王文潔，馬春玲，劉玉濤，張夢(mèng)夢(mèng)，吳玉軒，趙巧珍，胥鑫鈺

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；2.濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司，山東濟(jì)南 250115）

芝麻香型白酒采用高溫大曲與芝麻香專用曲混用，磚底泥窖發(fā)酵，分級(jí)摘酒，長(zhǎng)期貯藏，精心勾調(diào)。在釀造工藝上吸收了醬香型白酒“四高一長(zhǎng)”的特點(diǎn)，又加入各種有益微生物純培養(yǎng)相結(jié)合的工藝，進(jìn)一步豐富了芝麻香型白酒的典型風(fēng)格。

芝麻香型白酒制作流程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是高溫堆積發(fā)酵，酒醅的處理過(guò)程相當(dāng)于“二次制曲”。隨著生物堆積工藝的開(kāi)展，原料中的淀粉、蛋白質(zhì)和高分子等有機(jī)物在細(xì)菌、酵母菌、霉菌和各種酶的協(xié)同作用下，不斷地被分解成還原糖和游離態(tài)氨基酸，再進(jìn)行美拉德反應(yīng)得到各種香氣物質(zhì)或前體產(chǎn)物[1]。

本研究主要通過(guò)追蹤研究芝麻香高溫堆積和發(fā)酵過(guò)程中酒醅生理生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，運(yùn)用生物可培養(yǎng)技術(shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中酵母、細(xì)菌和霉菌的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)[2]，分析了芝麻香型白酒酒醅堆積過(guò)程和釀造機(jī)理,進(jìn)一步說(shuō)明了高溫堆積在芝麻香型白酒釀制過(guò)程中的重要意義，提供數(shù)據(jù)化的理論支撐,為酒醅入池后發(fā)酵過(guò)程奠定了良好的理論與物質(zhì)基礎(chǔ)，更好的指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

以濟(jì)南趵突泉釀酒有限公司芝麻香手工釀造車間為研究對(duì)象，對(duì)高溫堆積過(guò)程中的酒醅進(jìn)行分析。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

酵母菌培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、瓊脂20 g、水1000 mL，200 mg/mL 氯霉素3 mL，115 ℃濕熱滅菌30 min。

霉菌培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g。土豆去皮后稱重，切片煮沸至軟爛，紗布過(guò)濾后定容至1000 mL，3 mL 200 mg/mL 氯霉素，115 ℃濕熱滅菌30 min。

細(xì)菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，8 μg/mL 兩性霉素400 μL，115 ℃濕熱滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 堆積過(guò)程取樣時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)

預(yù)實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)堆積過(guò)程中不同時(shí)間段堆積酒醅溫度的變化情況，找到溫度變化明顯的時(shí)間段，設(shè)計(jì)取樣時(shí)間，在堆積的第0 h、8 h、16 h、20 h、24 h、32 h、40 h堆積結(jié)束[3]時(shí)取樣。

1.2.2 堆積發(fā)酵過(guò)程溫度的測(cè)定

實(shí)際堆積厚度為50 cm，實(shí)際堆積時(shí)間為40 h。測(cè)溫點(diǎn)部位分下層(距池底5 cm)、中層(距池底25 cm)、上層(距池底45 cm)，每層間隔放置三個(gè)測(cè)溫點(diǎn)，共9 個(gè)測(cè)溫點(diǎn)。固定溫度計(jì)從堆積開(kāi)始直至堆積結(jié)束，記錄測(cè)溫點(diǎn)溫度。

1.2.3 堆積過(guò)程取樣空間點(diǎn)設(shè)計(jì)

用酒醅采樣器分別于堆積上層、中層、下層均勻取樣，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，每次采樣分為上層、中層和下層三點(diǎn)：上層點(diǎn)（距地面35～45 cm）、中層點(diǎn)（距地面20～30 cm）、下層點(diǎn)(距地面5～15 cm)，在每層區(qū)域內(nèi)取6 個(gè)點(diǎn)樣混合均勻作為一個(gè)樣品。采集的樣品在無(wú)菌塑料袋中密封保存，于4 ℃保藏備用，盡快分析。

1.2.4 酒醅理化實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)酒醅的水分、酸度、還原糖、粗淀粉等理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法參考《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)》[4]。

1.2.5 不同稀釋梯度菌懸液的制備

于裝有225 mL 無(wú)菌水的三角瓶中稱取25 g 酒醅，置于搖床振蕩搖勻30 mim 制成菌懸液。分別于9 mL 無(wú)菌水試管中加入1 mL 菌懸液，稀釋一定的倍數(shù)，吸取100 μL 稀釋液于培養(yǎng)基中進(jìn)行計(jì)數(shù)，各3 個(gè)平行，用玻璃珠進(jìn)行涂布，酵母菌置于30 ℃、細(xì)菌置于37 ℃、霉菌置于45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，對(duì)微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆積過(guò)程中常規(guī)理化的變化

2.1.1 堆積過(guò)程中酒醅溫度的變化趨勢(shì)

