魏 娜，張方，李街青，陳佳玲，史建強(qiáng)*，陳嶸祎*（.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東廣州 5009；.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江 5400）

淋病是由淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，Ng）感染引起的性傳播疾病[1]，該菌感染常引起模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）激活。PRRs 包括Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）、C型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLR）、RIG-I樣受體（RIG-I-like receptors，RLRs）、NOD 樣受體（NOD-like receptors，NLRs）、AIM2 樣受體（Aim2-like receptors，ALRs），可識(shí)別入侵微生物表達(dá)的病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）及組織損傷釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs）。其中TLRs、NLRs 在細(xì)菌感染中研究較多，而NLRP3 是屬于NOD 樣受體的一種，細(xì)菌感染可激活宿主免疫細(xì)胞NLRP3 來上調(diào)IL-1β 以抵抗感染。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究Ng 的感染條件與宿主引起免疫應(yīng)答對該病致病機(jī)制研究非常關(guān)鍵，然而Ng 體外感染單核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最佳活菌含量罕見報(bào)道，本文通過研究Ng 定量方法以及不同含量Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3 表達(dá)的影響，為后續(xù)體外Ng 感染免疫實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 致病菌和C57/BL6J 小鼠 淋病奈瑟菌菌株，購于上海宜醇化工有限公司，菌種編號(hào)19424；C57/BL6J 小鼠，購于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要儀器與試劑 SW-CJ-2FD 型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo SCIENTIFIC），高速低溫臺(tái)式離心機(jī)（美國Thermo），VininTM7 Dx Real-Time PCR 儀（美國Life），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），分光光度計(jì)（德國Eppendorf），電泳槽（美國Thermo），轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-Rad），Azure C500 多功能分子成像分析儀（美國Thermo），小鼠單個(gè)核細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），淋病奈瑟菌選擇培養(yǎng)基（江門凱林公司），澳洲源胎牛血清（美國Gibco），RPMI 1640 完全培養(yǎng)基、PBS 緩沖液（美國Gibco），Trizol（美國Ambion），qRT-PCR 試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMII 試劑盒（日本TaKaRa），RIPA 裂解液（10×）、蛋白酶/ 磷酸酶抑制劑cocktail（100×）、兔抗GAPDH抗體、兔抗IL-1β 抗體、抗兔IgG、HRP-linked 抗體（美國Cell Signaling Technology），兔抗NLRP3 抗體（英國Abcam），紅細(xì)胞裂解液（1×）、NuPAGE TM10% Bis-Tris Gel 膠、MES-SDS Running Buffer（20×）（美國Invitrogen），immobilon Western HRP 底物（美國Millipore）、Braford 蛋白濃度測定試劑盒（去垢劑兼容型）（中國碧云天有限公司），TBS 干粉（中國博士德生物有限公司），70 μm 孔徑尼龍細(xì)胞篩（美國Corning），脂多糖LPS（美國Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 菌液OD 值測定 將Ng 接種于Ng 選擇培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液中制成細(xì)菌懸液。以未加菌的培養(yǎng)液為空白對照液調(diào)零，波長450 nm 測量OD 值，選取OD 值在0.6～1.0 之間的菌液進(jìn)行1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0梯度稀釋，并測量其OD450值。

1.2.2 菌落平板計(jì)數(shù) 將按1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0 梯度稀釋的各組菌液進(jìn)行10、102……10n倍比稀釋，吸取1 mL 稀釋后的菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。選取培養(yǎng)基上菌落數(shù)為30～300 個(gè)對應(yīng)的稀釋倍數(shù)為最佳稀釋倍數(shù)，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)10n，為1 mL 菌液中的活菌數(shù)（CEU/mL），即菌液中Ng 活菌的含量。

