陳 聰,劉玉虎,王 磊

1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院(安徽省宿州市立醫(yī)院)藥劑科, 宿州 234000;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,蚌埠 233030

度米芬是一種陽離子表面活性劑型廣譜殺菌劑,具有廣泛的抗菌譜及抗菌活性,對革蘭陽性和陰性菌及真菌均有較好的殺滅作用[1],主要用于創(chuàng)面、黏膜、皮膚[2]、器械的消毒,亦可用于口腔、咽喉感染的輔助治療[3]。度米芬現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典》二部[4],為白色至微黃色片狀結(jié)晶,化學(xué)名為溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十二烷銨一水合物,易溶于乙醇和水,目前市售制劑有度米芬滴丸和度米芬含片,臨床應(yīng)用較為廣泛。度米芬現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅用滴定法對其所含非季銨類物質(zhì)進(jìn)行測定,該方法操作復(fù)雜,誤差較大,相關(guān)的文獻(xiàn)也僅限于對度米芬含量進(jìn)行檢測[5-7],未檢索到對該制劑有關(guān)物質(zhì)研究的相關(guān)報道。該產(chǎn)品及其制劑的用藥安全性存在一定風(fēng)險[8]。本研究結(jié)合度米芬原料藥生產(chǎn)工藝,確定度米芬原料主要雜質(zhì)為苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨,結(jié)構(gòu)式見圖1。其中苯酚毒性較大,各行各業(yè)對其檢測方法也在積極探索中[9-16],主要方法以HPLC[17-19]為主。本文用HPLC法對上述4種雜質(zhì)進(jìn)行檢測,建立度米芬有關(guān)物質(zhì)檢測方法,為控制該產(chǎn)品的質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

圖1 各成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Scientific U3000液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];Mettler Toledo XS205DU電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司];PHS-3W型pH計(jì)(上海班特儀器制造有限公司)。

1.2 試藥

對照品:度米芬(批號100455-202002,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%)、苯酚(批號100509-202005,質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%)來源于中國食品藥品檢定研究院;N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺(批號13468-02-5,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)來源于上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司;溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨(批號202005907,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨(批號20200819,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)由實(shí)驗(yàn)室自制。度米芬原料(批號:20201225、20210317、20210601)來源于重慶青陽藥業(yè)有限公司;乙腈為色譜純;其他為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

用Agilent 5TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;以乙腈為流動相A、0.03 mol·L-1磷酸二氫鈉+0.01 mol·L-1十二烷基硫酸鈉(磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)為流動相B,流速為1.0 mL·min-1,進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長為220 nm;進(jìn)樣量為20 μL;柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

2.2.1稀釋劑 取乙腈和水各適量,搖勻,制成乙腈-水(50∶50)的溶液作為稀釋劑。

2.2.2對照品儲備液 精密稱取苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨對照品各適量,用稀釋劑溶解并稀釋成每1 mL中含上述成分各0.1 mg的雜質(zhì)混合對照品儲備液。精密稱取度米芬對照品適量,用稀釋劑溶解并稀釋成5 mg·mL-1的度米芬對照品儲備液。

2.2.3雜質(zhì)混合對照品溶液 精密吸取2.2.2項(xiàng)下雜質(zhì)混合對照品儲備液適量,用稀釋劑稀釋成每1 mL中含上述成分各2 μg的雜質(zhì)混合對照品溶液。

2.2.4系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)溶液 精密吸取2.2.2項(xiàng)下度米芬對照品儲備液4.0 mL、雜質(zhì)混合對照品儲備液0.2 mL置于同一10 mL量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,制成系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)溶液。

2.2.5供試品溶液 精密稱取度米芬原料藥適量,用稀釋劑溶解并稀釋成2 mg·mL-1的供試品溶液。

2.2.6自身對照溶液 精密吸取2.2.5項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL置于100 mL量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,制成自身對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.2.4項(xiàng)下系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)溶液20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,進(jìn)行系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn),記錄色譜圖,見圖1。雜質(zhì)苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨與度米芬色譜峰以及各雜質(zhì)間色譜峰分離度均不低于1.5。理論板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均大于10 000。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)