由圖1 可知，堆積過(guò)程中物料的溫度呈整體上升趨勢(shì)，三層堆積起始溫度在25 ℃左右，結(jié)束溫度在50 ℃左右。上層堆積接觸環(huán)境與空氣，微生物生長(zhǎng)繁殖旺盛，升溫幅度大于中層與下層，在16 h與20 h 時(shí)變化最為明顯，這可能與微生物大量繁殖產(chǎn)熱有關(guān)。

圖1 堆積過(guò)程中酒醅溫度的變化

2.1.2 堆積過(guò)程中酒醅水分的變化趨勢(shì)

微生物正常的生長(zhǎng)代謝都離不開(kāi)水，水是構(gòu)成微生物細(xì)胞的主要成分之一，也是微生物進(jìn)行各種生命活動(dòng)的必要條件之一。由圖2 可知，堆積過(guò)程中水分變化并不明顯，含量基本穩(wěn)定在51 %～54%之間，整體呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)。下層酒醅由于直接接觸地面，水分不易揮發(fā)，水分含量高于中層和上層。上層和中層酒醅的水分含量在前20 h 整體呈降低的趨勢(shì)，可能是前期堆積升溫快水分揮發(fā)多，微生物生長(zhǎng)繁殖旺盛消耗水分多，在后20 h 水分呈上升趨勢(shì)，后期溫度變化幅度減小，微生物生長(zhǎng)代謝會(huì)產(chǎn)生部分水分。

圖2 堆積過(guò)程中酒醅水分的變化

2.1.3 堆積過(guò)程中酒醅酸度的變化趨勢(shì)

由圖3 可知，堆積過(guò)程中酒醅酸度整體呈增加的趨勢(shì)，上層與中層酒醅的酸度整體上高于下層酒醅[6]。堆積前期主要依靠霉菌產(chǎn)生的酸性蛋白酶有效分解堆積物料中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生各種氨基酸類物質(zhì)，使得堆積酒醅的酸度不斷上升。

圖3 堆積過(guò)程中酒醅酸度的變化

2.1.4 堆積過(guò)程中酒醅還原糖的變化趨勢(shì)

由圖4可知，堆積過(guò)程中酒醅還原糖在0～16 h增加，在20 h 左右被大量消耗，20 h 后又逐漸增加并趨于平穩(wěn)。酒醅中的還原糖以葡萄糖為主，占總糖量的60 %左右，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還有部分難以被微生物分解消耗的五碳糖，可以與各種氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生香氣成分。16～20 h微生物生長(zhǎng)旺盛消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多，還原糖總含量在20 h 達(dá)到最低點(diǎn)。堆積后期細(xì)菌、酵母菌生長(zhǎng)趨于平緩，霉菌大量凋亡，還原糖總量開(kāi)始增多并為后期入池發(fā)酵提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖4 堆積過(guò)程中酒醅還原糖的變化

2.1.5 堆積過(guò)程中酒醅淀粉的變化趨勢(shì)

由圖5 可知，堆積酒醅淀粉呈下降趨勢(shì)，上層與中層酒醅變化比下層明顯。隨著堆積時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物逐漸富集，蛋白酶與糖化酶的含量逐漸增加，將堆積中的物料逐漸分解，使淀粉類物質(zhì)釋放并分解成葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，表明了堆積過(guò)程是芝麻香型白酒釀造的物質(zhì)積累與準(zhǔn)備階段。

圖5 堆積過(guò)程中酒醅淀粉的變化

2.2 堆積過(guò)程中微生物菌群的變化

2.2.1 堆積過(guò)程中酵母菌總數(shù)的變化趨勢(shì)

酒醅樣品稀釋后涂布于YPD 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖6所示。

圖6 YPD培養(yǎng)基的酵母菌菌落形態(tài)

YPD培養(yǎng)基也適于霉菌的生長(zhǎng)，故平板上會(huì)同時(shí)出現(xiàn)酵母菌和少量的霉菌。霉菌的個(gè)頭大有絨毛，酵母菌個(gè)頭小且沒(méi)有絨毛。生長(zhǎng)的酵母菌呈乳白色不透明狀，一種表面光滑、濕潤(rùn)，均勻易挑起，一種表面帶有褶皺比較粗糙，氣味多帶有酒香味[7]。

樣品稀釋玻璃珠涂布培養(yǎng)2 d 后，得到堆積過(guò)程中酵母菌總數(shù)的變化規(guī)律如圖7所示。

圖7 堆積過(guò)程中酵母菌數(shù)量的變化

由圖7 可知，隨著堆積時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母菌總數(shù)也逐漸增多。上層與中層酒醅和環(huán)境與空氣的接觸面積大，故上層與中層酵母菌的數(shù)量與生長(zhǎng)速率大于下層。堆積結(jié)束時(shí)，酵母菌總數(shù)可達(dá)3×107～4×107個(gè)/g。在16～24 h，酵母菌生長(zhǎng)速率較快，24 h 后，由于堆積溫度的升高不易于酵母菌的生長(zhǎng)，故酵母菌生長(zhǎng)速率開(kāi)始減慢。