1.2.3 回歸方程計(jì)算 以菌落數(shù)為y值，菌液OD450值為x 值，計(jì)算相關(guān)回歸方程。

1.2.4 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞獲取 于超凈工作臺(tái)中無菌操作取出C57/BL6J 小鼠脾臟，以PBS 漂洗2 次后，以磨砂玻片輕輕研磨，用細(xì)胞篩過濾獲得懸濁液4 mL。將此懸濁液移至已盛有單個(gè)核細(xì)胞分離液的離心管中，懸濁液與單個(gè)核細(xì)胞分離液體積之比為1∶4，以500×g 離心30 min，分4 層，取上數(shù)第2 層，即單個(gè)核細(xì)胞層。加入適量PBS 液漂洗1 次，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，吹打混勻2 min，再加入PBS 漂洗1次即可獲得高純度的單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.5 RT-qPCR 檢測單個(gè)核細(xì)胞中 IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)水平 將OD450值為0.2、0.6、1.0、1.4 的Ng 懸液與單個(gè)核細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)1、2、6、12 h，此為實(shí)驗(yàn)組；設(shè)置不加入Ng 的空白對照組計(jì)OD450值為0。培養(yǎng)結(jié)束后，采用梯度離心去除Ng，收集單個(gè)核細(xì)胞。運(yùn)用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR Green 核酸染料為熒光探針，用Real-time PCR檢測細(xì)胞IL-1β、NLRP3 的mRNA 表達(dá)。選取上調(diào)IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)量最高的 OD450值的Ng 懸液與單個(gè)核細(xì)胞置于含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，并設(shè)立脂多糖LPS 單陽性對照組，在培養(yǎng)0、1、2、6、12、24 h 后分別收集單個(gè)核細(xì)胞，并采用梯度離心去除Ng。同樣運(yùn)用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以SYBR Green 核酸染料為熒光探針，用Real-time PCR 檢測細(xì)胞IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)量。每個(gè)樣品均設(shè)置3 個(gè)復(fù)管，重復(fù)試驗(yàn)3 次。分別測定對照組和試驗(yàn)組目的基因與內(nèi)參基因的Ct 值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其均值，采用2—△△CT法對各組基因 mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)，序列如下：IL-1β-F：5’CTGCTGGTGTGTGACGTTC C3’IL-1β-R：5’ATATGGGTCCGACAGCACGA3’；NLRP3-F：5’TGCACACAGTGGTGTTCCAG3’NL RP3-R：5’TCACCTCTCGGCAGTGGATA3’；GAP DH-F：5’TGCACCACCAACTGCTTAG3’GAPDH-R：5’GGATGCAGGGATGATGTTC3’。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測 IL-1β、NLRP3 表達(dá) 選取上調(diào)IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)水平最高的OD450值的Ng 懸液與單個(gè)核細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，并設(shè)立脂多糖LPS 單陽性對照組，在培養(yǎng)0、1、2、6、12、24 h 后分別收集單個(gè)核細(xì)胞，并采用梯度離心去除Ng。收集細(xì)胞懸液，通過裂解、離心留取上清作為樣品，使用Bradford 蛋白測定法檢測總蛋白濃度。等量蛋白質(zhì)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5% BSA 的TBST 封閉液室溫緩慢搖動(dòng)60 min。TBST 液快速洗滌5 min，重復(fù)3 次。加入一抗（工作液濃度為1∶1 000）室溫?fù)u床孵育2 h，4 ℃過夜，洗膜，孵育二抗，洗膜，顯影。結(jié)果分析：以GAPDH 為內(nèi)參，比較目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以x-±s表示，使用單因素方差分析及q檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立NgOD450 值（x）-活菌數(shù)（y）回歸方程

經(jīng)過計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)目，選擇最佳稀釋倍數(shù)為106，計(jì)數(shù)此稀釋倍數(shù)下不同OD 值菌液接種于固體培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，計(jì)算OD 值與活菌數(shù)的回歸方程（表1）。

表1 Ng 菌落平板計(jì)數(shù)

2.2 不同含量Ng 懸液感染單個(gè)核細(xì)胞對IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相對定量分析顯示，將菌液OD450值為0 的空白對照組IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)量設(shè)為1，實(shí)驗(yàn)組IL-1β、NLRP3 mRNA 相對表達(dá)量隨Ng 含量升高出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，菌液OD 值為0.2 的實(shí)驗(yàn)組IL-1β mRNA 相對表達(dá)量最高（P<0.01），見表2。OD 值為0.2 的實(shí)驗(yàn)組NLRP3 mRNA 相對表達(dá)量也最高（P<0.01），見表3。