取2.2.5項(xiàng)下供試品溶液作為未破壞供試品溶液;精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的鹽酸溶液(1.0 mol·L-1),于80 ℃水浴中加熱30 min,取出,冷卻至室溫,加入1.0 mL的氫氧化鈉溶液(1.0 mol·L-1)中和,用稀釋劑定容至刻度,搖勻,作為酸破壞供試品溶液。精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的氫氧化鈉溶液(1.0 mol·L-1),于80 ℃水浴中加熱30 min,取出,冷卻至室溫,加入1.0 mL的鹽酸溶液(1.0 mol·L-1)中和,用稀釋劑定容至刻度,搖勻,作為堿破壞供試品溶液。精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入稀釋劑5.0 mL溶解,于80 ℃水浴中加熱8 h,取出,冷卻至室溫,用稀釋劑定容至刻度,搖勻,作為熱破壞供試品溶液。精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入1.0 mL的過氧化氫溶液(體積分?jǐn)?shù)為3%),于80 ℃水浴中加熱30 min,取出,冷卻至室溫,作為氧化破壞供試品溶液。精密稱取度米芬原料藥20 mg置于10 mL量瓶中,加入稀釋劑5.0 mL溶解,于4 500±500 lx條件下連續(xù)光照7 d,取出,冷卻至室溫,用稀釋劑定容至刻度,搖勻,作為光照破壞供試品溶液。

精密吸取上述溶液和空白溶液(稀釋劑)各20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,記錄色譜圖。見圖2。結(jié)果空白溶液對供試品溶液的測定無干擾,酸、堿、高溫、氧化和光照等破壞供試品溶液降解雜質(zhì)峰與度米芬主峰間分離度均大于1.5,主峰純度因子均大于970,物料平衡符合《中國藥典》規(guī)定要求。表明所建立的方法專屬性良好。

注:1.苯酚;2.N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺;3.未知雜質(zhì);4.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨;5.度米芬;6.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨;7.未知雜質(zhì)。

注:A.空白溶液;B.未破壞供試品溶液;C.酸破壞供試品溶液;D.堿破壞供試品溶液;E.高溫破壞供試品溶液;F.氧化破壞供試品溶液;G.光照破壞供試品溶液;1.苯酚;2.N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺;3.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨;4.度米芬;5.溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨。

2.5 線性范圍考察實(shí)驗(yàn)

取苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨對照品各適量,用稀釋劑溶解并稀釋,制成質(zhì)量濃度分別為5.22、4.62、4.96、4.34 μg·mL-1的混合溶液,分別精密吸取上述混合溶液0.1、0.5、2.0、5.0、10.0 mL,置于5個25 mL量瓶中,制成系列線性混合對照品溶液。精密吸取上述5種溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,將峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 檢測限和定量限實(shí)驗(yàn)

取2.5項(xiàng)下混合溶液用稀釋劑逐級稀釋,并精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀中檢測,信噪比S/N約為10時的質(zhì)量濃度作為定量限,信噪比S/N約為3時的質(zhì)量濃度作為檢測限,計(jì)算各成分的檢測限和定量限,結(jié)果苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨的檢測限分別為6.13、4.79、5.26、3.94 ng·mL-1,定量限分別為18.19、12.38、15.34、13.81 ng·mL-1。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.2.2項(xiàng)下雜質(zhì)混合對照品儲備液(苯酚0.105 4 mg·mL-1、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺0.098 6 mg·mL-1、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨0.101 8 mg·mL-1、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨0.094 6 mg·mL-1)1 mL,用稀釋劑稀釋至10 mL,制成加樣雜質(zhì)混合對照品儲備液,備用。精密稱取同一批次已知雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.0164%、0.0073%,苯酚和N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺均未檢出]的度米芬原料藥12份,每份20 mg,各置于10 mL量瓶中,隨機(jī)分成4組,精密加入上述加樣雜質(zhì)混合對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6 mL,按2.2.5項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備,精密吸取上述溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,計(jì)算各成分加樣回收率及RSD值。苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨的平均回收率分別為99.74%、100.08%、99.19%、98.79%,RSD分別為0.56%、1.12%、0.91%、1.42%。

