(shí)驗(yàn)以青海省黑果枸杞為實(shí)驗(yàn)材料，通過超聲酶輔助提取、乙醇/硫酸銨雙水相萃取、乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取提取黑果枸杞花色苷，并通過響應(yīng)面對(duì)提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化獲取最佳提取工藝，為后續(xù)的工業(yè)提取提供理論參考.

目前對(duì)雙水相萃取得到的花色苷抗氧化能力研究較少，且針對(duì)黑果枸杞不同提取方法所得花色苷體外抗氧化能力對(duì)比研究的資料缺乏.因此本研究采用體外抗氧化及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究不同提取方法得到的花色苷樣品體外抗氧化效果以及對(duì) t -BHP誘導(dǎo)的正常大鼠肝細(xì)胞（BRL 3A）氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為后續(xù)的機(jī)制研究提供參考資料.

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

以青海省的黑果枸杞為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院白潔副教授鑒定為茄科枸杞屬黑果枸杞.

純化后超聲酶輔助法花色苷（LREA）、純化后EtON/（NH ?4） ?2SO ?4雙水相萃取花色苷（LRNA）、純化后EtOH/NaH ?2PO ?4雙水相萃取花色苷（LRPA）由本實(shí)驗(yàn)室提供.大鼠肝細(xì)胞系（BRL 3A）為本實(shí)驗(yàn)室所凍存；

乙醇、VC、磷酸二氫鈉、硫酸銨、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）等試劑均為分析純（成都市科龍?jiān)噭┗S）；纖維素酶、果膠酶購買于成都瑞芬思公司；DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶均購于美國Hyclone公司，胎牛血清購于塞爾博克斯生物制品有限公司；DCFH-DA熒光探針購于南京建成生物工程研究所；DPPH和ABTS購于Sigma-Aldrich中國公司；水為超純水.MS 半微量電子精密分析天平 （ 瑞士 Mettler-Toledo 公司 ）；離心機(jī) H1850 型 （ 長沙 湘儀離心機(jī)儀器有限公司 ）；冷凍干燥機(jī)（寧波市鄞州儀器有限公司）； pH計(jì)（希瑪科技有限公司）；KH-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）.

2.2 方 法

2.2.1 超聲酶輔助提取單因素實(shí)驗(yàn) ?固定各因素變量為酶添加量1.0 mg/g、70%乙醇（v/v）、料液比25 mL/g、溫度45 ℃、pH 3.0、時(shí)間30 min；選擇超聲提取時(shí)間、液料比、乙醇濃度為3個(gè)因素；時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）；液料比（15、20、25、30、35 mL/g）;乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%），采用pH示差法測(cè)定花色苷含量 ?［10］，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2.2.2 雙水相萃取單因素實(shí)驗(yàn) ?固定各因素變量為24%乙醇、液料比25 mL/g、溫度45 ℃、pH3.0、時(shí)間30 min、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%、磷酸二氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%；選擇乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、萃取時(shí)間、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸二氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4個(gè)因素；乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20%、22%、24%、26%、28%）；萃取時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）；硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（21%、22%、23%、24%、25%）；磷酸二氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20%、22%、24%、26%、28%），花色苷含量測(cè)定同2.2.1，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2.2.3 Box-Behnken法優(yōu)化實(shí)驗(yàn) ?根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇提取時(shí)間-液料比-乙醇濃度、乙醇濃度-萃取時(shí)間-硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇濃度-萃取時(shí)間-磷酸二氫鈉為超聲輔助提取法（LRE）、乙醇/硫酸銨雙水相萃取法（LRN）、乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取法（LRP）的自變量，以花色苷含量作為響應(yīng)值 ?［11］，花色苷含量測(cè)定同2.2.1，利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken法設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平見表1～3.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2.2.4 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) ?準(zhǔn)確移取2 mL樣品溶液（6.25～200 μg/mL）至試管內(nèi)，另加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mol/L），搖勻后，避光放置30 min，以無水乙醇作空白對(duì)照，VC做陽性對(duì)照測(cè)517 nm波長處吸光度，平行測(cè)定3次. DPPH自由基清除率=［ 1-（Ai-As）/Ac］×100%其中，Ai代表實(shí)驗(yàn)組吸光度值，As代表樣品本底吸光度值，Ac代表空白組吸光度值 ?［12］.

