徐亞英，李志敏

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室, 上海 200237）

釀酒酵母是衣康酸生物合成的細胞工廠之一[1-2]。廉價易得的葡萄糖是衣康酸生產(chǎn)的主要碳源，但是釀酒酵母的葡萄糖效應是衣康酸生產(chǎn)的限制因素，不能進入三羧酸循環(huán)（TCA）途徑的丙酮酸溢流使得培養(yǎng)基中積累乙醇和甘油，而TCA 途徑和乙醛酸途徑提供衣康酸合成的重要前體檸檬酸，在葡萄糖利用階段被抑制[3-5]。有研究證明釀酒酵母的溢流現(xiàn)象是由于葡萄糖效應限制了呼吸能力，即葡萄糖效應使得酵母線粒體無力消化糖酵解途徑（EMP）快速積累的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），利用NADH 氧化酶（NOX）和可替代氧化酶（AOX1）可以減弱葡萄糖效應[6-7]和降低NADH 水平，從而減少了甘油和乙醇產(chǎn)量。但是在恒化培養(yǎng)條件下，葡萄糖仍然處于限制狀態(tài)，因此需要了解分批培養(yǎng)高糖情況下NADH水平的擾動對釀酒酵母葡萄糖效應的影響。

釀酒酵母胞質中過量的NADH 一般會先被NADH脫氫酶NDE1 和NDE2 氧化，超出其氧化能力的NADH會被3-磷酸甘油脫氫酶(GPD)氧化[8-9]。GPD 催化NADH 依賴的磷酸二羥丙酮 (DHAP) 轉化為 3-磷酸甘油，后者通過DL-3-磷酸甘油進一步轉化為甘油[10-12]。兩種同工酶 GPD1p 和 GPD2p 產(chǎn)生GPD 活性，GPD1p的表達受高滲透壓甘油反應途徑的調節(jié)，而 GPD2p的表達隨著對胞質NADH 再氧化需要的增加而增加[10,13]。本文嘗試利用不同拷貝質粒表達nox基因來減少甘油的積累，并且替換了釀酒酵母的gpd2基因，利用啟動子Pgpd2控制nox基因 (來自Streptococcus pneumoniae)的表達[14-15]。理論上當胞質NADH 過量時啟動子Pgpd2會上調nox的基因表達，以氧化胞質過量的NADH，避免碳源損失到甘油。另一方面，葡萄糖生產(chǎn)的丙酮酸大部分無法進入TCA 循環(huán)，導致其經(jīng)丙酮酸脫羧酶(PDC)和乙醛脫氫酶(ALD)反應形成乙醛和乙醇。為減少葡萄糖生產(chǎn)衣康酸過程中乙醇副產(chǎn)物的積累，本文還在高、低拷貝質粒中外源表達了來自H.capsulatum的替代氧化酶AOX1(GenBank AF133236 )[16]，并利用釀酒酵母線粒體定位信號與AOX1 融合表達，以減少AOX1 對胞質NADH氧化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質粒 背景菌株是釀酒酵母BY4741（下文簡稱BY4741），質粒構建實驗在大腸桿菌中進行，利用DH5a作為感受態(tài)，pRS415、pRS413、pRS423、pRS425 作為穿梭質粒。本文所用的菌株和質粒分別詳見表1、表2。

表2 本文所使用的質粒Table 2 Plasmids used in this paper

1.1.2試劑 DNA 聚合酶購自寶（大連）生物工程有限公司；限制性內切酶購自NEB(北京)有限公司；酵母基因組提取試劑盒和大腸桿菌質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；無縫克隆試劑盒購自漢恒生物科技（上海）有限公司；MitoTracker?GreenFM線粒體綠色熒光探針購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；序列測定由上海派森諾生物科技有限公司完成。酵母提取物（YeastExtract）購自安琪酵母股份有限公司；蛋白胨（Peptone)、無氨基酵母氮源(YNB)培養(yǎng)基購自生工生物工程（上海）股份有限公司；葡萄糖和培養(yǎng)基用無機鹽購自國藥集團化學試劑有限公司；各種氨基酸購自上海麥克林生化科技有限公司。文中所用試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基 大腸桿菌種子培養(yǎng)基（g/L）：LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(酵母提取物5、蛋白胨10 和NaCl10)，用于大腸桿菌的生長，固體培養(yǎng)基則還需要添加瓊脂粉1.5～1.6g/L；轉化子篩選時需要添加氨芐青霉素至質量濃度100μg/mL。釀酒酵母種子培養(yǎng)基（g/L）：YPD（YeastExtractPeptoneDextroseMedium）培養(yǎng)基（酵母提取物10、蛋白胨20 和葡萄糖20），固體培養(yǎng)基則還需要添加瓊脂粉2g/L，利用CRISPR/Cas9 技術進行基因整合時還需要添加諾爾絲菌素和潮霉素分別至質量濃度100μg/mL 和500μg/mL。釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，YNB1.7，(NH4)2SO45，氨基酸缺失補充劑dropout等[17]。葡萄糖單獨滅菌，滅菌條件：115℃，30min。YNB（Yeast NitrogenBase）、(NH4)2SO4 和dropout 等配制成10×母液，0.22μm 無菌薄膜濾菌器過濾除菌。