表2 不同含量Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞中IL-1β 的mRNA 水平（，n=9）

表2 不同含量Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞中IL-1β 的mRNA 水平（，n=9）

在相同時(shí)點(diǎn)：與A 組比較，aP<0.01；與B 組比較，bP<0.01

表3 不同含量Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

表3 不同含量Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

在相同時(shí)點(diǎn)：與A 組比較，aP<0.01；與B 組比較，bP<0.01

2.3 Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的IL-1β、NLRP3表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 相對定量分析顯示，將培養(yǎng)時(shí)間為0 h 的IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)量設(shè)為1，余時(shí)間點(diǎn)的IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在培養(yǎng)1 h 后，IL-1β、NLRP3 mRNA 相對表達(dá)量最高（P<0.01），見表4；Western Blot 結(jié)果顯示相同的變化趨勢（圖1）。單陽性對照組的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果提示IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在培養(yǎng)1 h 后，IL-1β、NLRP3 mRNA相對表達(dá)量最高（P<0.01），見表5；Western Blot 結(jié)果顯示LPS 可上調(diào)IL-1β 分泌，隨著時(shí)間推移沒有出現(xiàn)降低趨勢，NLRP3 隨著時(shí)間推移出表達(dá)量有所降低（圖2），推測與蛋白翻譯滯后于mRNA 轉(zhuǎn)錄且NLRP3 是IL-1β 上游蛋白有關(guān)。

圖1 Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞不同時(shí)間后單個(gè)核細(xì)胞中IL-1β、NLRP3 水平

圖2 LPS 單陽性對照組中IL-1β、NLRP3 水平

表4 Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞不同時(shí)間后 IL-1β、NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

表4 Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞不同時(shí)間后 IL-1β、NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

在同組中：與0 h 比較，aP<0.01；與1 h 比較，bP<0.01

表5 LPS 單陽性對照組中IL-1β、NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

表5 LPS 單陽性對照組中IL-1β、NLRP3 的mRNA 水平（，n=9）

在同組中：與0 h 比較，aP<0.01，bP<0.05；與1 h 比較，cP<0.01

3 討論

淋病由Ng 感染所致，是第二常見的細(xì)菌性性傳播疾病[2]。既往認(rèn)為大多數(shù)淋球菌性泌尿生殖道感染的男性患者大多數(shù)是有癥狀的，而女性患者大多數(shù)為無癥狀感染[3-4]。然而有研究表明，Ng 的無癥狀感染在男、女性中均常見[5-6]。女性無癥狀淋病患者易延誤就醫(yī)，常繼發(fā)輸卵管炎、盆腔炎、不育甚至播散性淋病，并增加HIV 感染及傳播的概率[7]。迄今，無癥狀淋病的病因尚未完全闡明，且目前淋病的治療主要依賴注射用頭孢曲松，缺乏推薦使用的高質(zhì)量抗菌藥物，Ng 逐漸形成抗生素耐藥，使得淋病的治療具有挑戰(zhàn)性和高度可變性[8]。由于受Ng 現(xiàn)有組織培養(yǎng)和動(dòng)物模型系統(tǒng)的限制，Ng 賴以增殖復(fù)制的微環(huán)境的許多生態(tài)位未知[9]。因此，開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究針對Ng 與宿主相關(guān)免疫應(yīng)答機(jī)制具有一定的意義，然而尚無文獻(xiàn)為體外Ng 感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供細(xì)菌含量和感染時(shí)間的參考依據(jù)。單個(gè)核細(xì)胞的分離技術(shù)便捷，使其成為眾多免疫感染實(shí)驗(yàn)初步研究對象，本實(shí)驗(yàn)以小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，研究Ng 對IL-1β、NLRP3 基因表達(dá)的影響，以期為后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)中選擇Ng 懸液含量和時(shí)間提供參考。