2.2.5 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn) ?準(zhǔn)確移取2 mL樣品溶液（6.25～200 μg/mL）至試管內(nèi)，與ABTS自由基溶液等體積混合，以無水乙醇作空白對(duì)照，VC做陽性對(duì)照，室溫反應(yīng)30 min.用酶標(biāo)儀測(cè)定734 nm處的吸光值 ?［13］.ABTS自由基清除能力計(jì)算公式同“2.2.1”項(xiàng).

2.2.6 總還原力測(cè)定 ?先加入25 μL不同濃度（6.25～200 μg/mL）的樣品溶液、BHT，25 μL的無水乙醇，分別作為實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組及空白組.每組再加入50 μL PBS溶液（0.2 mol/L、pH 6.6）和25 μL 1%的鐵氰化鉀水溶液，震蕩搖勻，45 ℃孵育1 h.最后加入50 μL 10%的三氯乙酸和60 μL 0.1%的三氯化鐵，震蕩搖勻，在700 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定各反應(yīng)液的吸光值，總還原力的強(qiáng)弱與吸光值大小呈正比 ?［14］.

2.2.7 細(xì)胞培養(yǎng) ?大鼠肝細(xì)胞系BRL 3A細(xì)胞用DMEM低糖培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中含有1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清）置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO ?2濃度為5%.待細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%～90%時(shí)，將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，然后取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2.8 ?t -BHP誘導(dǎo)BRL 3A細(xì)胞損傷模型的建立 ?取處于對(duì)數(shù)生長期的BRL 3A細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用DMEM低糖培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，以 4×10 ?4細(xì)胞/mL接種于96孔板中，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%后吸出培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)分組如下：（1） 對(duì)照組：加入100 μL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（2） 模型組：加入100 μL含不同濃度 t- BHP（200、 300、 400、 500、 600、 700、 800和900 μmol/L）的無血清培養(yǎng)基.每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基， 于細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光值，細(xì)胞存活率用模型組/對(duì)照組×100%表示.

2.2.9 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) ?細(xì)胞前期處理同2.2.8.實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）對(duì)照組：加入100 μL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（2）實(shí)驗(yàn)組：加入100 μL含不同濃度花色苷樣品（25～200 μg/mL）的無血清培養(yǎng)基.每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，后續(xù)測(cè)定步驟同2.2.8，細(xì)胞存活率用實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組×100%表示.

2.2.10 細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn) ?細(xì)胞前期處理同2.2.8.實(shí)驗(yàn)分組如下：（1） 對(duì)照組：加入100 μL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h后，再加入100 μL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h；（2） 藥物組：加入100 μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，再加入100 μL含200 μmol/L ?t -BHP的無血清培養(yǎng)基處理2 h；（3） 實(shí)驗(yàn)組：加入100 μL含不同濃度花色苷樣品（10～100 μg/mL）的無血清培養(yǎng)基處理細(xì)胞12 h，再加入100 μL含200 μmol/L ?t -BHP的無血清培養(yǎng)基處理2 h.后續(xù)測(cè)定步驟同2.2.8，細(xì)胞存活率分別用藥物組/對(duì)照組×100%和實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組×100%表示.

2.2.11 活性氧檢測(cè) ?取處于對(duì)數(shù)生長期的BRL 3A細(xì)胞，以5×10 ?4細(xì)胞/mL接種于12孔板中，每孔加1 mL細(xì)胞懸液.過夜培養(yǎng)后吸出培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2次.對(duì)照組和模型組加入500 μL無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入500 μL含LRN、LRNA（60 μg/mL）無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，對(duì)照組繼續(xù)加入500 μL的無血清培養(yǎng)基，模型組和實(shí)驗(yàn)組均加入500 μL含200 μmol/L ?t -BHP的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS 清洗兩次，對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組均加入500 μL 10 μmol/L的DCFH～DA探針，在37 ℃避光中染色30 min用倒置熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化.

細(xì)胞培養(yǎng)操作同上，將細(xì)胞收集轉(zhuǎn)移到流式專用管，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS含量變化情況，并用FlowJo軟件進(jìn)行分析.