1.1.4引物 文中所用引物詳見表3。

表3 本文所使用的引物Table 3 Primers used in this paper

1.2 實驗方法

1.2.1質粒構建和基因整合nox，mCherry基因為本實驗室所有，aox1基因由金唯智公司合成，本文中使用的所有啟動子和終止子都從釀酒酵母S288C 基因組擴增得到，aac2、bcs1p基因擴增自釀酒酵母S288C 基因組。本文中質粒大都使用無縫克隆試劑盒構建，以質粒pRS413-PGPD2-nox-TCYC1的構建為例：其以釀酒酵母S288C 基因組為模板擴增得到PGPD2啟動子（引物zw-1F，zw-1R 擴展）和TCYC1（引物zw-3F，zw-3R 擴展），以肺炎鏈球菌基因組為模板擴增得到基因nox（引物zw-2F，zw-2R），限制性內切酶BamHI酶切質粒pRS413 得到線性化載體，無縫克隆酶一步連接后鈣轉涂板，對菌落進行PCR 得到陽性轉化子。本文利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術進行了基因整合實驗，以GPD2△::nox為例：以pHYB 為模板，用引物zw-23F 和zw-23R 擴增得到線性化載

體，DpnI 內切酶酶切后鈣轉涂板，對菌落進行PCR 得到陽性轉化子pHYB-sggpd2；以目的基因nox為模板，引物zw-24F 和zw-24R 擴增得到Donor DNA，將質粒pHYB-sggpd2和Donor DNA LiAC 轉化進已經(jīng)含有質粒pCAS9-NAT 的酵母菌，再進行菌落PCR 驗證，消質粒后得到陽性菌。

1.2.2重組菌的培養(yǎng) 將LEU 營養(yǎng)缺陷型的YSC（YeastSyntheticCompleteMedium）平板上的重組菌XYY21-XYY31、Z1 和Z2 接種到YSC-LEU 培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)20～24h，將活化后的種子液接種到酵母發(fā)酵培養(yǎng)基(含20g/L的葡萄糖)中，初始OD600值為0.1，在30℃、220r/min搖床中培養(yǎng)120h，每12～24h取樣，搖瓶培養(yǎng)基裝液量為50mL，為了增加搖瓶中的氧濃度，后期搖瓶培養(yǎng)基裝液量為30mL。將YSC 平板上的重組菌L1～L3 和A1～A7 分別接種到YSC-LEU和YSC-HIS 培養(yǎng)基，將活化后的種子液接種到酵母發(fā)酵培養(yǎng)基(含20g/L的葡萄糖)中，初始OD600值為0.1，在30℃、220r/min 搖床中培養(yǎng)72h，14～20h取樣，染色后采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.3分析方法 通過測量600nm處的吸光度來監(jiān)測細胞生長。甘油、乙醇和衣康酸的濃度通過高效液相色譜儀（HPLC）分析，使用aminexHPX-87H離子色譜柱（Bio-Rad，Hercules，USA）、折光率檢測器（RID-10A，ShimadzuCorporation，Kyoto，Japan）、UV檢測器（SPD-10A，Shimadzu Corporation）和LC Solutions系統(tǒng)（ShimadzuCorporation）。流動相是流速為0.5mL/min的5mmol/LH2SO4 溶液。HPLC柱在 30 ℃ 下操作。

1.2.4熒光顯微鏡 A1～A7 和L1～L3 酵母細胞在搖瓶中培養(yǎng)14～20h 時取樣，離心收集細胞，去除上清，再用磷酸鹽緩沖液（PBS）或者培養(yǎng)基YSC 沖洗1 次；用30℃預熱的PBS 緩沖液或者用培養(yǎng)基YSC 將細胞稀釋至OD600值為0.1（1×106cells/mL），加入MitoTracker?GreenFM線粒體綠色熒光探針使其終濃度為400nmol/L，在30℃、220r/min避光條件下孵育50min；染色完成后低速離心收集細胞，加入300μL PBS 緩沖液沖洗菌體；離心收集菌體，加入100μL PBS 緩沖液重懸菌體用于激光共聚焦顯微鏡觀察。與MitoTracker?GreenFM線粒體綠色熒光探針不同的是，DAPI(4,6-Diamidino-2-phenylindole)孵育15min，在緩沖液中終質量濃度0.1μg/mL，其他條件相同。