2.2.2 堆積過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)的變化趨勢(shì)

酒醅樣品稀釋后涂布于LB 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖8所示。

圖8 LB培養(yǎng)基的細(xì)菌菌落形態(tài)

生長(zhǎng)的細(xì)菌呈灰白色不透明，一種小而平坦且?guī)в胁灰?guī)則褶皺形狀，不易挑起，一種大而圓潤(rùn)中間有圓形凸起，都帶有一股使人不愉悅的臭味。樣品稀釋玻璃珠涂布培養(yǎng)2 d 后，得到堆積過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)的變化規(guī)律如圖9所示。

由圖9 可知，堆積過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)與酵母菌總數(shù)的變化趨勢(shì)相同，都呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。與酵母菌一樣，上層與中層酒醅中細(xì)菌數(shù)量比下層多。細(xì)菌從8 h 開(kāi)始快速增長(zhǎng)，到24 h 時(shí)生長(zhǎng)速率變緩。堆積結(jié)束時(shí)，細(xì)菌總數(shù)可達(dá)5×107～6×107個(gè)/g，細(xì)菌總數(shù)整體高于酵母菌，堆積后期溫度升高不利于酵母菌生長(zhǎng)，更利于一些嗜熱芽孢桿菌的生長(zhǎng)。

圖9 堆積過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量的變化

2.2.3 堆積過(guò)程中霉菌總數(shù)的變化趨勢(shì)

酒醅樣品稀釋后涂布于PDA 培養(yǎng)基，45 ℃培養(yǎng)48 h 后，培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖10 所示。生長(zhǎng)的霉菌形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀干燥，菌絲細(xì)長(zhǎng)，不透明呈白色絨毛狀，菌落和培養(yǎng)基間緊密連接，不易挑取。樣品稀釋玻璃珠涂布培養(yǎng)2 d 后，得到堆積過(guò)程中霉菌總數(shù)的變化規(guī)律如圖11所示。

圖10 PDA培養(yǎng)基的酵母菌菌落形態(tài)

由圖11 可知，堆積過(guò)程中霉菌數(shù)量變化不同于酵母菌與細(xì)菌，前20 h 霉菌數(shù)量迅速增多，在20 h 時(shí)達(dá)到最高約5×104個(gè)/g，數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于酵母菌與細(xì)菌，20～40 h 霉菌數(shù)量開(kāi)始大幅下降。霉菌屬于好氧菌，堆積前期屬于微氧環(huán)境宜于霉菌的生長(zhǎng)，上層與中層酒醅接觸空氣，霉菌數(shù)量多于下層酒醅。在堆積的后期，堆積內(nèi)部氧氣逐漸被消耗，不利于霉菌的生長(zhǎng)。

圖11 堆積過(guò)程中霉菌數(shù)量的變化

2.3 過(guò)程發(fā)酵中常規(guī)理化的變化

為探討堆積酒醅在窖池中的變化，對(duì)芝麻香入池后酒醅的理化指標(biāo)變化進(jìn)行了跟蹤分析，總體變化情況如圖12 所示。由圖12 可知，在發(fā)酵過(guò)程中，酒醅水分呈整體升高的趨勢(shì)，最后穩(wěn)定在54 %左右；淀粉含量在入池后迅速降低；還原糖含量整體呈降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵第10～35 天時(shí)變化明顯；酸度在發(fā)酵前期基本沒(méi)有變化，進(jìn)入第15 天時(shí)開(kāi)始上升，最后穩(wěn)定在6 %左右；酒精含量在入池后緩慢增加，最高達(dá)到3%vol～4%vol。

圖12 堆積酒醅入池發(fā)酵理化指標(biāo)的變化

3 結(jié)論

芝麻香高溫堆積過(guò)程在開(kāi)放的環(huán)境中網(wǎng)羅、富集各種微生物，微生物利用堆積酒醅中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖與代謝活動(dòng)；堆積溫度影響微生物的生長(zhǎng)代謝，微生物的代謝活動(dòng)同樣會(huì)產(chǎn)生一定的熱能。堆積過(guò)程中酒醅的酸度與還原糖含量呈增加的趨勢(shì)，淀粉含量一直在降低，水分變化不明顯，維持在一定的水平。上層與中層酒醅變化一致且顯著高于下層酒醅，與下層酒醅接觸地面，含氧量低，微生物代謝緩慢有關(guān)。通過(guò)可培養(yǎng)技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：堆積過(guò)程中酵母菌與細(xì)菌變化規(guī)律一致，呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，為后續(xù)入池發(fā)酵提供大量菌源；霉菌在20 h 左右隨氧氣的消耗逐漸死亡。芝麻香白酒的高溫堆積過(guò)程實(shí)際上是酒醅中的各種微生物利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)繁殖代謝，產(chǎn)生各種生香前體物質(zhì)的過(guò)程?？刂坪枚逊e時(shí)間、溫度和水分對(duì)芝麻香型白酒釀制過(guò)程有重要意義，為酒醅入池后發(fā)酵過(guò)程奠定良好的理論與物質(zhì)基礎(chǔ),可以更好的指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)。