2.2.12 細(xì)胞線粒體膜電位變化檢測(cè) ?取對(duì)數(shù)生長期的BRL 3A細(xì)胞以5×10 ?4細(xì)胞/mL的密度接種于12孔板，培養(yǎng)12 h，對(duì)照組和模型組加入500 μL無血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入500 μL 60 μg/mL的LRN、LRNA預(yù)處理4 h，再加入200 μmol/L ?t -BHP損傷2 h，吸走培養(yǎng)液，用500 μL PBS漂洗2次，每孔加入500 μL JC-10染液，于室溫避光孵育30 min，吸走染液，用PBS洗去未結(jié)合的JC-10染液，每孔加入500 μL無血清培養(yǎng)基，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照.

細(xì)胞培養(yǎng)操作同上，將細(xì)胞收集轉(zhuǎn)移到流式專用管，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化情況，并用FlowJo軟件進(jìn)行分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 黑果枸杞花色苷提取單因素實(shí)驗(yàn)

采用2.2.1所述方法，超聲酶輔助提取法圖1a～1c表明，乙醇濃度70%，提取時(shí)間為30 min，液料比為25 mL/g條件下花色苷的提取效果最好.在50%～90%濃度范圍內(nèi)，提取溶劑的極性由大變小，提取溶劑的滲透力由小變大.超聲時(shí)間過短，不利于黑果枸杞細(xì)胞內(nèi)花色苷的釋放；時(shí)間過長，花色苷的分子結(jié)構(gòu)會(huì)受到超聲所產(chǎn)生的機(jī)械能量的破壞，降低花色苷的提取含量.液料比過低在一定的時(shí)間內(nèi)不能完全溶解花色苷，所以在15～25 mL/g范圍內(nèi)，花色苷的含量逐漸上升.

乙醇/硫酸銨雙水相萃取法圖1 d、1 e和1 f表明，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%，萃取時(shí)間30 min時(shí)花色苷的提取含量達(dá)到最大.當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%時(shí)體系極性剛好與黑果枸杞花色苷相近，極性過高過低都不利于花色苷的釋放.硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，下相無機(jī)鹽富集相爭奪水分子相較上相乙醇溶液增強(qiáng)，導(dǎo)致上相乙醇富集相極性下降，花色苷是高極性物質(zhì)，因此花色苷提取含量下降.

隨萃取時(shí)間的延長，花色苷含量逐漸上升，30 min后花色苷含量隨時(shí)間的延長而逐漸減少.可能是較長的萃取時(shí)間伴隨超聲作用所產(chǎn)生的機(jī)械能量會(huì)使花色苷結(jié)構(gòu)受到破壞，從而引起花色苷提取含量下降.

乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取法圖1f、1g和1i表明，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，磷酸二氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%，萃取時(shí)間在30 min時(shí)花色苷含量最高.當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過26%時(shí)，花色苷的提取含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，原理與EtOH/（NH ?4） ?2SO ?4雙水相體系相似，但是花色苷含量最大值對(duì)應(yīng)的無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同，可能是因?yàn)榱姿岫溻c較硫酸銨更溶于水. 萃取時(shí)間在30～40 min含量幾乎沒有變化，但隨著萃取時(shí)間延長，40 min后花色苷含量有所下降，可能是因?yàn)檩腿r(shí)間延長伴隨超聲產(chǎn)生的機(jī)械能量破壞花色苷結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致花色苷降解，從而使花色苷含量降低.

3.2 黑果枸杞花色苷提取工藝優(yōu)化

3.2.1 超聲酶輔助提取工藝優(yōu)化 ?實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4，經(jīng)Design-Expert 8.0.6 軟件回 歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：花色苷含量（mg/g）= 13.22+0.29 A+ 0.21B+0.36C-0.11AB-0.055AC+0.027BC-0.67A ?2-0.45B ?2+0.000C ???2.由方程可知，表示方程所對(duì)應(yīng)的曲線是開口向下的拋物線，拋物線的最高點(diǎn)為花色苷含量最大值點(diǎn).各提取因素對(duì)花色苷提取含量的影響程度可以由此方程中各單項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小反映，值越大，影響程度越重要.各提取因素影響的重要程度為： C （乙醇濃度）> A （液料比）> B （提取時(shí)間）.