2.8 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按2.2.5項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液,于0、2、5、9、16、24 h依法進(jìn)樣檢測,結(jié)果供試品溶液中度米芬峰面積RSD值分別為0.37%,總雜質(zhì)無明顯增加;按2.2.3項(xiàng)下方法制備雜質(zhì)混合對照品溶液,于0、2、5、9、16、24 h依法進(jìn)樣檢測,結(jié)果雜質(zhì)混合對照品溶液中苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨峰面積RSD值分別為0.11%、0.49%、0.37%、0.24%。表明該溶液在室溫條件下穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取度米芬原料藥20 mg,置于10 mL量瓶中,精密加入2.2.2項(xiàng)下雜質(zhì)混合對照品儲備液0.2 mL,再按照2.2.5項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成供試品溶液,平行制備6份,各精密吸取上述溶液20 μL,注入高效液相色譜儀中檢測,結(jié)果苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨含量的RSD值分別為0.81%、0.97%、1.24%、0.65%,表明方法的重復(fù)性良好。

2.10 中間精密度實(shí)驗(yàn)

按照2.9項(xiàng)下溶液制備方法制備供試品溶液,分別考察不同分析實(shí)驗(yàn)員、實(shí)驗(yàn)日期和實(shí)驗(yàn)儀器對精密度的影響。結(jié)果在不同分析實(shí)驗(yàn)員條件下苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨RSD值(n=12)分別為2.18%、1.46%、0.98%、1.73%;在不同實(shí)驗(yàn)日期條件下各成分RSD值(n=12)分別為1.57%、0.98%、0.76%、1.41%;在不同儀器條件下各成分RSD值(n=12)分別為1.88%、1.27%、0.81%、2.34%。所得RSD值均小于10%,表明方法的中間精密度良好。

2.11 耐用性實(shí)驗(yàn)

為確保所建立的方法能夠適用于常規(guī)檢驗(yàn),取2.9項(xiàng)下制備的供試品溶液,分別考察流動相A(±2.0%)、流速(±0.1 mL·min-1)、色譜柱(Agilent 5TC C18、Waters Nova-Pak C18、Dikma Spursil C18)、柱溫(±5 ℃)對雜質(zhì)苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨檢驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果待測雜質(zhì)與相鄰色譜峰均能達(dá)到有效分離,方法耐用性良好。

2.12 樣品測定

取度米芬原料藥3批,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測,記錄雜質(zhì)苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨色譜峰面積并計(jì)算各雜質(zhì)成分含量,結(jié)果見表3。

表3 3批原料樣品測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)在確定檢測波長時,用DAD檢測器對度米芬對照品溶液及苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨對照品溶液進(jìn)行了紫外掃描,發(fā)現(xiàn)度米芬和各雜質(zhì)對照品的最大吸收波長均是220 nm,遂用220 nm作為檢測波長運(yùn)行梯度洗脫程序,可保證檢測雜質(zhì)含量的準(zhǔn)確度。

3.2 柱溫的選擇

在考察色譜條件時,考慮到流動相中緩沖鹽濃度較高,溫度高可降低色譜柱使用壓力,延長色譜柱使用壽命,對柱溫進(jìn)行了考察,在30、35、40、45、50 ℃條件下進(jìn)樣度米芬供試品溶液,發(fā)現(xiàn)在柱溫為40 ℃時,柱效最好,雜質(zhì)最少,同時基線最為平穩(wěn)。最終確定柱溫為40 ℃。

本研究根據(jù)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[20]對度米芬原料中的苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨的含量進(jìn)行了方法學(xué)考察,建立了度米芬原料中有關(guān)物質(zhì)苯酚、N,N-二甲基-2-苯氧基乙胺、溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十烷銨和溴化N,N-二甲基-N-(2-苯氧乙基)-1-十四烷銨同時測定的HPLC法,該方法靈敏度高,專屬性強(qiáng),可用于度米芬原料有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。