2 結果與分析

2.1 NADH 氧化酶NOX 對葡萄糖效應中甘油合成的影響

為利用NADH 氧化酶NOX 減少釀酒酵母生產(chǎn)甘油，本文構建了高低拷貝的nox基因表達載體（高拷貝表達載體PRS423-PGPD2-nox-TCYCI，低拷貝表達載體PRS413-PGPD2-nox-TCYCI來）減少胞質過量的NADH。搖瓶培養(yǎng)結果表明（圖1（a）），利用低拷貝質粒過表達nox基因時，24 h 葡萄糖全部消耗，培養(yǎng)基中甘油和乙醇的積累沒有受到明顯影響，24 h時菌株XYY23（含低拷貝表達質粒）的甘油質量濃度達到1.17 g/L，比對照菌株（XYY21（含低拷貝表達質粒），1.39 g/L）減少了15.83%，衣康酸滴度比對照菌株也有一些減少。利用高拷貝質粒表達nox（nox過表達菌株（XYY24））在24 h 生產(chǎn)甘油0.74 g/L，比對照菌（XYY22，1.32g/L）減少43.94%，且0～120 h時乙醇、乙酸、衣康酸濃度和酵母生長都沒有受到明顯影響。

圖1 利用NADH 氧化酶NOX 減少甘油生產(chǎn)Fig.1 Reducing glycerol production with NADH oxidase NOX

利用CRISPR/CAS9 基因編輯技術將PGPD-cadATCYC1整合到釀酒酵母基因組的HO 位點，nox基因直接替換釀酒酵母的gpd2基因。搖瓶實驗結果顯示基因nox替換gpd2成功減少了甘油的碳通量，培養(yǎng)基中的甘油積累從0.88 g/L 減少至0.49 g/L。菌株生長和乙醇產(chǎn)生沒有受到明顯影響，但是整合菌株Z2 的衣康酸產(chǎn)量比XYY24降低（圖1（b））。

2.2 釀酒酵母表達外源替代氧化酶AOX1

本文構建了高、低拷貝的aox1基因表達載體并通過搖瓶實驗嘗試其干擾乙醇生產(chǎn)的效果，搖瓶培養(yǎng)結果顯示低拷貝載體表達aox1（XYY25）對代謝沒有明顯影響，而高拷貝表達aox1的酵母菌XYY26 在葡萄糖初始質量濃度20 g/LYSC 培養(yǎng)基中的乙醇生產(chǎn)沒有減少，而是形成與XYY24 相似的效果，培養(yǎng)基中甘油質量濃度由1.39 g/L 減少到0.91 g/L，減少了34.53%（圖2），與已有研究結果不同[6]。文獻報道NOX 定位在酵母細胞質[6]，AOX1 定位在釀酒酵母的線粒體[15]，我們猜測菌株XYY26 中的AOX1 蛋白在胞質有殘留，所以形成與PGPD2-nox表達菌XYY24 相似的效果。為了驗證我們的猜測，本文利用熒光蛋白和熒光探針共定位實驗來觀察NOX 和AOX1 在釀酒酵母中的定位。通過激光共聚焦顯微鏡觀察（圖3），發(fā)現(xiàn)nox在啟動子PGPD2控制下成功表達并且定位在釀酒酵母細胞質,而AOX1 主要集中在釀酒酵母的線粒體，但胞質也有一些熒光殘留，這可能是因為AOX1定位到線粒體的過程中在胞質中殘留的原因，或者線粒體負載AOX1 過量的原因。

圖2 利用替代氧化酶AOX1 減少乙醇生產(chǎn)Fig.2 Reducing ethanol production by overexpressing an alternative oxidase AOX1

圖3 NOX(a)和AOX1(b)在釀酒酵母中的定位Fig.3 Location of NOX(a) and AOX1(b) in Saccharomyces cerevisiae

2.3 替代氧化酶AOX1 強化定位線粒體的作用

為了使AOX1 更好地集中定位到釀酒酵母的線粒體內膜中，減少其對甘油生產(chǎn)的影響，本文找到了定位在線粒體內膜且面向線粒體膜間空間的蛋白PET9/AAC2 和面向線粒體基質的內膜蛋白BCS1 的前導序列蛋白BCS1p，作為將AOX1 定位至線粒體內膜的定位信號[19]。AAC2 是線粒體內膜的主要ADP/ATP載體，其主要作用是用胞質ADP 交換線粒體合成的ATP，但在某些條件下，如好氧指數(shù)生長在葡萄糖培養(yǎng)基中時，其作用方向相反。BCS1 是復合物 III 組裝所需的蛋白質轉位酶和分子伴侶，AAA ATPase 家族的成員。從激光共聚焦實驗結果來看，AAC2 和BCS1p 都具有良好的線粒體定位效果（圖4）。