由表5可知，0.01< P <0.05代表模型差異顯著；失擬項(xiàng)（ P =0.3207>0.05）不顯著，表明模型能有效模擬實(shí)際情況；矯正 ?R ??2=0.8361 能夠說明83.61%花色苷含量的變化.一次項(xiàng) ?C 影響顯著，A、B 影響不顯著，交互項(xiàng)影響不顯著，二次項(xiàng) ?A ??2、 B ??2影響顯著.說明此法對(duì)花色苷提取含量影響最大的因素是乙醇濃度.

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件求解經(jīng)過優(yōu)化的回歸方程得出，當(dāng)提取溫度為45 ℃，纖維素酶添加量為1.0 mg/g時(shí)，超聲酶輔助提取黑果枸杞花色苷的最佳工藝條件為：液料比25.07 mL/g，提取時(shí)間30 min，乙醇濃度75%.修正條件為：液料比25 mL/g，提取時(shí)間30 min，乙醇濃度75%.在此條件下提取得到的花色苷含量為（17.92±0.02）mg/g，與預(yù)測(cè)值基本相近，說明此響應(yīng)面得出的最優(yōu)條件是可行的.

3.2.2 乙醇/硫酸銨雙水相萃取工藝優(yōu)化 ?實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6，經(jīng)Design-Expert 8.0.6 軟件回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：花色苷含量（mg/g）=15.51+0.31 A+0.091B-0.39C+0.94AB-0.49AC+0.34BC-1.03A 2-0.76B 2-0.83C 2.通過對(duì)A、B、C項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小比較，各提取因素影響的重要程度順序?yàn)椋篊（硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)）>A（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)）>B（萃取時(shí)間）.

由表7可知， P <0.01代表模型差異極顯著；0.01< P <0.05代表模型差異顯著；失擬項(xiàng)（ P =0.25>0.05）不顯著，表明模型能有效模擬實(shí)際情況；矯正 ?R ??2=0.9410 能夠說明94.1%花色苷含量的變化.一次項(xiàng) ?C影響極顯著，A影響顯著，B影響顯著，交互項(xiàng)影響中AB、AC極顯著，BC 顯著，二次項(xiàng) ?A ??2、 B ??2、 C ??2影響極顯著.在 EtOH/（NH ?4） ?2SO ?4雙水相萃取花色苷中，每個(gè)提取因素都對(duì)花色苷的提取含量有顯著影響.

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件求解經(jīng)過優(yōu)化的回歸方程得出，響應(yīng)面預(yù)測(cè)最佳方案為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.61% ，萃取時(shí)間35.92 min，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.72%，預(yù)測(cè)黑果枸杞花色苷的提取含量為15.62 mg/g.根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件修正方案為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25% ，萃取時(shí)間36 min，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%，在此條件下得到的花色苷含量為（15.46±0.31） mg/g，實(shí)際結(jié)果與預(yù)測(cè)值基本相符，說明了模型很好地預(yù)測(cè)了實(shí)際情況，響應(yīng)面得到的最優(yōu)條件是可行的.

3.2.3 乙醇/磷酸二氫鈉雙水相萃取工藝優(yōu)化 ?實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果如表8，經(jīng)Design-Expert 8.0.6 軟件回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：花色 苷含量（mg/g）=15+ 0.15A+0.58B+0.42C- 0.20AB-0.075AC+0.25C-0.65A ?2-0.93B ?2-0.72C ?2.通過對(duì)A、B、 C項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小比較，各因素影響的重要程度順序?yàn)椋築（萃取時(shí)間）＞ C（磷酸二氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)）＞A（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)）.

由表9可知，0.01＜ P ＜0.05代表模型差異顯著； P ＜0.01代表模型差異極顯著；失擬項(xiàng)（ P =0.0959>0.05）不顯著，表明模型能有效模擬實(shí)際情況；矯正 R ??2=0.9754 能夠說明97.54%花色苷含量的變化.在EtOH/NaH ?2PO ?4雙水相萃取花色苷中，每個(gè)提取因素都對(duì)花色苷的提取含量有顯著影響.應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件求解經(jīng)過優(yōu)化的回歸方程得出，最佳方案為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)24.08%，萃取時(shí)間為36.77 min，磷酸二氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.71%.為實(shí)驗(yàn)方便修正為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，萃取時(shí)間為37 min，磷酸二氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%，在此條件下提取花色苷含量為（15.02±0.19） mg/g，說明響應(yīng)面很好的預(yù)測(cè)了實(shí)際情況，得出的最優(yōu)條件是可行的.