比濁計(jì)數(shù)是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測定細(xì)菌的數(shù)量，細(xì)菌懸浮液的含量在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比。因此，可用分光光度計(jì)測定菌液，用光密度（OD 值）表示樣品菌液含量。有研究者對采用紫外—可見分光光度法測定對細(xì)菌含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，在一定范圍內(nèi)吸光度與細(xì)菌含量呈良好的線性關(guān)系[10-12]。但是比濁法只能測定相對細(xì)菌含量，不能得到確切活菌數(shù)值。本次試驗(yàn)中，采用比濁法結(jié)合菌落平板計(jì)數(shù)法，測定一系列已知OD 值的菌懸液中活細(xì)菌數(shù)，作出光密度—活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步彌補(bǔ)比濁法計(jì)數(shù)的缺點(diǎn)，得到簡便快速細(xì)菌計(jì)數(shù)的方法，制備一系列不同含量的Ng 菌液。

Ng 有粘附宿主黏膜的特性，感染人類泌尿生殖道，主要引起局部黏膜固有免疫反應(yīng)，并且可以反復(fù)感染，而不產(chǎn)生免疫記憶[9]。Ng 還能釋放肽聚糖片段、外膜囊泡（membrane vesicles，OMVs）和脂寡糖（lipo-oligosaccharide，LOS），從而激活TLRs、NLRs，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等[13]。IL-1β 是一種高效的促炎細(xì)胞因子，對宿主防御感染和損傷至關(guān)重要。無癥狀的淋病患者宮頸分泌的IL-1β 比有癥狀的患者要少得多[14]。NLRs 是一種細(xì)胞內(nèi)固有免疫受體，可識(shí)別和觸發(fā)細(xì)菌感染的炎癥[15]，而炎癥是一種限制微生物感染的保護(hù)過程。NLRP3炎癥小體是細(xì)胞溶質(zhì)多蛋白復(fù)合物，由傳感蛋白NLRP3、接頭蛋白-凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）組成，充當(dāng)著固有免疫系統(tǒng)傳感器[16]。NLRP3 可以被多種激活物激活包括ATP、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、尼日利亞菌素（nigericin）[17]。Ng 可激活NLRP3 炎癥小體，被觸發(fā)后，炎癥小體通過激活Casp-1 切割I(lǐng)L-1β 前體、IL-18 前體，產(chǎn)生成熟IL-1β、IL-18，并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡（pyroptosis）[18]。有研究表明，黃體酮可抑制NF-κ B 信號(hào)通路并下調(diào)ROS，抑制Ng 誘導(dǎo)的NLRP3 的激活和IL-1β 的形成[19]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測被不同含量Ng 感染的單個(gè)核細(xì)胞中IL-1β、NLRP3 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在菌液OD450值為0.2，即活菌數(shù)為2.69×107 CFU/mL 時(shí)，單個(gè)核細(xì)胞IL-1β、NLRP3 mRNA 表達(dá)水平最高，可以推測在此含量下，單個(gè)核細(xì)胞對Ng 引起免疫應(yīng)答效應(yīng)較大，可以將此細(xì)菌含量進(jìn)行后續(xù)體外針對Ng 免疫應(yīng)答實(shí)驗(yàn)。將Ng（OD450值=0.2）與單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)時(shí)間培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在1 h 后，單個(gè)核細(xì)胞IL-1β、NLRP3 基因相對表達(dá)量最高，推測在Ng 感染1 h 后單個(gè)核細(xì)胞的免疫效應(yīng)較大。本研究為日后Ng 感染單核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供了可靠的活菌定量方法，為Ng 感染單個(gè)核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)菌含量和感染時(shí)間的參考依據(jù)，我們研究還發(fā)現(xiàn)LPS 刺激單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)IL-1β、NLRP3 比較穩(wěn)定，24 h 兩者仍表達(dá)較高，但活菌實(shí)驗(yàn)12 h 后IL-1β、NLRP3 表達(dá)下降，考慮是活菌實(shí)驗(yàn)時(shí)單核細(xì)胞殺滅Ng 后炎癥因子表達(dá)下降所致。筆者認(rèn)為活菌實(shí)驗(yàn)?zāi)芨媚M感染過程，更有利于觀察單核細(xì)胞抗Ng 感染動(dòng)態(tài)過程，研究者應(yīng)考慮不同需求選擇不同的實(shí)驗(yàn)方法。