圖4 利用線粒體定位信號將替代氧化酶AOX1 定位至線粒體Fig.4 Further location of AOX1 in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae with mitochondrial localization signals

AAC2-AOX1 和BCS1p-AOX1 融合蛋白的搖瓶培養(yǎng)結果表明，24 h 時融合蛋白搖瓶培養(yǎng)的甘油產(chǎn)量相比AOX1 表達菌株沒有受到影響，乙醇、檸檬酸、丙酮酸的質量濃度沒有明顯變化，36～72 h范圍內衣康酸生產(chǎn)速度加快（圖5），所以認為在AOX1的N 端添加線粒體內膜定位信號有助于減少AOX1 胞質定位，以減弱其對胞質NADH 的影響。但是在初始葡萄糖質量濃度20 g/L 的YSC 培養(yǎng)基中，aox1表達菌株依然受葡萄糖效應影響從而產(chǎn)生大量乙醇，即沒能減緩高濃度初始葡萄糖培養(yǎng)基導致的葡萄糖效應。有趣的是，bcs1p-aox1的表達能夠增加乙醇利用階段衣康酸的產(chǎn)量，這可能是因為bcs1p-aox1增加了線粒體NADH 的代謝速度，部分解除了葡萄糖效應對衣康酸合成路徑基因表達的抑制作用。

圖5 AOX1 線粒體定位提高衣康酸滴度Fig.5 Mitochondrial localization of AOX1 increases the titer of itaconic acid

3 討 論

利用釀酒酵母合成衣康酸面臨著葡萄糖效應限制的問題，本文探討了不同強度表達外源胞質NADH氧化酶NOX 和線粒體可替代氧化酶AOX1 對釀酒酵母分批發(fā)酵葡萄糖效應的影響。通過利用CRISPR/Cas9 將釀酒酵母的3-磷酸甘油脫氫酶GPD2替換為NADH 氧化酶NOX，減少了葡萄糖效應導致的甘油碳代謝流的增加。在aox1基因過表達菌株的搖瓶實驗中，發(fā)現(xiàn)aox1基因過表達菌株沒有減少乙醇的得率，反而會干擾胞質甘油的形成。所以本文利用線粒體內膜定位信號AOX1 融合蛋白為AAC2-AOX1 和BCS1p-AOX1，將AOX1 進一步定位至線粒體，減少了AOX1 對胞質NADH 氧化的影響，雖然沒有改善葡萄糖效應副產(chǎn)物乙醇的積累，但是增加了發(fā)酵培養(yǎng)36 h 之后產(chǎn)生的衣康酸的質量濃度，120 h時衣康酸質量濃度增加至116.98 mg/L。本文結果表明表達外源NADH 氧化酶NOX 和可替代氧化酶AOX1 在高糖培養(yǎng)基分批發(fā)酵過程中對葡萄糖效應的影響，這有助于進一步提高釀酒酵母工程菌利用葡萄糖生產(chǎn)TCA 循環(huán)衍生物，但是需要進一步研究如何減少葡萄糖效應副產(chǎn)的乙醇積累問題。

全基因組復制事件是引起葡萄糖效應的主要驅動力，包括13 種糖酵解酶中的6 種重復酶和己糖轉運體數(shù)量的增加，這導致糖酵解通量增加[20-22]，而細胞的蛋白質含量有限，可以分配給新陳代謝的蛋白質組的比例受到限制，所以糖酵解通量的增加和相關蛋白水平的提高是以犧牲呼吸系統(tǒng)蛋白為代價的，糖酵解途徑積累的NADH 只能通過快速生成副產(chǎn)物乙醇和甘油后再循環(huán)。調控細胞質和線粒體的NADH水平能夠在一定程度上減輕葡萄糖效應的影響，但是在分批培養(yǎng)過程中該方法并不能從根本上解決葡萄糖效應，這可能是因為葡萄糖運輸是糖酵解的主要通量控制步驟，是影響葡萄糖效應的主要因素之一[21]。NOX 和AOX 表達菌株在分批培養(yǎng)中，從結果上能減少葡萄糖效應形成的NADH，但是高葡萄糖運輸這一主要因素不能控制，所以發(fā)酵途徑的蛋白翻譯不受影響，仍然有乙醇生產(chǎn)。葡萄糖效應以犧牲其他蛋白的比例來增加糖酵解酶的現(xiàn)象，使得控制糖酵解通量應該是解決葡萄糖效應的重要策略，有文獻通過降低PYK 酶活性就達到了很好的葡萄糖效應抑制結果[23-24]，但是大都以犧牲釀酒酵母生長為代價。