3.3 黑果枸杞花色苷體外抗氧化活性結(jié)果

采用2.2.1所述方法，結(jié)果如圖2a、2b和2c所示，在6.25～200 μg/mL范圍內(nèi)，黑果枸杞花色苷LRN、LRP、LRE對(duì)DPPH自由基清除效果呈濃度依賴效應(yīng)，不同提取方法的清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋篖RN>LRP>LRE. 在6.25～200 μg/mL范圍內(nèi)，黑果枸杞花色苷LRN、LRP、LRE均濃度依賴性對(duì)ABTS有清除作用，不同提取方法的清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋篖RN>LRP>LRE.在6.25～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，黑果枸杞花色苷LRN、LRP、LRE均濃度依 賴性地反映了總還原能力的強(qiáng)弱，不同提取方法總還原能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋篖RN>LRP> LRE.采用斜率K值來反映不同花色苷樣品的總還原能力，斜率值越大，表明總還原能力越強(qiáng)，如表10所示. 不同花色苷樣品的IC ?50值見表10.

3.4 ?t -BHP誘導(dǎo)BRL 3A細(xì)胞損傷模型的建立

本實(shí)驗(yàn)采用不同處理濃度 t -BHP（200、300、400、500、600、700、800和900 μmol/L）處理2 h來建立BRL 3A細(xì)胞損傷模型，由圖3可知， ?t -BHP濃度為200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比顯著下降，為26%左右；確定本實(shí)驗(yàn)中 t -BHP 對(duì)BRL 3A細(xì)胞最佳損傷濃度和時(shí)間為200 μmol/L和2 h.

3.5 黑果枸杞花色苷對(duì)BRL 3A細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和保護(hù)作用

由圖4a和4b可知，在25～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，花色苷樣品對(duì)BRL 3A細(xì)胞基本無毒副作用，此濃度范圍可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究.由圖4c和4d可知， t -BHP損傷之后細(xì)胞存活率下降到44%，在10～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，LREA、LRNA、LRPA、LRE、LRN、LRP細(xì)胞存活率最高分別恢復(fù)到71%、78%、72%、46%、81%和51%.當(dāng)花色苷濃度小于60 μg/mL時(shí)，LREA、LRNA、LRPA、LRN對(duì)BRL 3A 細(xì)胞的保護(hù)作用均呈濃度依賴效應(yīng)，花色苷濃度為60 μg/mL時(shí)對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)效果最好.當(dāng)花色苷濃度大于60 μg/mL，LREA、

LRNA、LRPA、LRN花色苷對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果逐漸降低.LRE、LRP在10～100 μg/mL濃度范圍內(nèi) 沒有顯著細(xì)胞保護(hù)作用.綜上，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選用60 μg/mL繼續(xù)探究不同花色苷樣品的細(xì)胞保護(hù)作用.

3.6 ?黑果枸杞花色苷對(duì) t -BHP誘導(dǎo)損傷的BRL 3A細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除作用

利用 DCFH-DA 熒光探針，通過倒置熒光顯微鏡觀察ROS的生成，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi) ROS積累量呈現(xiàn)正相關(guān).由圖 5熒光圖以及流式量化結(jié)果分析可知，與對(duì)照組相比，模型組熒光強(qiáng)度顯著增加，而LRN、LRNA花色苷處理組細(xì)胞的活性氧積累量顯著降低，清除ROS效果優(yōu)于LRP、LRPA、LRE、LREA，說明 LRN、LRNA、LREA、LRPA 都能有效減緩 t -BHP誘導(dǎo)的BRL 3A 細(xì)胞內(nèi) ROS生成.流式結(jié)果圖5c表明LRN、LRNA清除 ROS效果較好，后續(xù)選擇LRN、LRNA進(jìn)行細(xì)胞膜損傷實(shí)驗(yàn)分析.

3.7 ?黑果枸杞花色苷對(duì) t -BHP誘導(dǎo)的BRL 3A 線粒體損傷的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)利用JC-10熒光探針，通過倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察線粒體的損傷程度.由圖6a可知模型組綠色熒光明顯，說明線粒體膜電位下降，細(xì)胞膜受損，加藥處理后可以觀察到綠色熒光顯著降低紅色熒光顯著增強(qiáng)，說明LRN、LRNA對(duì)線粒體具有保護(hù)作用，結(jié)合流式結(jié)果圖6b、6c可知LRN、LRNA對(duì) t -BHP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和線粒體損傷具有明顯的保護(hù)作用.

4 討 論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)不同提取方法進(jìn)行了工藝優(yōu)化，對(duì)比了不同方法提取得到的黑果枸杞花色苷的體外抗氧化活性.

傳統(tǒng)提取方法輔助手段單一且提取效率不高，本課題組采用超聲波與纖維素酶兩種手段輔助提取花色苷，得率更高.采用雙水相萃取，與傳統(tǒng)方法相比可以實(shí)現(xiàn)主要成分的純化，條件更加溫和，且不容易導(dǎo)致目的物質(zhì)變性 ?［15］.通過響應(yīng)面，優(yōu)化了提取工藝，從而獲得了黑果枸杞花色苷的最佳提取得率，為進(jìn)一步的工業(yè)提取提供了基礎(chǔ)資料.

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)（DPPH、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)、總還原力測(cè)定實(shí)驗(yàn)），可以直接反應(yīng)被檢測(cè)物質(zhì)的抗氧化活性，可以作為初步的 體外抗氧化活性篩選.經(jīng)過三種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究，不同提取方法取得的花色苷體外抗氧化能力強(qiáng)弱的順序?yàn)椋篖RN>LRP>LRE，說明雙水相萃取的花色苷活性更強(qiáng).

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，使用 ?t -BHP 建立了BRL 3A 細(xì)胞損傷模型，通過檢測(cè)細(xì)胞活力、ROS水平、細(xì)胞線粒體膜電位變化，探究不同花色苷樣品對(duì) t -BHP誘導(dǎo)的BRL 3A細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，不同方法提取的花色苷樣品均對(duì)BRL 3A細(xì)胞無毒性，甚至表現(xiàn)出了一定的增殖效果. LRE、LRP在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)、總還原力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了一定的抗氧化能力，但是體外抗氧化實(shí)驗(yàn)并不能完全模擬生物的體內(nèi)環(huán)境，所以在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證了抗氧化能力.在細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，未純化的LRE、LRP花色苷樣品沒有表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，但純化后的LRE、LRP對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用顯著提升，基本達(dá)到了和LRNA一樣的水平，可能是純化后生物活性成分純度增加，從而提升了其對(duì)BRL 3A的保護(hù)能力.根據(jù)細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出LRN、LRNA繼續(xù)進(jìn)行ROS和細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè).通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀定量分析結(jié)果表明LRN、LRNA可通過減少細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生及減少細(xì)胞膜損傷，緩解 t -BHP誘導(dǎo)的 BRL 3A細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷.

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子（Nrf2）通路是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激通路，在靜息狀態(tài)下，Nrf2維持在一個(gè)較低的水平，當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2磷酸化與Keap1解耦聯(lián)，迅速核轉(zhuǎn)位與下游的抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列下游抗氧化蛋白的表達(dá) ?［16］.在肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、上皮細(xì)胞和外周單核血細(xì)胞中，花色苷給藥降低了ROS的產(chǎn)生 ?［17］.在小鼠巨噬細(xì)胞中，富含花色苷的生物活性成分增加了Nrf2的表達(dá)，SOD、CAT、GR、GPx、GSH和HO-1表達(dá)也增加 ?［18］.在Tang等人 ?［19］的研究中枸杞花色苷可以保護(hù)H ?2O ?2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷，增強(qiáng)CAT，SOD和GSH-Px等抗氧化酶的表達(dá).因此，我們認(rèn)為黑果枸杞花色苷可能是通過Nrf2/ARE通路緩解 t -BHP誘導(dǎo)BRL 3A細(xì)胞的氧化損傷.

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了黑果枸杞提取工藝，比較了不同提取工藝的花色苷體外抗氧化活性，以及對(duì) t -BHP誘導(dǎo)的正常大鼠肝細(xì)胞BRL-3A細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為后續(xù)的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提供了重要的理論依據(jù).

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